Steinernematidae와 Heterorhabditidae속에 속하는 7종의 곤충병원성 선충으로부터 매우 강한 살충성을 갖는 공생박테리아를 분리하여 그 종별 특성을 비교하였다. 분리된 공생박테리아의 종별 배양특성, 살충특성, 단백질 분해 효소의 활성 및 지방산 함량 등이 조사되었다. XR-PC 및 XR-MK의 성장 및 살충성이 가장 우수한 것으로 나타났으며 대수증식기 초기에 살충성이 가장 높은 반면에, 시간이 지남에 따라 살충성도 점차 감소되었다. 이 살충성은 protease 역가와 직접 관련이 없었으나 XR-DR의 경우 다른 종에 비해 배양 3일째 약 4.5배의 최대 활성을 보였다. 그러나 HE-HY의 경우 균체의 성장에 비례하여 protease 역가도 계속 증가하였다. 지방간 함량의 경우 특히 공생박테리아의 종별로 12:0, 14:0, 16:1 cia 5, 17:0 cyclo에서 지방산 함량의 차이를 크게 나타내었으며 hydroxy와 branch 지방산이 전체 지방간의 약 2-15%가지 변화하는 것으로 나타났다.
Steinernematidae와 Heterorhabditidae속에 속하는 7종의 곤충병원성 선충으로부터 매우 강한 살충성을 갖는 공생박테리아를 분리하여 그 종별 특성을 비교하였다. 분리된 공생박테리아의 종별 배양특성, 살충특성, 단백질 분해 효소의 활성 및 지방산 함량 등이 조사되었다. XR-PC 및 XR-MK의 성장 및 살충성이 가장 우수한 것으로 나타났으며 대수증식기 초기에 살충성이 가장 높은 반면에, 시간이 지남에 따라 살충성도 점차 감소되었다. 이 살충성은 protease 역가와 직접 관련이 없었으나 XR-DR의 경우 다른 종에 비해 배양 3일째 약 4.5배의 최대 활성을 보였다. 그러나 HE-HY의 경우 균체의 성장에 비례하여 protease 역가도 계속 증가하였다. 지방간 함량의 경우 특히 공생박테리아의 종별로 12:0, 14:0, 16:1 cia 5, 17:0 cyclo에서 지방산 함량의 차이를 크게 나타내었으며 hydroxy와 branch 지방산이 전체 지방간의 약 2-15%가지 변화하는 것으로 나타났다.
Symbiotic bacteria with highly effective insecticidal activities were isolated and compared with their physiological characteristics from seven species of entomopathogenic nematodes belong to Steinernamatidae and Heterorhabditidae sp., and three of them were identified as Xenorhabdus nematophilus. C...
Symbiotic bacteria with highly effective insecticidal activities were isolated and compared with their physiological characteristics from seven species of entomopathogenic nematodes belong to Steinernamatidae and Heterorhabditidae sp., and three of them were identified as Xenorhabdus nematophilus. Culture characteristics, insecticidal activities, pretense activities and fatty acid contents of various symbiotic bactierial isolates were also examined. In the case of cell growth and insecticidal activity, XR-PC and XR-MK were superior to other species when cultured in vitro. The insecticidal activity were highest at the early exponential growth phase, and gradually decreased with time. The protease activity of XR-DR was remarkable compared to other species. In the case of HE-HY, however the pretense activity increased in parallel with cell growth. Interestingly, the fatty acid patterns of Xenorhabdus nematophilus isolated from different emtomopathogenic nematode, showed remarkable differences in their contents of 12:0, 14:0, 16:1 cia 5 and 17:0 cyclo and hydroxy and branch factty acids were varied from 2% to 15% among total fatty acid contents.
Symbiotic bacteria with highly effective insecticidal activities were isolated and compared with their physiological characteristics from seven species of entomopathogenic nematodes belong to Steinernamatidae and Heterorhabditidae sp., and three of them were identified as Xenorhabdus nematophilus. Culture characteristics, insecticidal activities, pretense activities and fatty acid contents of various symbiotic bactierial isolates were also examined. In the case of cell growth and insecticidal activity, XR-PC and XR-MK were superior to other species when cultured in vitro. The insecticidal activity were highest at the early exponential growth phase, and gradually decreased with time. The protease activity of XR-DR was remarkable compared to other species. In the case of HE-HY, however the pretense activity increased in parallel with cell growth. Interestingly, the fatty acid patterns of Xenorhabdus nematophilus isolated from different emtomopathogenic nematode, showed remarkable differences in their contents of 12:0, 14:0, 16:1 cia 5 and 17:0 cyclo and hydroxy and branch factty acids were varied from 2% to 15% among total fatty acid contents.
