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- 0 was 100%. (B) Effect of temperature on catechol 1, 2-dioxygenase activity. The relative activity was calculated as the activity at 35°C was 100%.
제안 방법
- Pseudomonas arvilla 이에서 32 kDa와 30 kDa의 동형 이합체를 이루고 있는 Cl, 20 에 대한 정체와 특성조사가 보고된 바 있고(9), Acinetobacter calcoaceticus에서 C1, 2O의 기질에 대한 특이성과 면역학적 기법을 이용한 연구가 진행되었다(17). 사용되는 기질에 따른 C1, 2O의 발현 양상을 알아보기 위하여, 탄소원으로 phenol과 benzoate 를 이용하여 배양한 Acinetobacter redfo-resWens에서 다른 종류 의 C1, 20를 분리하였고(6), 또한 여러 종류의 다른 기질에서 발 현되는 단백질을 관찰하기 위해서 2-D 전기영동 방법을 사용하여 발현 단백질의 현상을 규명하였다(16). C1,2O와 관련하여 많 은 연구가 그람 음성 세균 중심으로 진행되어왔으며, 최근에는 그람 양성 세균에서도 연구결과가 보고되고 있다.
- 본 연구에서는 Acineto-bacter sp. KS-1 에서 분리 정제된 Cl, 20에 대하여 다양한 환경조건과 기질에 따른 활성도를 측정하였고, 이 효소의 특성과 저해 요소를 조사하였다. 또한 아미노산 서열분석과 MALDI-TOF 이용한 아미노산 분자량 분석을 통하여 다른 세균들이 가지고 있는 C1, 2O와 비교 분석하였으며, 분석된 아미노산서열로부터 조작된 primer를 사용하여 C1, 20의 암호화하는 유전자를 증폭하였으며 , 유전자 서열분석과 cloning 기법을 통한 Acinetobacter sp.
- 효소 분리를 위하여 배양된 Acinetobacter sp. KS-1 를 분광광 도계 (Beckman DU7500 UV-vis spectrophotometer, Beckman, Palo Alto, USA)를 이용하여 600nm에서 O.D.가 1.0 일 때 250ml의 원심분리 튜브에 넣고 12,000 X g에서 20 분동안 원심분리를 실시하였으며, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액으로 3회 세척하였다. 준비된 세포를 French pressure (SLM FA-078, SLM Aminco, Urbana, USA)를 이용하여 파쇄하였다.
- 5 M로 증가시키면서 2ml/min의 유속으로 용액을 용출하였다. 용출액은 C1, 2O의 활성이 있는 부분을 모아서 단백질 정량을 실시하고, 다시 FPLC (Pharmacia, Uppsala, Sweden)의 HR5/5 MonoQ 컬럼 (0.25 X 5cm)에 주입하였다. 단백질은 유속 0.
- 표지 단백질은 prestained SDS-PAGE Standard (Bio-Rad, Hercules, USA)를 사용하였다. 전기영동은 stacking gel에서는 60V, 30분간 전기영동을 실시하였고, separating gel에서는 100V, 2시간 전기영동을 실시하였다. 전기 영동이 끝난 gel은 Coomassie brilliant blue R-250으로 염색을 한 후 탈염색은 40% methanol과 10% acetic acid가 함유된 용액에서 3회 실시하였다.
- 0)에 10μl의 100 mM catechol, 그리고 효소 정제 과정을 통하여 분리된 시료를 10μl 첨가하여 260nm에서 측정하였다. 반응 산물인 cis.cis- muconate의 몰 흡광계수 (molar extinction coefficient)는 19, 000 M-1cm-1 이며, 1 unit를 24°C에서 분당 1 μ mole의 cis, cis-muconate 을 생산하는 효소량으로 정하고, 고유활성 (specific activity)은 unit/mg로 정하였다. 기질 특이성을 알아보기 위해서 기질로 사용되는 여러 catechol 유사 기질인 3-methylcatechol, 4-methyl- catechol, 4-chlorocatechol, 4-nitrocatechol, 그리고 3-methoxy- catechol 을 같은 농도로 첨가하여 실시하였다.
- cis- muconate의 몰 흡광계수 (molar extinction coefficient)는 19, 000 M-1cm-1 이며, 1 unit를 24°C에서 분당 1 μ mole의 cis, cis-muconate 을 생산하는 효소량으로 정하고, 고유활성 (specific activity)은 unit/mg로 정하였다. 기질 특이성을 알아보기 위해서 기질로 사용되는 여러 catechol 유사 기질인 3-methylcatechol, 4-methyl- catechol, 4-chlorocatechol, 4-nitrocatechol, 그리고 3-methoxy- catechol 을 같은 농도로 첨가하여 실시하였다. pH에 의한 효소 활성 영향에 대한 실험은 pH 5.
- 0에서는 50mM의 Tris base 완충용액을 이용하여 측정하였다. 온도에 따른 효소 활성 변화에 대한 실험은 25-45°C 에서 효소를 catechol과 10 분간 반응시키고 0.4 N HCl 로 반응을 멈추게 한 후 260nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 활성의 억제제에 대한 실험에서는 억제제의 최종 농도가 0.
