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문제 정의
- 본 연구는 개심술을 시행한 소아 환자에서 재관류 손상과 관련이 있을 것으로 생각되는 각종 사이토카인과 케모카인의 증감을 조사하고자 하였다. 가장 중요한 역할을 할 것으로 생각되는 IL-6의 생성이 체외순환 직후부터 증가하였으며 체외순환 2시간 이후부터 감소하였다.
제안 방법
- 0, O.5 M KC1, 0.1 M DTT, 0.05 M MgCb), 4 及의 lOx dNTP (2.5 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP)을 가하고 20 의 oligo-dT15 와 44 U의 RNase inhibitor(Poscochem R&D center, Kyonggi-do, korea) 및 10 U의 역전사효소(Poscochem R&D center) 를 가하고 총 반응액이 40 及가 되도록 증류수를 가한 후 42 °C 에서 1 시간 반응하여 cDNA를 얻었다. cDNA 산물은 99C 에서 5 분간 가열하여 역전사효소를 불활성화시킨 다음 얼음에 담가 급랭하였다.
- IL-6 production by PBMC from patients undergoing open heart surgery. Serum were prepared from radial artery blood from patients at induction (baseline), 0 hourdast clamp off), 2, 24, and 48 hours. The cytokine concentrations were measured using ELISA.
- 23으로 유지하였고 동맥선 내 여과기 (arterial line filter)를 사용하였다. 관류지수는 2.0-2.5 L/min/m2 를 유지하고 심도 및 중증도 저체온에서 수술을 시행하였다. 심정지액은 혈성 심정지액을 대동맥 근을 통하여 주입하였다.
- cDNA 산물은 99C 에서 5 분간 가열하여 역전사효소를 불활성화시킨 다음 얼음에 담가 급랭하였다. 그 후 IL-12 p40 및 p35는 cDNA 산增 중 5 区 그 외의 사이토카인에 대한 은 생성된 cDNA 산물 중 2.5 ftH 씩 취하여 다음과 같은 동일한 조건에서 중합 효소 연쇄반응을 시행하였다. 즉 5 创의 10x PCR buffer (0.
- 조사하였다. 동일한 총 RNA 표본으로부터 RT-PCR을시행하여 mRNA 발현을 조사하였으며 agarose gel 상에서의전기영동 및 densitometry에 의한 발현분석 결과를 나타내었다
- 모든 환자에서 체외순환 전, 체외순환 직후, 2, 24 및 48 시간 후 말초혈액 단핵구를 수집하여 사이토카인 유전자 발현 실험을 실시하였다.
- 05% Tween 20-PBS로 4 회 세척 후 horseradish peroxidase 기질인 orthophenylenedia- mine(OPD)를 1 mg/ml로 citrate-phasphate buffer에 용해하여 well 에 첨가함으로써 기질 반응하였다. 발색 반응은 암실에서 하였으며 기질효소반응은 IM HzSQ를 첨가하여 종결하였다. 발색 정도는 492 nm파장에서 ELISA reader (Molecular device, USA)로 측정하였다.
- 본 연구는 개심술을 시행한 18 명의 소아 환자에서 체외순환 전, 체외순환 직후, 2, 24 및 48 시간 후에 말초혈액 단핵구를 수집하여 전염증성 사이토카인인 IL-la, IL-If, IL-6, IL-8, TNF-a, 및 IL-15과, T 세포에서 주로 분비하는 염증성사이토카인인 인터페론감마(inteferon-Y, IFN-y) mRNA 발현을 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)에 의하여 반정량적으로 측정하였다 또한 IL-6의 단백질 생성을 효소결합 면역측정법(enzyme- 1 inked immunosorbent assay; ELISA)으로 측정하였다
- 본 연구는 개심술을 시행한 18 명의 소아 환자에서 체외순환 전, 체외순환 직후, 2, 24 및 48 시간 후의 말초혈액 단핵구로부터 총 RNA를 분리하여 전염증성 사이토카인인 IL-la, IL-1P, IL-6, IL-8, TNF-a, 및 IL-15과, T 세포에서 주로 분비되는 염증성 사이토카인인 IFN-y mRNA 발현을 RT-PCR에의하여 조사하였다. 동일한 총 RNA 표본으로부터 RT-PCR을시행하여 mRNA 발현을 조사하였으며 agarose gel 상에서의전기영동 및 densitometry에 의한 발현분석 결과를 나타내었다
- 25% bromophenol blue/0.25% xylene cyanol FF/50% glycerol)와 즈! 섞은 다음 1 Ug/ml의 ethidium bromide0] 포함된 2% agarose gel 상에 Tris-Acetate-EDTA(TAE) buffer 하에서 전기영동하였으며 이동한 DNA band의 위치를 자외선 투사기 (ultraviolet transilluminator) 상에서 관찰하였다.
