선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- (Jung, 1998). 그러나 지금까지의 연구에서는 감염세포 내에서 어느 정도의 바이러스단백질이 발현되는가 하는 정량적인 검토는 행하지 않았다 본 연구에서는 감염성이 다른 6종류의 세포에 있어서의 MABV의 고분자 합성 과증식 과정을 분자 레벨에서 조사함에의하여 잠복 감염기구를 밝히는 것을 목적으로 하여 MABV Y-6를 이용하여 CHSE-214, RTG-2, RSBK-2, EPC, FHM 및 BF-2의 6종류의 세포에서 10대 계대했을 때의 바이러스 항원의 발현. 정량, 바이러스 입자의 관찰을 행했다
- 본 연구는 해양버나바이 러스 (Marine bir- navirus, MABV) 가 이 바이러스에 감수성이 약한 세포 내에서 잠복 감염을 일으키는 메카니즘을 밝히기 위해 행했다. MABV는 CHSE-214, RTG-2와 RSBK-2세포내에서 전형적인 세포 변 성 효과 (CPE)를 나타내며 높은 역가를 나타내지만 EPC, FHM과 BF-2세포에서는 CPE가 나타나지 않았다.
- 본 연구에서는 MABV에 대해 감수성이 다른 세포 내에서 계대를 계속함으로써 일어나는 바이러스의 적응 현상과 잠복 감염의 메카니즘을 밝히는 것을 목적으로 고분자 합성과 바이러스 증식을 분자 레벨에서 조사하여 비교하였다 이를 위하여 MABV Y-6를 6종류의 어류 유래의 주화세포에 감염시켜 계대 10대째의 바이러스 항 원의 발현, 정량 및 전자현미경 관찰에의한 바 이러스입자의 관찰을 행했다.
제안 방법
- peroxidase 반응기 질 액을 각 well에 100 以넣어 37℃에서 10분간 반응시켰다. 1NH2SO4로 반응을 정지시킨 후, microtiter reader MPR A4i (Tosoh)로 492 nm 에서 흡광도를 측정하였다 또한, 1차 항체로 MABV Y-6의 주요 capsid protein 인 VP2에 대한 항체(항VP2항체)로 동일한 실험을 행했다. 그 후단백질 농도를 modified Bradford 법 (Read and Northcote, 1981)으로 구하여, ELISA의 결과를 각 감염세포 단백 1 mg당의 흡광도치를 계산하여 Duncan법에의해 유의 차 검정을 행했다
- 그 후 5%의 skim milk로 30분간 blocking하여 PBS로 3회 세정하였다. 1차 항체로는 MABV Y-6 바이러스입자를 정제하여 제작한 토끼 혈청을 500배 희석하여 사용하였으며 반응 후 PBS로 3회 세정하였다. 다음에 각 well에 2차 항체로서 5000배 희석한 peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG(Dako)를 50 以를 넣어 37℃에서 1시간 배양했다.
- 이 이되도록 바이러스 액을 접종하였다.EPC, FHM 및 BF-2 세포에 있어서는 바이러스의 역가가 IbTCIDWml 이하로 m.o.i를 0.01로 맞출 수 있을 만큼의 자손바이러스가 복제되지 않았으므로 감염 40시간 후에 배양 상층액 1 ml를 새로운 배양세포에 접종하여 계대하였다. 회수한 바이러스액은 -80℃에서 보존하였다.
- 감염세포 내의 성숙바이러스 입자의 유무는 전자현미 경으로 관찰했다 (Fig. 3). 감염성세 포인 CHSE-214, RTG-2 및 RSBK-2에서는 세포질의 융해가 보이고.
- 감염세포 내의 완전 입자의 바이러스의 관찰은 투과 전자현미경으로 행했다. MABV Y-6에 감염된 각종 배양세포를 개량 Kamovsky 고 정액으 로 전고정하여 0.
- 계대 10대째의 바이러스 항원을 ELISA법으로 정량하여, 각 감염세포에 있어서 단백 1 mg의 흡광도치를 구하여 비교했다 (Fig. 2).유의 차 검증의 결과 MABV Y-6 항원양은 RSBK-2에서는 다른 세포와 비교하여 항원량이 많고, FHMe 다른 세포와 비교하여 항원량이 적었다.