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제안 방법
NBTA배지에서 3-5일 정도 성장한 colony를 취해서 250 mL flask, 100 mL 0.5% NaCl, 0.05% K2HPO4, 0.05% NH4H2PO4, 0.02% MgSO 7H:O, 5% yeast extract 배지에 접종하여 281, 200 rpm incubator에서 7일간 배양하였으며 24시간 간격으로 sampling 하였다. 공생박테리아의 배양액을 1:50 희석하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
NBTA에서 3-5 일 동안 배양하여 나타난 colony를 BUGM 배지에 옮겨 2회 계대배양을 실시한 후 순수한 colony를 생 성하였다. 생성된 colony는 0.
Ste订lernematidae오+ Heterorhabditidae^6^ 속하는 7종의 곤충병원성 선충으로부터 매우 강한 살충성을 갖는 공생박테리아를 분리하여 그 종별 특성을 비교하였다. 분리된 공생박테리아의 종별 배양특성, 살충특성, 단백질 분해 효소의 활성및 지방산 함량 등이 조사되었다.
살충성 test는 꿀벌부채명나방 유충을 사용하여 실행하였다. 각 시료에 대해 4마리의 유충을 사용하였으며, 3 “L의 배양 원심분리 상등액을 유충의 혈강에 microsyringe를 사용하여 주사한 후, 25 ℃ incubator에 보관하면서 시간에 따른 사멸정도를 조사하였다.
4。(、에 보관된 microplate에 현탁액의 적정량을 접 종하고 281:에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 microplate 를 Biolog 시스템에 입력하고 95개 carbon source 각각에 대해 산화능을 조사하였다. 또한 그 결과를 Biolog 시스템에 내 장된 566종/속의 그람 음성균 database software를 이용하여 결과를 비교하였다(16).
본 연구에서는 곤충병원성 선충 Steinernematidae속 6종과 Heterohabditidae속 1종으로부터 각각 공생하는 박테리아를 분리하여 종별 공생박테리아의 특성, 단백질 분해 효소의 생 성정도, 꿀벌부채명나방 유충에 대한 살충성 및 지방산 함량 등을 비교하였다.
분리된 공생박테리아의 지방산 성분 및 함량을 조사하기 위해서 먼저 시험관 (13 X 100 mm)에 reagent l(NaOH 45 g, CH3OH 150 tnL, 초순수 150 mL)을 1 mL 넣은 후 TSA (Trypticase Soy Broth 30 g, Bacto Agar 15 g, 초순수 1 L) 배지에서 배양한 공생박테리아를 한 루프 정도 넣고 vortex하였다. 100T에 5분간 담근 후 다시 vortex하고 10CTC 의 항온 조에 25분간 두었다.
살충성 test는 꿀벌부채명나방 유충을 사용하여 실행하였다. 각 시료에 대해 4마리의 유충을 사용하였으며, 3 “L의 배양 원심분리 상등액을 유충의 혈강에 microsyringe를 사용하여 주사한 후, 25 ℃ incubator에 보관하면서 시간에 따른 사멸정도를 조사하였다.
지방산 측정은 HP6890 gas chromatograph를 사용하였으며, Ultra! capillary column을 사용하여 carrier gas로 压를 0.4 mL/min 의 유속으로 흘려주었고 column의 초기온도는 1701로 260’C까 지 5℃/min의 속도를 온도를 상승시켰으며 detector는 FID를 사용하였다. 그리고 지방산 성분 및 함량의 최종분석은 MIS Sherlock software를 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
carpocapsae PC, 5. moticola, S. Loagicatidum柜* Heterorhabditidae [종 (Heterorhabditis bacteriophora)으로 경상대학교 선충연구실로 부터 분양 받았다. In vivo로 증식된 곤충병원성선충을 꿀벌 부채명나방 유충에 접종하여 사멸시킨 후 95% ethanol에 담 궈 표면 살균한 후 3-4회 무균 증류수를 이용하여 세척한 후 무균적으로 유충을 해부하고 hemolymph 를 NBTA배지에 plate out한 후 28℃ incubator에서 배양하였다.
사용된 곤충병원성 선충은 Steinernematidae 6종(Steiaernema glaseri DR, S. glaseri NC, S. glaseri MK, S. carpocapsae PC, 5. moticola, S.
데이터처리
4 mL/min 의 유속으로 흘려주었고 column의 초기온도는 1701로 260’C까 지 5℃/min의 속도를 온도를 상승시켰으며 detector는 FID를 사용하였다. 그리고 지방산 성분 및 함량의 최종분석은 MIS Sherlock software를 이용하여 분석하였다.
배양된 microplate 를 Biolog 시스템에 입력하고 95개 carbon source 각각에 대해 산화능을 조사하였다. 또한 그 결과를 Biolog 시스템에 내 장된 566종/속의 그람 음성균 database software를 이용하여 결과를 비교하였다(16).
