[논문]2가 양이온이 Thiamine Pyrophosphate에 의한 Group I Intron Ribozyme의 Splicing 억제에 미치는 영향

안성준; 박인국

2가 양이온이 Thiamine Pyrophosphate에 의한 Group I Intron Ribozyme의 Splicing 억제에 미치는 영향
Effects of Divalent Cations on the Self-splicing Inhibition of Group I Intron by the Coen-zyme Thiamine Pyrophosphate 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.38 no.1, 2002년, pp.13 - 18

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2가 양이온($Mg^{2+}$, $Mn^{2+}$, $Zn^{2+}$)이 조효소 thiamine pyrophosphate에 의한 T4파지 티민생합성 유전자 (td) 인트론 RNA의 splicing에 미치는 영향을 조사하였다. $Mg^{2+}$를 30 mM까지 증가시켰을 때 splicing 활성은 농도에 비례하여 증가하였다. 그러나 $Mg^{2+}$이 존재하지 않는 상태에서 0.1-4 mM 농도에 걸쳐 $Zn^{2+}$를 사용한 결과 약 20% 정도의 splicing이 일어났다. 이때 대부분의 splicing product는 인트론-엑손2 및 엑손2였고 엑손1-엑손2는 검출되지 않았다. 그리고 4 mM 농도에서는 RNA가 대부분 가수분해되는 현상이 나타났다. $Mn^{2+}$ 이온은 사용한 농도 범위 (0.1-8 mM)에서 $Zn^{2+}$ 보다는 전반적으로 약간 증가된 splicing 활성을 보였으며 8 mM 농도에서도 약 30% 정도의 splicing 활성을 보였다. $Zn^{2+}$ 이온처럼 splicing product는 인트론-엑손2 및 엑손2였고 엑손1-엑손2는 검출되지 않았 다. 반면에 splicing반응에 10 mM $Mg^{2+}$ 를 첨가했을 때 $Zn^{2+}$ 과 $Mn^{2+}$ 이온은 평균 약 35-40% 정도 splicing활성을 촉진시키는 것으로 나타났다. 실험한 2가 양이온 중에서 특히 $Mg^{2+}$ 은 가장 낮은 농도에서 thiamine pyrophosphate 에 의한 억제반응을 극복하는 최고의 활성효과를 나타냈다. 이와 같은 억제 회복 효과는 $Mg^{2+}$에 의한 리보자임의 td intron 구조적 안정성에 기인하는 것으로 추정된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Effects of divalent cations such as $Mg^{2+}$, $Mn^{2+}$ and $Zn^{2+}$ on the self-splicing inhibition of the T4 phage thymidylate synthase (td) intron by the coenzyme thiamine pyrophosphate have been investigated. The splicing activity increased in proportion to the concentration of $Mg^{2+}$ up to 30 mM. Without $Mg^{2+}$in the splicing reaction the $Zn^{2+}$ ion tested in the range of 0.1-6 mM concentration only produced the splicing activity about 20% that of the normal splicing rate. A majority of the splicing products were I-E2 and E2 but El-E2 ligation product, Cl and Ll were not detected. Similar patterns of splicing products were also observed with $Mn^{2+}$. At 6 mM $Zn^{2+}$the intron RNA was hydrolyzed. $Mn^{2+}$produced a little higher splicing activity than that of $Zn^{2+}$over the range of concentrations used and at 8 mM about 28% splicing activity was observed. In contrast, $Mn^{2+}\;and\;Zn^{2+}$ ions promoted the splicing activity about 35-40% on an average in the presence of 10 mM $Mg^{2+}$. Of all divalent cations tested, $Mg^{2+}$exhibited the maximum activation effect to counteract the splicing inhibition by thiamine pyrophosphate. This appears to be due to the stabilizing effect of td intron ribozyme structure essential for the catalytic function by $Mg^{2+}$.

주제어

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문제 정의

따라서 본 연구에서는 2가 양이온이 thiamine pyrophosphate에 의한 splicing억제에 미치는 영향을 조사하였다.