- 그 후, 알코올 계열로 탈수하여 에폭시 레진으로 포매하였다. 계속 하여 울트라 마이크 로톰으로 초박절 편을 만들어 초산우라닐과 구연산납으로 2중 염색하여 전자현미경으로 관찰 하였다.
- 1NH2SO4로 반응을 정지시킨 후, microtiter reader MPR A4i (Tosoh)로 492 nm 에서 흡광도를 측정하였다 또한, 1차 항체로 MABV Y-6의 주요 capsid protein 인 VP2에 대한 항체(항VP2항체)로 동일한 실험을 행했다. 그 후단백질 농도를 modified Bradford 법 (Read and Northcote, 1981)으로 구하여, ELISA의 결과를 각 감염세포 단백 1 mg당의 흡광도치를 계산하여 Duncan법에의해 유의 차 검정을 행했다
- 바이러스는 방어 유래의 MABVY-6를 사용하였다. 바이러스는 한계 희석법으로 3회 클로닝하여 RTG-2로 배양하여. 이것을 시작 바이러스로 사용하였다.
- 바이러스 항원의 양을 각 세포에서 비교하기 위하여 ELISA법을 사용하였다. 바이러스를 각종 배양 세포에 감염시켜 40시간 후에 회수하여, 2번 동결과 해동처리하여 얻어진 배양액을 항원으로 사용하였다 음성 대조로는 각각의 바이러스를 감염시키지 않은 정상 세포를 사용하였다. ELISA plate에 항원의 4배 희석 계열을 만들어 37℃ 에서 2시간 반응시켜 흡착시켰다.
- 성숙바이러스 입자는 세포질에 존재하고 있다. 비감염성 세포인 EPC, FHM 및 BF-2에서는 각 세포에 대해 200 메쉬의 그리드 위의 절편을 20메쉬씩 관찰했지만, 바이러스 입자는 관찰되지 않고 세포의 융해도 관찰되지 않았다.
- 이것을 시작 바이러스로 사용하였다. 어류 유래의 CHSE-214, RTG-2, RSBK-2, EPC, FHM 및 BF-2세포는 25 cm'의 플라스크를 사용하여 20℃ 에서 배양하고, 배지에는 10%의 소태아 혈청을 첨가한 l%glutamin 함유 EMEM (Eagle's minimum essential medium,Nissui)를 사용하였다 바이러스의 계대는 각 세포를 혈구 계산판으로 계수한 후 m.o.i가 0.이 이되도록 바이러스 액을 접종하였다.EPC, FHM 및 BF-2 세포에 있어서는 바이러스의 역가가 IbTCIDWml 이하로 m.
- 그러나 지금까지의 연구에서는 감염세포 내에서 어느 정도의 바이러스단백질이 발현되는가 하는 정량적인 검토는 행하지 않았다 본 연구에서는 감염성이 다른 6종류의 세포에 있어서의 MABV의 고분자 합성 과증식 과정을 분자 레벨에서 조사함에의하여 잠복 감염기구를 밝히는 것을 목적으로 하여 MABV Y-6를 이용하여 CHSE-214, RTG-2, RSBK-2, EPC, FHM 및 BF-2의 6종류의 세포에서 10대 계대했을 때의 바이러스 항원의 발현. 정량, 바이러스 입자의 관찰을 행했다
- PBS로 세정한 후에 cell disk를 glycerol로 커브글라스를 봉입하였다. 형광의 관찰은 FLUOPHOT (Nikon)으로 행했다 음성 대조로는 정상의 토끼 혈청과 바이러스에 감염되지 않은 세포를 사용하였다
대상 데이터
- 바이러스는 방어 유래의 MABVY-6를 사용하였다. 바이러스는 한계 희석법으로 3회 클로닝하여 RTG-2로 배양하여.
- 회수한 바이러스액은 -80℃에서 보존하였다. 실험에는 계대 10대째를 사용하였으며. 10대째의 바이러스 생산 량은 TCID50법으로 측정하였다.
이론/모형
- 실험에는 계대 10대째를 사용하였으며. 10대째의 바이러스 생산 량은 TCID50법으로 측정하였다.
