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문제 정의
- 본 연구에서는 이러한 양^장 환경의 특성을 염두에 두고 넙치의 일반적인 적수온으로 알려진 범위 내에서의 급격한 수온 변화가 사육중인 닙치의 생체 방어력에 미치는 영향을 다양한 생체 방어능의 지표 인자를 측정함으로써 밝히고자 하였다.
제안 방법
- 넙치 macrophage의 CLresponse실험은 Stave et a1(1983)의 방법을 변형하여 실시하였다. 즉, 1 x106ceHs/㎖ 의 농도로 조정된 macrophage를 polyprophylene tube에 400 ㎕씩 분주한 다음 실 험에 사용하였으며 luminol은 Scott and Klesius(l981)의 방법에 따라 준비하였다 400㎕의 세포와 700㎕의 lumin이 working solution을 10 분간 반응시킨 후 준비 한 zymosan solution 300 ㎕를 첨가하여 luminometerfLKB 1251, BioOrbit) 로 측정하였다.
- 수온은 냉각기(삼성. AS-518)와 가온용 전기 heater를 사용하여 매일 기의 상승과 하강을 반복하는 방버으로 변화를 주었다. 즉.
- 시료로 사용할 macrophage의 준비에서 식세포의 분리는 활성 산소 측정에서와 동일한 방법 으로 시행하였다
- 식균능의 실험에는 실험어의 wholebkxxi룰 사용하였으며 실힘어의 미병부로부터 heparin(Sigma Co.)이 처리된 주사기로 어체당 0.5㎖ 씩 채혈하였다. 채혐한 혈액은 siliconized tube에 넣고 100 mg/㎖의 농도로 준비된 FKC 30㎕를 첨가하였다 20℃로 유지된 water balh에서 0.
- 식세포의 할성 산소 변화를 측정하기 위하여 가능한 한 넙치의 순환 혈액을 제거한 후 복부를 절개하여 신장을 무균적으로 절취하였다. 이 시료를 2% fetal bovine serum(FBSt Sigma Chemical Co.
- 즉. 실험구는 18°C로 유지된 수온을 12시간 이내에 25°C까기 상승시킨 후 이를 다시 12시간 이내에 18°C로 하강시키는 방법으로 수온 자극을 주었으며 30 일간의 실험 기간 동안 매일 반복하였다. 대조 구의 수온은 실험 기간 동안 18°C로 일정하게 유지하였다
- 실험에 사용된 닙치는(0,1,2,3,5,7,14,21 및 28일에 실험구와 대조구에서 각각 3~5마리씩 무작위로 채포하여 아미노안식향산 에틸로 마취시킨 다음 각각의 실험에 사용하였다.
- 7 g, 평균 전장 l&3cm이었다. 온도 변화에 대한 실험은 크게 두 가지로 나누어 시행하였다. 하나는 온도 자극에 대한 면역반응의 지표를 조사하기 위한 것이고.
- 실험 도중에 빌싱하는 실험어의 폐사 현상 은 일간폐사량과 누적폐사율로써 나타내었다. 즉, 각각 45마리씩 수용된 실험구와 대조구에서 출현하는 폐사 개체는 매일 조사하였으며. 측정기간은 온도 변화를 주기 시작한 후 30일 간 이었다.
- 5㎖ 씩 채혈하였다. 채혐한 혈액은 siliconized tube에 넣고 100 mg/㎖의 농도로 준비된 FKC 30㎕를 첨가하였다 20℃로 유지된 water balh에서 0.5,3 및 6 시간 동안 반옹시킨 후 각 반응 시간 별로 시료를 채취하여 slide glass에 도말한 다옴 May-Grunwald Giemsa 연색팁으로 염색하고 검경하였다.