가설 설정

The ratio of E1-E2 ligation produced in each splicing reaction to that of the normal splicing reaction was expressed as relative splicing activity. B. Splicing rates of the intron RNA as a function of concentrations of Mg²⁺.
제안 방법
- 1 〜10 mM 농도에 걸쳐 실험하였다. 그리고 2.5 mM thiamine pyrophosphate에서 1〜30 mM 농도의 Mg²⁺을 사용하여 Mg²⁺에 의한 극복 효과를 조사하였다. 다양한 농도의 Zn²⁺ (0.
- 전기 영동이 끝난 gel을 X-ray film에 노출시킨 후 현상하였다. 그리고 UVI Image Analyzer (England)를 이용하여 긱기의 splicing product과 splicing되지 않은 pre-RNA의 gel density를 면적으로 환산하여 총 면적으로 계산하였다(Fig. 1). 이 총면적에 대하여 E1-E2 ligation에 해당되는 면적의 상대적 비율을 %로 표시한 수치를 relative splicing activity (%)이다.
- 5 mM thiamine pyrophosphate에서 1〜30 mM 농도의 Mg²⁺을 사용하여 Mg²⁺에 의한 극복 효과를 조사하였다. 다양한 농도의 Zn²⁺ (0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 1, 2, 4 mM), Mn²⁺ (0.1, 0.2, 0.6, 1, 2, 4, 6, 8 mM)을 사용하여 2.5 mM thiamine pyrophosphate가 포함된 splicing buffer (Tris-HCl, pH 7.5, 10 μM guanosine)에 10 mM Mg²⁺을 첨가했을 때와 첨가하지 않았을 때 각각 58℃에서 10 분간 incubation하여 반응시켰다. 그 다음 stop solution (95% formamide, 20 mM EDTA, 0.
- 5 mM의 각 rNTP, 5 μCi의 [³²p]GTP, 10 U의 T7 RNA polymerase를 혼합하여 30℃에서 30 분간 실시하였다. 전사 후 2.23 kb 의 primary transcript는 Sephadex G-50을 사용하여 gelfiltration 하여 정제하였다.
- ethanol 침전을 통해 template을 준비하였다. 전사는 전사 완충액(40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 3 mM MgCl2, 1 mM spermidine, 5 mM NaCl)에 10 mM DDT, 1 U/ml RNase, 0.5 mM의 각 rNTP, 5 μCi의 [³²p]GTP, 10 U의 T7 RNA polymerase를 혼합하여 30℃에서 30 분간 실시하였다. 전사 후 2.
- 조효소 thiamine pyrophosphate가 splicing 반응에 미치는 영향을 조사하기 위해 0.1 〜10 mM 농도에 걸쳐 실험하였다. 그리고 2.
대상 데이터
- EcorRI과 Hindlll제한효소는 New England Biolabs에서, T7 RNA polymerase는 US Biochemical에서, RNase와 RQ1 DNase 는 Promega에서 구입하였다. [³²p]GTP와 nucleoside triphosphate는 Amersham에서 구입하였다
- 32p]GTP와 nucleoside triphosphate는 Amersham에서 구입하였다
- pGEM 재조합 플라스미드에 클론된 td fragment내 exon 2로부터 520 bp아래 위치한 부분을 HpaI으로 자른 후, phenol 추출과 ethanol 침전을 통해 template을 준비하였다. 전사는 전사 완충액(40 mM Tris-HCl, pH 7.
- 본 실험에 사용한 Escherichia coli TG1 과 HB101 균주는 Amersham에서 구입하였다. M13mp8 phage는 Bethesda Research Laboratory에서, pGEM2는 Promega corp.