- 5 L/min/m2 를 유지하고 심도 및 중증도 저체온에서 수술을 시행하였다. 심정지액은 혈성 심정지액을 대동맥 근을 통하여 주입하였다.
- 015 M MgCh), 5 快의 lOx dNTP, 20 J1M의 3'-primer 및 5'-primer, 1 U Taq DNA polymerase(Bioneer)를 각 튜브에 첨가하여 총 반응액이 50 创 되도록 증류수를 가하였다. 중합효소연쇄반응은 DNA thermal cycler(Biometra Inc., Tampa, Honda, USA)를 사용하여 35 회의 cDNA 증폭 반응을 실시하였다. 중합효소연쇄반응 조건은 변성은 94笆에서 1분, annealing은 60°('에서 2분, extension은 72°C 에서 1 분간 시행하였다.
- 5 ftH 씩 취하여 다음과 같은 동일한 조건에서 중합 효소 연쇄반응을 시행하였다. 즉 5 创의 10x PCR buffer (0.1 Tris-Cl pH 8.0, 0.5 M KC1, 0.015 M MgCh), 5 快의 lOx dNTP, 20 J1M의 3'-primer 및 5'-primer, 1 U Taq DNA polymerase(Bioneer)를 각 튜브에 첨가하여 총 반응액이 50 创 되도록 증류수를 가하였다. 중합효소연쇄반응은 DNA thermal cycler(Biometra Inc.
- 6 kg)였다(Table 1). 통상적인 전신마취하에 기관 삽관 후 중심정맥선과 말초동맥카테타를 설치하였다. 체외순환은 비박동성 롤러 펌프(nonpulsatile roller pump)를 이용하였고 산화기는 중공 막형 산화기(hollow fiber membrane oxygenator, Minimax, Medtronic, USA) 및 열교환기를 사용하였다.
- 허혈/재관류 손상과 관련이 있을 것으로 생각되는 각종 사이 토카인과 케모카인의 증감을 조사하고자 충남대 학교병 원 흉부외과에서 개심술을 시행한 소아환자 18 명의 체외 순환 전, 체외순환 직후, 2, 24 및 48 시간 후의 말초혈액 단핵구를 수집하여 IL-la, IL-10, IL-6, IL-8, TNF-a, IL-15 및 IFN-y mRNA 발현을 역전사효소 중합효소연쇄반응에 의하여 반정량적으로 측정하였다. 체외순환 전에 비해 체외순환 직후 IL-6 및 IL-8 유전자 발현강도는 상승되어 나타났으며 2 시간 이후부터 점차 감소되는 양상이었다.
- 헤파린(중외제약, 25, 000 IU)을 전처치한 주사기로 5 ml의 동맥혈을 채혈하여 Histopaque(Sigma 1077, density 1.007) 위에 중첩한 후 1, 500 rpm에서 30 분간 원심 분리하여 상층의 혈청과 중간층의 단핵세포를 각각 수거하였다. 혈청은 사이토카인 양을 측정하기 위해 -70 笆에 보관하였으며 단핵세포는 phosphate buffered saline(PBS)으로 1, 200 rpm에서 10 분간씩 3 회 세척하였다 최종적으로 총 RNA를 취하기 위해 변성 용액에 부유하여 -70 °C 에 보관하였다.
대상 데이터
- 단핵구에서 총 RNA 분리는 RNAgent kit(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하였다. 세포를 냉 PBS로 3 회 세척한 후 1 X 107의 세포당 0.
- 대상 환자는 1997년 12월부터 1998년 8월까지 충남대학교병원 흉부외과에서 개심술을 시행한 18명의 소아 환자를 대상으로 하였다. 평균 연령은 14개월(1〜48개월)이었고 평균체중은 9 kg(3.
- 사이토카인 유전자 발현에 이용한 시발체 세트는 바이오니아(Bioneer, Chungju, Korea; PAGE 정제급)에 주문 합성하여 사용하였다{Table 2).
- 통상적인 전신마취하에 기관 삽관 후 중심정맥선과 말초동맥카테타를 설치하였다. 체외순환은 비박동성 롤러 펌프(nonpulsatile roller pump)를 이용하였고 산화기는 중공 막형 산화기(hollow fiber membrane oxygenator, Minimax, Medtronic, USA) 및 열교환기를 사용하였다. 충전액은 정질액과 혈액을 혼합하여 적혈구용적률을 0.
데이터처리
- 결과는 Student's t-test에 의해 검증하였으며 p value가 0.05 이하를 유의한 결과로 판단하였다. 그러나 유의하지 않다고 판단되는 경우에는 통계 처리 결과를 나타내지 않았다.