성능/효과
공생박테리아의 성 장과 관련하여 종별 살충성을 비교하기 위하여 꿀벌부채명 나방에 대한 살충성 test를 실시한 결과를 Table 3에 나타내었다. Table 3에서 보는 바와 같이 공생박테리아의 배양 상 등액만 접종하여도 XR-MO와 XR-LC를 제외하고는 모두 72 시간 이내에 유충을 사멸시키는 것으로 보아 살충물질이 박 테리아의 체외로 분비되는 것으로 사료된다. 또한 종별로 균 체 성장 시간에 따라 그 살충성을 비교해 보면, XR-PC 및 XR-MK가 살충성이 가장 우수하였고 대분분의 종이 배양 1-2일째 대수증식기 초기에 살충 활성이 가장 높게 나타났으 며 그 이후에는 점차 살충성이 감소되었다.
Figure 2는 곤충병원성 선충으로부터 각각 분리된 공생박 테리아 배양상등액의 단백질 분해효소의 활성을 비교한 것이다. XR-DR와 HE-HY을 제외한 5종류의 공생박테리아는 모두 배양 1일째부터 7일째까지 거의 일정하게 protease 활성이 나타났다. XR-DR 은 특이적으로 균체의 성장에 비례하여 protease 활성도 증가하여 배양 3일째에 다른 종에 배해 약 4.
분리된 공생박테리아의 종별 배양특성, 살충특성, 단백질 분해 효소의 활성및 지방산 함량 등이 조사되었다. XR-PC 및 XR-MK의 성장및 살충성이 가장 우수한 것으로 나타났으며 대수증식기 초기에 살충성이 가장 높은 반면에, 시간이 지남에 따라 살충성도 점차 감소되었다. 이 살충성은 protease 역가와 직접 관련이 없었으나 XR-DR 의 경우 다른 종에 비해 배양 3일째약 4.
Table [은 Steinernemas glaseri 곤충병원성 선충으로부터 분리된 공생박테리아인 XR-DR과 XR-MK。)] 대한 95개 탄소 원에 대한 산화능을 나타낸 것이다. 공생박테리아 XR-DR을 95개 탄소원을 이용한 Biolog 동정시스템을 사용하여 내장된 566종속의 그람 음성균의 database와 비교한 결과, XR-DRe 유사도 0.834로 Xenorhabdus nematophilusS- 그리고 XR-MK 또한 유사도 0.728로 X. nematophilus로. 거의 동일한 균주에 속하는 것으로 나타났다.
공생박테리아의 지방산 함량은 선충의 증식력, 보관력 및 살충성에 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있으며(14), 또한 박테리아 종의 동정에도 이용된다<20). 공생박테리아의 지방산 함량에 관한 결과(Table 4)를 살펴보면 7종류의 공생 박테리아 중 특히 XR-PC는 10:0, 12:0, 16:1 cis 5, 18:1 cis 7, 17:0 cyclo, 19:0 cyclo cis 8의 함량비에서 다른 종류의 공 생박테리아와 차이를 나타내었으며, 또한 HE-HY의 경우에서 는 12:0, 14:0, 18:0, 13:0 iso, 15:0 iso, 17:0 iso, 16:1 cis 5, 17:1 cis 7 iso, 17:0 cyclo의 함량비에서 다른 종류의 공생박 테리아와 차이를 나타내었다. 또한 XR-M0 및 XR-MK의 경 우에서도 15:0의 함량비에서 다른 종류의 공생박테리아와 구 별되었다.
거의 동일한 균주에 속하는 것으로 나타났다. 그러나 탄소원별 산화능은 7-hydroxybutyric acid외 glycyl-L-aspartic acid에 대해 뚜렷한 차이를 보였으며 glycogen, tween80, m-inositol, D-psicose, D-glucuronic acid 등의 12종 이상의 carbon source에 대해 서로 다른 산화능을 보이는 것으로 보아 X. nematophilus5] subspecies는 서로 다른 것으로 추정된다.
기존의 알려진 Xeaorhabdus속의 지방산 성분 및 함량(21) 과 비교해 볼 때 전체적인 지방산 성분과 함량비는 유사하였 으나 그 중 X. nematophilus17:0 cyclo의 함량비에 있어서 본 연구에 사용된 공생박테리아는 약 4-15%인 반면 기존에 알 려진 X. nematophilus는 27.7% 정도로 본 실험에 사용된 공 생박테리아가 적은 함량비를 나타내는 것으로 확인되었다. 일반적으로 Enterobacteriaceae 는 hydroxy 와 branch 지방산을 함유 하지 않는 특성(22)이 있는 반면 공생박테리아 Xenorhabdus 속은 그렇지 않은 특징이 있다.