- 나머지 하나는 안정실험구로서 온도 자극이 시험어의 생존에 미치는 영향을 알아보기 위한 것이다 전자의 실험에는 각각 2조씩의 실험구와 대조구를 두고 각 실험구에 45마리의 넙치를 수용하였으며 FRP 수조(350 ( )를 사용하였다. 후자의 실험구는 별도로 설치한 실험구인 수온 자극 실험구와 대조구에 대해서는 실험 기간 동안의 폐사어 발 생 등 여러 가지 상태 변화블 관찰하였다 실험 어는 실험용 수조에서 1주일간 순치한 후 사용 하였으며, 모든 실험은 3회 반복하였다. 그리고 실험어에 대해 수온 변화 외의 다른 stress 요인을 줄이기 위하여 실험 기간 동안 먹이를 공급 하지 않았다.
대상 데이터
- 하나는 온도 자극에 대한 면역반응의 지표를 조사하기 위한 것이고. 나머지 하나는 안정실험구로서 온도 자극이 시험어의 생존에 미치는 영향을 알아보기 위한 것이다 전자의 실험에는 각각 2조씩의 실험구와 대조구를 두고 각 실험구에 45마리의 넙치를 수용하였으며 FRP 수조(350 ( )를 사용하였다. 후자의 실험구는 별도로 설치한 실험구인 수온 자극 실험구와 대조구에 대해서는 실험 기간 동안의 폐사어 발 생 등 여러 가지 상태 변화블 관찰하였다 실험 어는 실험용 수조에서 1주일간 순치한 후 사용 하였으며, 모든 실험은 3회 반복하였다.
- 분리된 백혈구층을 2%FBS가 첨가된 L-15 medium으로 3희 세척한 후 1 X 106cells/㎖의 농도로 실험용 세포 현탁액을 준비하였다. 이것을 96 well tissue culhire plale의 각 well에 각각 100㎕씩 분주한 다옴 18°C 에서 2시간 동안 부착시 켰다.
- 식세포의 식균능을 측정하기 위한 실헌 FKC 균액은 escherichia coli ATCC 25922 균주를 이용하여 제작하였다. 간략하게 설명하면.
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실험어와 실험구
실험어로 사용된 넙치는 경북 포항 소재 양어장으로부터 구하였으며, 실험어의 크기는 평균 체중 60.7 g, 평균 전장 l&3cm이었다. 온도 변화에 대한 실험은 크게 두 가지로 나누어 시행하였다.
- 식세포의 할성 산소 변화를 측정하기 위하여 가능한 한 넙치의 순환 혈액을 제거한 후 복부를 절개하여 신장을 무균적으로 절취하였다. 이 시료를 2% fetal bovine serum(FBSt Sigma Chemical Co.), penicillin/streptomycin액 (Sigma Chemical Co,) 100 units/㎖ 및 heparin 10 units/㎖가 함유된 Leibovits 15(L 15) culture medium 1㎖ 를 분주해 둔 1회용 소헝petridish에 닣고 시료를 잘게 분쇄 한 후 nylon membrane을 통과시켜 세포 현탁액을 준비하였다. 이 현탁액으로부터 SamaiemandFigueras(]995)에 따라 백혈구 층을 분리하였다.
데이터처리
- 05)은 Student's f-testS 검정하였다. 다만 말초 혈액 중의 백혈구 수에 대한 통계학적 유의성은 paired Student's r test로 검정 하역 대조구에 대한 F value로 나타내었으며. P<0.
- 대조구와 실험구 사이의 통계학석 유의성(PM 0.05)은 Student's f-testS 검정하였다. 다만 말초 혈액 중의 백혈구 수에 대한 통계학적 유의성은 paired Student's r test로 검정 하역 대조구에 대한 F value로 나타내었으며.
이론/모형
- NBT 환원능 실험은 장과 김(1996)의 방빕에 따랐다 blank는 zymosan이 첨가되지 않은 NBT 용액으로 처리된 식세포의 흠광도 값을 사용하였다.
- 말초혈익증 백혈구수의 변화를 측징하기 위하여 마취제로 마취시킨 실험어의 미병부로부터 채혈하었다 채혈한 혈액은 May-Grunwald Giemsa 임색법으로 염색한 다옴 현미경 관찰법으로 적혈구 5,000 세포 당 호중구, 림프구 및 진구를 계수하였다
- 실험어의 체표 점액 및 혈청 중의 lysozyme 용균능온 각각 Takahashi a 1986)의 방법을 사용한 김(1992)의 빙법과 Ellis(1990)의 turbidimetricassay법을 이용하여 측정하였다
- 자극몰로는 Whyte et al. (1989)의 방법에 따라 opsonized zymosan을 준비하였다. zyinosan(Sigma Chemical Co.