이론/모형
- IL-6에 대한 효소결합 면역측정법(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA}는 Pharmingen 사의 human ELISA kit를 이용하였다. 0.
- IL-6의 단백질 생성을 ELISA에 의해 측정하였다. 체외순환직전 평균 93.
성능/효과
- IFN-y mRNA 발현은 체외순환 전에 매우 미약한 PCR 발현 밴드를 관찰할 수 있었으나 체외순환 이후 발현이 오히려 감소하여 체외순환 2시간 이후부터는 거의 유전자 발현이 관찰되지 않았다.
- TNF-a mRNA 발현은 체외순환 전에 비해 체외순환 직후약 1.3배 증가하였으며 이후 점차 증가하여 체외순환 24시간 후에 가장 증가된 양상을 나타내었다. 그러나 48시간 후에는 급격히 감소하여 체외순환 직후와 비슷한 유전자 발현 강도를 관찰할 수 있었다.
- 증감을 조사하고자 하였다. 가장 중요한 역할을 할 것으로 생각되는 IL-6의 생성이 체외순환 직후부터 증가하였으며 체외순환 2시간 이후부터 감소하였다. 체외순환 이후 시간이경과함에 따라 IL-la 및 P, 그리고 TNF-a의 생성도 연이어증가되었다.
- 개심술을 시행한 환자에서 전염증성 사이토카인과 항염증성 사이토카인들 간의 균형과 상호 조절은 환자의 전신적 염증반응에 의한 예후에 영향을 미칠 것으로 생각된다 이상의 연구를 종합하면 IL-6, IL-8, IL-la 및 TNF-a 등 주요 전염증성 사이토카인과 케모카인들이 체외순환과 관련된 직간접적인 면역반응으로 인한 기관 손상에 밀접한 관련이 있을 것으로 생각한다.
- 개심술을 시행한 환자에서 전염증성 사이토카인의 유리는, 특히 소아에서 매우 많은 변화가 관찰된다고 한다的 본 연구에서도 대부분의 환자 대상이 소아였기 때문에 각 개인별로 많은 차이점을 관찰할 수 있었으나 IL-6와 IL-8이 모두 수술 도중에 급격히 상승된다는 것을 알 수 있었다.
- 반면 IL-15의 경우는 체외순환 전후 유의한 차이는 없었고 IFN-V mRNA의 발현은 체외순환 전에 비해 오히려 약화되거나 일부 환자의 경우 발현이 관찰되지 않았다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 IL-6, IL-1, TNF-a 등 주요 전염증성 사이토카인 및 IL-8과 같은 일부 케모카인이 체외순환과 관련된 직간접적인 면역반응과 밀접한 관련이 있을 것으로 생각한다.
- 가장 중요한 역할을 할 것으로 생각되는 IL-6의 생성이 체외순환 직후부터 증가하였으며 체외순환 2시간 이후부터 감소하였다. 체외순환 이후 시간이경과함에 따라 IL-la 및 P, 그리고 TNF-a의 생성도 연이어증가되었다. 그러나 IL-15의 발현은 변화가 없었으며 IFN-y 유전자의 발현은 오히려 감소되었다.
- IL-8 유전자 발현 양상도 IL-6의 경우와 매우 유사하였다. 체외순환 전에 비해 체외순환 직후 약 1.7 배가량 증가된 발현을 나타내었고, IL-6에 비해 유전자 감소의 폭이 둔화되는 양상이었다. 따라서 체외순환 48시간 후에도 유전자 발현의 강도는 체외순환 전에 비해 증가되어 있었으나 통계적으로 유의한 차이는 없었다.
- IL-lp 유전자 발현 양상도 IL-la의 경우와 매우 유사하였다. 체외순환 전에 비해 체외순환 직후 약 1.7배 가량 증가된 발현을 나타내었으며 체외순환 2시간 후에 발현이 가장 높았고(2.1배), 이후 점차 감소하여 체외순환 48시간 후에는 체외순환전의 약 1.4배로 감소하였다.
후속연구
- 향후 연구를 통하여 전염증성 사이토카인을 억제하는 항염증성 사이토카인들에 대한 면밀한 연구가 수행되어야 할것으로 생각한다. 특히 IL-10과 IL-1 receptor antagonist (IL-lra)가 체외순환을 수반하는 수술과 관련되어 가장 중요한 항염증 작용을 하는 것으로 보고되었다物 c-reactive protein(CRP)도 백혈구의 화학주성을 조절하는 항염증 기능을 갖는 급성기 단백질 중의 하나로 알려져 있다”).
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