분리된 공생박테리아의 종별 성장곡선을 비교하기 위하여 시간별로 배양액을 채취한 후 1:50 희석하여 560 nm에서 흡 광도를 측정한 결과를 Figure 1에 나타내었다. 대부분의 종이 배양 4일째에 최대 균체 성장을 나타내었으며 이후는 정지기 로 접어들었으나 5% YS 배지에서 XR-PC 및 XR-MK가 비교적 가장 빨리 성장하는 것으로 나타났다. 대수증식기에서 specific growth rate는 XR-MK와 XR-PC가 각각 0.
Table 3에서 보는 바와 같이 공생박테리아의 배양 상 등액만 접종하여도 XR-MO와 XR-LC를 제외하고는 모두 72 시간 이내에 유충을 사멸시키는 것으로 보아 살충물질이 박 테리아의 체외로 분비되는 것으로 사료된다. 또한 종별로 균 체 성장 시간에 따라 그 살충성을 비교해 보면, XR-PC 및 XR-MK가 살충성이 가장 우수하였고 대분분의 종이 배양 1-2일째 대수증식기 초기에 살충 활성이 가장 높게 나타났으 며 그 이후에는 점차 살충성이 감소되었다. 물론 분리된 공 생박테리아 7종에 대해 유충 당 수십에서 수백 마리 정도의 공생박테리아를 접종하였을 때에도 48시간 이내에 유충을 사 멸시키는 것을 확인하였다{data not shown).
또한 종별로 균 체 성장 시간에 따라 그 살충성을 비교해 보면, XR-PC 및 XR-MK가 살충성이 가장 우수하였고 대분분의 종이 배양 1-2일째 대수증식기 초기에 살충 활성이 가장 높게 나타났으 며 그 이후에는 점차 살충성이 감소되었다. 물론 분리된 공 생박테리아 7종에 대해 유충 당 수십에서 수백 마리 정도의 공생박테리아를 접종하였을 때에도 48시간 이내에 유충을 사 멸시키는 것을 확인하였다{data not shown). HE-HY종의 경우는 배양 3일 이후에 살충 활성이 나타났으나 이 경우에도 공 생박테리아의 대수증식기 초기단계에서 살충물질을 분비하는 것으로 보인다.
일반적으로 Enterobacteriaceae 는 hydroxy 와 branch 지방산을 함유 하지 않는 특성(22)이 있는 반면 공생박테리아 Xenorhabdus 속은 그렇지 않은 특징이 있다. 본 연구에서 분리된 공생박 테리아의 경우에서도 hydroxy와 branch 지방산을 전체 지방 산의 약 2-15% 정도까지 함유하는 것으로 확인되었다. 특히 HE-HY 의 경우 branch 지방산을, XR-LC 의 경우 hydroxy 지 방산을 비교적 많이 함유하는 것으로 나타났다.
XR-PC 및 XR-MK의 성장및 살충성이 가장 우수한 것으로 나타났으며 대수증식기 초기에 살충성이 가장 높은 반면에, 시간이 지남에 따라 살충성도 점차 감소되었다. 이 살충성은 protease 역가와 직접 관련이 없었으나 XR-DR 의 경우 다른 종에 비해 배양 3일째약 4.5배의 최대 활성을 보였다. 그러나 HE-HY의 경우 균체의 성장에 비례하여 protease 역가도 계속 증가하였다.
그리고 같은 계통의 Stenernema g/ase”에서 분리된 공생박테리아인 XR-DR, XR-MK 및 XR-NC의 경우에서도 약간 다른 차이를 나타내었다. 이들 세종의 공생박테리아의 지방산 함량을 분석한 결과 XR-MK가 12:0, 15:0, 15:0 iso 15:0 iso 3OH의 지방산에서 다른 2종에 비해 큰 차이를 보 였으며 같은 계통의 선충에서 분리한 공생박테리아 간에도 지방산 함량에 차이를 나타내었다.
그러나 HE-HY의 경우 균체의 성장에 비례하여 protease 역가도 계속 증가하였다. 지방산 함량의 경우 특히 공생박테리아의 종별로 12:0, 14:0, 16:1 cis 5, 17:0 cyclo에서 지방산 함량의 차이를 크게 나타내었으며 hydroxy와 branch 지방산이 전체 지방산의 약 2-15%까지변화하는 것으로 나타났다.
후속연구
또한 선충 배양시 공생박테리아 역시 인공증식 배지의 조성 이나 온도에 의해서 포화지방산과 불포화지방산 등의 함량에 차이를 나타내고 있으며, 또한 이로 인해 선충의 살충성, 증식력 및 보관에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (15). 그러나 곤충병원성 선충과 공생박테리아의 상호작용기작 및 지방산 성분과의 관계에 대한 자료는 미흡한 실정이며, 추후 이에 대한 연구가 더 수행되어야 할 것으로 사료된다.
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