- 자극물의 조제는 Secombes(1990)의 방법에 따라 실시하였다. 제삭된 zymosan pellet을 10㎖의 넙치 혈청에 넣고 25°C에서 30분간 opsonin화하였다.
- 넙치 macrophage의 CLresponse실험은 Stave et a1(1983)의 방법을 변형하여 실시하였다. 즉, 1 x106ceHs/㎖ 의 농도로 조정된 macrophage를 polyprophylene tube에 400 ㎕씩 분주한 다음 실 험에 사용하였으며 luminol은 Scott and Klesius(l981)의 방법에 따라 준비하였다 400㎕의 세포와 700㎕의 lumin이 working solution을 10 분간 반응시킨 후 준비 한 zymosan solution 300 ㎕를 첨가하여 luminometerfLKB 1251, BioOrbit) 로 측정하였다. 측정 시간은 50분간이었으며 각 시료에 대한 peak 값과 평균값을 구하였다.
성능/효과
- CL 반응의 최대값(Fig. 4, A)은 실험 기간 동안 불규칙직으로 변동하고 있지만 수온 자극 후 5일쌔까지는 실험구의 CL값이 대조구에 비하여 현지하게 낮은 것으로 나타났으며 이 기간 동안에 나타나는 대조구와 실험구의 CL값은 유의적인 차이가 인정되었다(PK0.05).
- 식세포의 능력을 측정하는 방빕으로 NBT의 환원량을 조사하는데 이 방빕온 미생물 살해기전 역할을 하는 세포 내 6의 양을 측정하는 방 법이다. 수온 변화 시간 경과에 따른 NBT 환원량은 실험구와 대조구에서 유의성 있는 차이를 나타내지 않았다.
- 수온 변화의 지속 일수에 따론 림프구의 변화에서 대조구는 2일째에 가장 높은 51.77 세포가 관찰되었으며 14일째에 가장 낮온 16.67 세포가 관찰되었다. 실험구에서는 림프구의 수가 12.
- 2(A와 B)에 나타내었다. 수온 자극 3일 및 14일 째의 식균을온 대조구 보다 실험구에서 높게 나타났다 수온 변화 3일째 대조구의 식균율은 0.5 시간째에 24.4%로 실험구 보다 높았으나 시간의 경과에 따라서 감소하는 경향을 보였다. 실 험구의 식균율은 Q5시간째에 0% 이었으나 3시 간째까지 급격하게 증가하여 약 80.
- 수온 자극 시간 경과에 따른 백헐구수의 변화 조사에서 호중구는 실험구가 대조구 보다 다소 높은 출현율을 보였으나 림프구는 대조구에 비하여 실험구가 현저하게 감소된 것으로 나타났 다. EHsMseTandClem(1986)은 channel catfish를 수송하면 18시간 후 leucocytes가 감소하게 되는 데 림프구는 감소하지만 호중구는 증가한다고 한 것과 같이 stress를 받은 어류의 초기 반응으로 나타나는 현상이라 생각된다.
- 식균을과 식균지수에 대한 영향 시험에서 수온 자극을 준 실험구의 식균율과 식균지수가 식작용 시험 반응 시간 동안 높게 나타났다. 하지만 실험 초기의 생체 방어에서는 대조구의 식세포가 더욱 적극적으로 식작용에 관여한다는 사실이 관찰되었다.
- 식균지수 또한 식균율의 변화와 비숫한 경향을 보였는데, 3일째와 14일째의 실힘구는3시간 째에 가장 높은 식균지수를 나타내었으며, 대조 구는 0.5시간째 이후 감소하몄다가 다시 6시간 째에 증가하는 경향을 보였다.