성능/효과

5 mM thiamine pyro-phosphate의 존재 하에서 T4파지의 티민 생합성 유전자 인트론 RNA의 splicing 억제의 회복에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 1 mM Mg²⁺에서 splicing 활성은 정상적 splicing 활성 (splicing product가 CI, I-E2, E1-E2, LI 등으로 생성되었을 때)의 약 10% 에 불과하였다(Fig. 3B). 그러나 Mg²⁺ 농도를 30 mM까지 증가시켰을 때 splicing 활성은 Mg²⁺농도에 비례하여 증가하였다.
Mn²⁺이온은 Zn²⁺이온과 매우 유사한 촉진반응을 나타내었는데, Zn²⁺이온보다는 훨씬 더 높은 농도의 범위에서 촉진반응이 일어나는 것으로 나타났다. 그리고 8 mM의 고농도에서는 거의 27% 정도의 splicing 활성을 유지하는 것으로 보아 Zn²⁺이온보다는 td intron 리보자임의 splicing 활성반응에 억제영향을 덜 주는 것으로 나타났다.
Mn²⁺이온은 모든 2가 양이온 중에서 Mg²⁺이온과 그 화학적 성질이 가장 유사하지만 td intron 리보자임 splicing 반응에 미치는 영향은 현저히 다르게 나타났다. 이러한 현상은 td intron 리보자임과 동일한 group I intron 리보자임의 self-splicing group에 속한 Tetrahymena thermophila rRNA 리보자임과는 현저히 다른 양상을 나타내는 것이다(1, 2).
Thiamine pyrophosphate농도가 증가할수록 splicing 반응의 활성이 비례적으로 감소하였다. Thiamine pyrophosphate 농도가 2.5 mM일 때 splicing 활성이 약 50% 정도로 감소하였으며 10 mM thiamine pyrophosphate에서 splicing 활성은 거의 나타나지 않았다. Thiamine pyropho- sphate는 그 구조 내 guanidino group을 보유하고 있지 않는 데도 불구하고 선택적 억제를 하는 특이성을 보였다(9, 12).
이러한 현상은 thiamine pyrophosphate의 splicing 억제 반응이 2가 양이온의 chelation작용 이외에 또 다른 기능적 역할을 thiamine pyrophosphate가 수행하고 있음을 시사한다. 결론적으로 사용한 2가 양이온 중 Mg²⁺이온이 td intron 리보자임의 splicing에 최적이온인 것으로 나타났으며,Zn²⁺와 Mn²⁺이온 등은 매우 저조한 splicing 반응을 나타내었다. 특히 Zn²⁺와 Mn²⁺이온 등은 불완전한 splicing 생성물 형성을 일으켰고 CI, E1-E2 및 LI 등의 형성은 일어나지 않았다.
특히 Zn²⁺와 Mn²⁺이온 등은 불완전한 splicing 생성물 형성을 일으켰고 CI, E1-E2 및 LI 등의 형성은 일어나지 않았다. 그러므로 td intron 리보임은 다른 group I intron 리보자임과 달리 splicing 반응에서 Mg²⁺이온이 가장 효과적인 촉매 역할을 하는 것으로 나타났다.
것으로 나타났다. 그리고 8 mM의 고농도에서는 거의 27% 정도의 splicing 활성을 유지하는 것으로 보아 Zn²⁺이온보다는 td intron 리보자임의 splicing 활성반응에 억제영향을 덜 주는 것으로 나타났다.
본 연구에서 조효소 thiamine pyrophosphate는 그 구조내 인산기가 self-splicing 반응에 참여하는 2가 양이온(Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺) 등을 chelation 함으로써 splicing 촉매 반응을 억제할 가능성이 매우 높지만, Fig. 3의 Mg²⁺실험결과를 보면 그 상관관계가 고농도의 경우에는 Mg²⁺ 농도와 비례하지 않음을 알 수 있다. 이러한 현상은 thiamine pyrophosphate의 splicing 억제 반응이 2가 양이온의 chelation작용 이외에 또 다른 기능적 역할을 thiamine pyrophosphate가 수행하고 있음을 시사한다.
약간의 RNA는 가수분해하기 시작하였다. 이 결과는 Mg²⁺이온이 group I intron 리보자임의 self-splicing 촉매반응에 필수적인 인자로서 요구되지만 고농도(30 mM)에서는 RNA 가수분해를 촉진시킨다는 사실을 알 수 있었다. 따라서 조효소 thiamine pyrophosphate가 리보자임 촉매 반응과정에서 리보자임의 Mg²⁺-결합부위(Mg²⁺-binding site)에 경쟁적으로 결합함으로써 splicing 반응을 억제하는 것으로 추정된다(8).

후속연구

뿐만 아니라 이 조효소는 신경충격 전달과정에서 acetylcholine 합성과 이온 수송에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다(7). 상기한 바와 같이 금속이온이 RNA splicing을 촉매하고 조효소들이 선택적으로 td intron ribozyme의 splicing을 억제한다는 사실을 토대로 금속이온과 thiamine pyrophosphate 사이의 기능적 상호작용을 연구하는 것은 촉매기전을 이해하는데 유용한 정보를 제공할 것으로 사료된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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