- 각종 감염세포 내의 바이러스 항원량을 비교하기 위하여 계대 10대째의 바이러스 항원을 ELISA법으로 정량하여.단백질 Img당의 흡광치를 비교하였다 MABVY-6의 바이러스항원양은 RSBK-2에서 다른 세포와 비교하여 항원 양 이 많고, 한편 FHM에서는 다른 세포와 비교하여 항원량이 적었다 CHSE-214, RTG-2, EPC 및BF-2 사이에서는 유의차는 없었다.
- 바이러스 항원의 발현은 형광항 체법으로 확인했다. 24 well plate에 세포배양용 cell disk(Sum-ilon)을 넣어 그 위에 각종 세포를 배양하였다 세포가 monolayer가 된 후에 바이러스를 접종하였다.
- 바이러스 항원의 양을 각 세포에서 비교하기 위하여 ELISA법을 사용하였다. 바이러스를 각종 배양 세포에 감염시켜 40시간 후에 회수하여, 2번 동결과 해동처리하여 얻어진 배양액을 항원으로 사용하였다 음성 대조로는 각각의 바이러스를 감염시키지 않은 정상 세포를 사용하였다.
성능/효과
- 각종 배양세포와 10대째의 바이러스 생산량을 Tabled] 나타내었다. MABV Y-6를 감염시킨 40시간 후 CHSE-214(Fig. 1, A), RTG-2와RSBK-2세포는 세포가 둥글게 변하고 세포 융해를 보이는 CPE가 관찰되었다. 그러나 EPC, FHM 및 BF(Fig.
- 각종 감염세포 내의 바이러스 입자를 전자현미경으로 관찰했더니, CHSE-214, RTG-2 및 RSBK-2에서는 바이러스 입자가 관찰되었지만, 비감염성 세포 3종류에 있어서는 바이러스 입자는 관찰되지 않았다. Takeuraera/.
- 각종 배양세포에 바이러스를 접종했더니, CHSE-214, RTG-2 및 RSBK-2에서 CPE가 나타났고 바이러스의 생산이 확인되었다. 이때의 바 이러스항원의 발현을 형광항 체법으로 조사한 결과, 감수성 세포에서는 강한 형광이 세포질에서 확인되었다.
- Sorimachi and Hara (1985)는 방어유래의 YAV를 CHSE-214, RTG-2, EPC, FHM 및 뱀장어 신장 유래의 EK-1 세포에 접종하여 모든 세포에서 CPE가 관찰되었다고 보고하고 있다. 그러나 본 연구에서 사용한 EPC, FHM에서는 CPE가 관찰되지 않은 것으로 보아, 숙주 세포 자체가계대를 반복하는 사이에 변화했을 가능성도 생각된다.
- 각종 감염세포 내의 바이러스 항원량을 비교하기 위하여 계대 10대째의 바이러스 항원을 ELISA법으로 정량하여.단백질 Img당의 흡광치를 비교하였다 MABVY-6의 바이러스항원양은 RSBK-2에서 다른 세포와 비교하여 항원 양 이 많고, 한편 FHM에서는 다른 세포와 비교하여 항원량이 적었다 CHSE-214, RTG-2, EPC 및BF-2 사이에서는 유의차는 없었다. 그러므로 감수성세포와 비감수성세포내의 바이러스 항원량에 큰 차이는 없다고 생각된다.
- 이때의 바 이러스항원의 발현을 형광항 체법으로 조사한 결과, 감수성 세포에서는 강한 형광이 세포질에서 확인되었다. 또한 CPE가 관찰되지 않았던 EPC, FHM 및 BF-2에 있어서도 형광이 확인되어, 세포 내에서 바이러스의 단백질이 생산되고 있는 것을 나타내었다.
- 그러므로 감수성세포와 비감수성세포내의 바이러스 항원량에 큰 차이는 없다고 생각된다. 또한 주요 capsid 단백질인 VP2항원만을 검출하였더니, CHSE-214와 RSBK-2에서는 다른 세포와 비교하여 항원량이 많고 이들 간의 유의차는 없으나 그 이외의 세포와의 사이에는 유의차가 있었다. 그러나 감수성 세포인 RTG-2와 비감수성세포인 EPC, FHM 및 BF-2와의 사이에는 유의차가 없으므로.