- 4%로 실험구 보다 높았으나 시간의 경과에 따라서 감소하는 경향을 보였다. 실 험구의 식균율은 Q5시간째에 0% 이었으나 3시 간째까지 급격하게 증가하여 약 80.6%를 나타 낸 후 6시간째에 감소하는 경향을 나타내었으며, 식작용 실험 시작 후 3시간째에는 대조구에 비하여 유의적 차이를 나타내었다(PM0.05). 수온 자극을 시작한지 14일째 대조구의 식균율은 0.
- 실험 기간 농안 체표 점액의 lysozyme 용균능 (Fig.5, A)은 실험구와 대조구 사이에 유의적 차이가 있었으며 특히 수온 자극 후 1일 및 7일째에는 PKO05에서 유의성 차이가 관찰되었다. 또한 실험 전 기간을 통하여 대조구의 lysozyme 용균능은 실험구에 비하여 높은 상태코 유지되고 있었다
- 022). 실험 기간 동안에 실험구의 최대 및 최소 호중구 수는 각각 10.85 세포와3.20 세포이었으며 대조구는 각각 6.69 세포와 2.69 세포로 나타나 수온 자극울 받은 실험어의 순환 혈중 호중구 수가 높은 상태로 유지되었다
- 온도 변화 경과 일수에 따른 활성 산소의 환원능을 조사한 결과는 Fig 3에 나타내었다. 실험구 및 데조구의 값 모두 3일이나 7일째까지 증가한 후 서서히 감소되는 경향을 나타내었다 그러나, 실험구의 활성 산소 환원능이 수온 자극 후 3일째까지는 대조구에 비하여 낮은 수치를 높여 이 기간 동안 식세포의 활성이 저하되는 것으로 나타났다 실험구는 7일째에 촤대값을 나타내며 대조구는 3일째에 최대값을 나타 내었으나,95% 신뢰구간에서 실험 기간 동안 유의적 차이를 나타내지 않았다.
- 67 세포가 관찰되었다. 실험구에서는 림프구의 수가 12.56-31.58 세포로 나타나서 대조구에 비하어 순환 혈충 림프구의 수가 상대적으로 낮은 상태로 유지되었다.
- 0°C)에서 200g/E 의 밀도로 수용하면 12시 간째부터 펴］사가 발생히기 시작하여 72시간째 누적폐사을이 100%가 되며, 저온(75C)에서도 12시간 및 24시간째에 약20%의 폐사가 일어난다고 하였다. 이러한 현상이 발생하는 이유가 본 실험의 온도 자극과는 다르지만, 장기간 동안 동일한 형태의 자극이 지속되면 폐사가 중지 되는 것으로 나타나서 어떤 StRSS가 양식 어류에 미치는 pattern은 비슷하며 또한 어느 정도 자극의 수준이 반복되면 직응 가능성을 시사하고 있는 것으로 생각된다 다만 이번 실험의 수온 변화 범위가 18~25℃로 넙치의 적정 사육 온도에 속하는 점(김, 1993)을 감안한다면, 이 수온 범위를 벗어난 보다 고수온 영역에서의 변화는 양식 어류에 대한 더 많은 피해를 유발할 가능성이 있는 것으로 사료된다.
- 지속적인 수온 변동이 넙치의 생존에 미치는 영향을 알아본 안정실험구 실험에서 실험 개시 1주일 이내에 대조구에서는 폐사가 없었으나 실험구에서는 이미 2일째부터 폐사가 발생하였으며, 실험종료시까지의 누적폐사율은 대조구의 44%에 비하여 실험구는 22.2%로서 큰 차이를 나타내었다. Barton and Schreck(1987)은 chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) 치어를 고온 (21.
- 7%이었으며, 이후 시간의 경과에 따라서 약간 감소하였다가 6시간째 증가하는 경향을 보였다. 한편, 실험구의 식균을은 0.5 시간째에 5.0%이었으며 3시간째에 급격하게 증가하여 약 78.1 %를 나타낸 후 6시간째에 감소하는 경향을 나타내었으며, 실험 시작 후 3시간 째에는 대조구에 비하여 유의적 차이를 나타내 었다(PM0.05).
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