- 4 N HCl 로 반응을 멈추게 한 후 260nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 활성의 억제제에 대한 실험에서는 억제제의 최종 농도가 0.1 mM로 첨가한 후에 5분 동안 효소반응을 실시하였다.
- 5 ml TEN buffer를 더 첨가하고 10 ml의 phenol을 첨가하여 가볍게 섞어준다. 원심분리를 통하여 상등액을 취하여 phenol/chloroform/isoamyl alcohol 추줄을 2회, chloroform 추출은 1회 실시하였다. 상등액을 5 ml을 취하여 500 μl 3M sodium acetate와 15 ml absolute ethanol을 첨가하여 원심분리를 실시하였다.
- 침전된 염색체는 70% ethanol로 염류를 제거하고 다시 원심분리를 하여 공기중에서 ethanol을 제거하였다. 얻어진 침전물을 300 μl의 물에 녹인 후 분리 여부를 확인하기 위해서 0.8%의 agarose gel에 전기영동을 실시하였고, UV-spectrophotometer를 이용하여 정량하였다.
- 분리한 C1, 2O를 SDS-PAGE 상에서 전개하여 전개한 gel을 semidiy electroblotter (Bio-Rad, Hercules, USA)를 이용하여 18V, 20분간 polyvinyldifluoride (PVDF) 막 (Applied Biosy stems, Foster City, USA)에 옮긴 후 PVDF 막을 Coomassie blue R-250 용액으로 염색하였으며, 탈염색을 실시하여 염색된 단백질 부분을 잘라내었다. 잘라낸 PVDF 막을 단백질 자동 서열 분석기 Model 491A (Perkin Elmer, Foster City, USA)를 이용하여 아미노산 서열을 분석하였다. 여기서 얻어진 N-말단 서열은 NCBI의 BLAST search 프로그램에서 동정하였다.
- 2 M ammonium bicarbonate에 1 μg trypsin (Promega, Madison, USA)을 첨가하여 30°CC에서 24시간 동안 반응시켰다. 소화된 peptide 절편은 0.1% TFA (trifluoroacetic acid)가 함유된 60% acetonitrile에서 30분간 반응시켜 3회 추출하였다. 추출한 시료는 원심분리 진공 농축기 (Savant, GMI Inc.
- 1% TFA (trifluoroacetic acid)가 함유된 60% acetonitrile에서 30분간 반응시켜 3회 추출하였다. 추출한 시료는 원심분리 진공 농축기 (Savant, GMI Inc., Clearwater, USA) 에서 농축을 실시하였다. 농축된 시료를 0.
- , Clearwater, USA) 에서 농축을 실시하였다. 농축된 시료를 0.06% TFA 20μl에 녹이고, PE Brownlee (Norwalk, USA)사의 aquapore 018 컬럼 (2.1X300 mm)이 들어있는 172/140C HPLC (Perkin Elmer, Foster City, USA)를 이용하여 210 μl/min으로 60분 동안, acetonitrile 농도를 10-80%로 증가시켜 214nm에서 관찰하면서 잘려진 peptide를 분리하였다. 분리된 peptide는 Voyager DE- STR MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser De-sorption Ionization Time of Flight) Mass spectrometer (Per-Septive System, Framingham, USA)를 이용하여 분자량을 분석하였다.
- 1X300 mm)이 들어있는 172/140C HPLC (Perkin Elmer, Foster City, USA)를 이용하여 210 μl/min으로 60분 동안, acetonitrile 농도를 10-80%로 증가시켜 214nm에서 관찰하면서 잘려진 peptide를 분리하였다. 분리된 peptide는 Voyager DE- STR MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser De-sorption Ionization Time of Flight) Mass spectrometer (Per-Septive System, Framingham, USA)를 이용하여 분자량을 분석하였다.
- N-terminal 서열과 internal 서열을 통하여 얻어진 아미노산 서열로부터 degenerate primer를 합성하여 PCR (GeneAmp PCR system 9700, Perkin Elmer, Foster City, USA)을 실시하였다. Primer No.
- 6 units/mg을 나타냈다. 각 단계에서 분리해낸 효소 용액의 단백질 정량과 효소 활성 측정하여 표로 작성하였다(Table 1). 각 단계에서 얻어진 시료를 SDS-PAGE 상에 전 개하여 C1, 2O의 정제 여부를 확인하였고, 최종적으로 C1, 2O가 정제됨을 관찰하였다(Fig.
- SDS-PAGE로 분리한 C1, 2O를 트립신으로 처리하여 얻은 peptide를 170/140C HPLC를 이용하여 분리한 결과 여러 종류의 peptide 절편들을 분리하였다(Fig. 5). 흡광도 수치가 높은 trypsin-9, 11, 17을 선택하여, MALDI-TOF를 실시한 결과 분자량이 966.
대상 데이터
- 시료를 5분간 끊이고, 얼음에 식힌 후 주입하였다. 표지 단백질은 prestained SDS-PAGE Standard (Bio-Rad, Hercules, USA)를 사용하였다. 전기영동은 stacking gel에서는 60V, 30분간 전기영동을 실시하였고, separating gel에서는 100V, 2시간 전기영동을 실시하였다.