- 그들은 인플루엔자 B 바이러스는 바 이러스단백질과 핵산의 결합까지의 단계는 진행되지만, 출아가 일어나는 단계에서 증식의 진행이 방해받는 것으로 고찰하고 있다. 본 연구에서 사용한 MABV는 세포질에서 바이러스 단 백질과 핵산이 조립되어 바이러스 입자가 완성되므로 비감염성세포 내에서는 바이러스 입자의 조립이 일어나지 않든지, 혹은 조립이 일어나더라도 양이 적음으로 인해 바이러스 입자가 관찰되지 않았다고 생각된다.
- 그러나 감수성 세포인 RTG-2와 비감수성세포인 EPC, FHM 및 BF-2와의 사이에는 유의차가 없으므로. 비감수성 세포에 있어서는 감염성의 바 이러스입자의 생산은 적으나 VP2는 감수성세 포인 RTG-2와 같은 정도로 합성되고 있는 것을 알 수 있었다 RTG-2에서는 생산바이러스의 양은 많음에도 불구하고 바이러스 단백량은 비감염성세포와 동일한 정도였으므로, 다른 세포에 비교하여 높은 효율로 바이러스가 세포 밖으로 유출된다고 생각된다
- 2).유의 차 검증의 결과 MABV Y-6 항원양은 RSBK-2에서는 다른 세포와 비교하여 항원량이 많고, FHMe 다른 세포와 비교하여 항원량이 적었다. CHSE- 214, RTG-2, EPC 및 BF-2의 사이에는 유의차는 없었다 또한.
- 각종 배양세포에 바이러스를 접종했더니, CHSE-214, RTG-2 및 RSBK-2에서 CPE가 나타났고 바이러스의 생산이 확인되었다. 이때의 바 이러스항원의 발현을 형광항 체법으로 조사한 결과, 감수성 세포에서는 강한 형광이 세포질에서 확인되었다. 또한 CPE가 관찰되지 않았던 EPC, FHM 및 BF-2에 있어서도 형광이 확인되어, 세포 내에서 바이러스의 단백질이 생산되고 있는 것을 나타내었다.
- 전자현미경 관찰에서 CHSE-214, RTG-2와 RSBK-2세포에서는 다수의 바이러스 입자가 관찰되었으나 EPC, FHM과 BF-2세포에서는 관찰되지 않았다. 이상의 결과로부터, MABV는 EPC, FHM 과 BF-2세포와 같은 감수성이 약한 세포에 있어서는 바이러스 입자의 조립은 이루어지지 않으나, 높은 역가의 바이러스를 생산하는 CHSE- 214, RTG-2와 RSBK-2세포와 같은 정도의 바이러스단백질이 발현되고 있으며 이러한 형태로 숙주 내에서 잠복 감염을 일으키는 것으로 생각 된다
- MABV는 CHSE-214, RTG-2와 RSBK-2세포내에서 전형적인 세포 변 성 효과 (CPE)를 나타내며 높은 역가를 나타내지만 EPC, FHM과 BF-2세포에서는 CPE가 나타나지 않았다. 항바이러스입자 항체와 항VP2항 체로 ELISA법에의하여 발현된 바이러스 단백 질의 양을 즉정한 결과 두 경우 모두에서 생성되는 바이러스의 항원의 양은 거의 같았다. 전자현미경 관찰에서 CHSE-214, RTG-2와 RSBK-2세포에서는 다수의 바이러스 입자가 관찰되었으나 EPC, FHM과 BF-2세포에서는 관찰되지 않았다.
- 형광현미경으로 세포 내의 바이러스 특이 단백질을 검출한 결과 감수성 세포인 CHSE-214, RTG-2 및 RSBK-2 에서는 세포질에서 강한 특이형광이 검출되었으며 (Fig. 1, C), 바이러스 비 감수성 세포인 EPC, FHM 및 BF-2에서도 형광이 관찰되었다 (Fig. 1, D).
후속연구
- 이상으로부터, MABV의 비감염성 세 포내에서의 잠복 감염은 증식 과정의 초기 단계에 까지 진행되고 있으나 바이러스 입자의 완성에는 이르지 않은 것이 밝혀졌다 잠복 감염을 일으키는 원인이 바이러스 측이나 숙주세포 측의 어느 한쪽에 존재하고 있는지 혹은 둘의 상호작용에의한 것인지를 밝히기 위한 연구가 더 필요한 것으로 생각된다
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.