이론/모형
- 5 M로 증가시키면서 30분 동안 용출하였다. 용출액은 분취기로 0.5 ml씩 모아서 효소 활성측정을 통해 효소를 분리하였고 분리한 용액은 Bradford 방법(5)을 이용하여 단백질 정량을 실시하였다. 컬럼을 통해 분리된 C1, 2O는 Bollag 등(4)의 방법을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하였다.
- 5 ml씩 모아서 효소 활성측정을 통해 효소를 분리하였고 분리한 용액은 Bradford 방법(5)을 이용하여 단백질 정량을 실시하였다. 컬럼을 통해 분리된 C1, 2O는 Bollag 등(4)의 방법을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하였다. Separating gel 은 12%의 acrylamide gel을 사용하였고, stacking gel은 5%의 acrylamide gel을 사용하여 전개하였다.
- Separating gel 은 12%의 acrylamide gel을 사용하였고, stacking gel은 5%의 acrylamide gel을 사용하여 전개하였다. 시료는 Bradford 방법으로 단백질 정량을 실시하여 동일량의 단백질을 주입하였고, IX sample buffer로 양을 맞추었다. 시료를 5분간 끊이고, 얼음에 식힌 후 주입하였다.
- Catechol 1, 2-dioxygenase (Cl, 2, 0)의 활성 즉정은 cis, cis- muconate의 생성에 의해 측정되는 Aoki 방법(2)에 의해서 실시되었다. 2 ml의 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.
성능/효과
- Crude extract 상태의 효소 용액을 30-50%의 ammonium sulfate 침전을 통하여 단백질의 양을 절반으로 줄였고, C1, 20의 등전점이 낮은 pH에서 나타나는 것으로 알려져 음이온 교환체인 DEAE-sepharose와 MonoQ 크로마토그래피를 거쳤고 최종적으로 얻어진 효소는 crude extract에 비하여 20배 이상 농축된 것으로 나타났다. 최종적으로 분리한 효소는 회수율이 2.
- Crude extract 상태의 효소 용액을 30-50%의 ammonium sulfate 침전을 통하여 단백질의 양을 절반으로 줄였고, C1, 20의 등전점이 낮은 pH에서 나타나는 것으로 알려져 음이온 교환체인 DEAE-sepharose와 MonoQ 크로마토그래피를 거쳤고 최종적으로 얻어진 효소는 crude extract에 비하여 20배 이상 농축된 것으로 나타났다. 최종적으로 분리한 효소는 회수율이 2.3%로 나타났고, specific activity는 12.6 units/mg을 나타냈다. 각 단계에서 분리해낸 효소 용액의 단백질 정량과 효소 활성 측정하여 표로 작성하였다(Table 1).
- 각 단계에서 분리해낸 효소 용액의 단백질 정량과 효소 활성 측정하여 표로 작성하였다(Table 1). 각 단계에서 얻어진 시료를 SDS-PAGE 상에 전 개하여 C1, 2O의 정제 여부를 확인하였고, 최종적으로 C1, 2O가 정제됨을 관찰하였다(Fig. 1). 그리고 C1, 2O의 분자량이 약 36kDa임을 확인하였다.
- 7%)을 기질로 이용하였지만 3-methylcatechol, 4-chlorocatechol, 4-nitrocatechol, 3-methoxycatechol 등을 기질로 이용하지 못하였다(Table 2). Benzoate 상에서 배양하여 얻은 C1, 2O는 특정 기질에 대해서만 활성을 갖는 것으로 나타났고, pH와 온도에 안정한 것으로 나타났다. pH와 온도가 C1, 2O의 활성에 미치는 영양에 대한 조사에서는 pH 5.
- Benzoate 상에서 배양하여 얻은 C1, 2O는 특정 기질에 대해서만 활성을 갖는 것으로 나타났고, pH와 온도에 안정한 것으로 나타났다. pH와 온도가 C1, 2O의 활성에 미치는 영양에 대한 조사에서는 pH 5.0에서는 활성이 전혀 나타나지 않았고, pH 6.5이상에서 효소의 활성이 나타나기 시작하여 pH 8.0에서 최고의 활성을 나타내었고, 적정 pH는 7.5-9로 나타났다(Fig. 2). 적정 온도는 35°C로, 온도가 37°C 이상으로 증가하면 활성은 급격히 감소하여 40°C 이상에서는 활성이 30% 이하로 낮아졌다.
- 적정 온도는 35°C로, 온도가 37°C 이상으로 증가하면 활성은 급격히 감소하여 40°C 이상에서는 활성이 30% 이하로 낮아졌다. A. calcoaceticus ADP1 Cl, 20는 본 실험 결과와 유사하게 pH는 7- 9, 온도는 35-37°C에서 효소의 적정 활성이 나타났다. A.
- calcoaceticus ADP1 Cl, 20는 본 실험 결과와 유사하게 pH는 7- 9, 온도는 35-37°C에서 효소의 적정 활성이 나타났다. A. radioresistetis를 phenol과 benzoate에서 각각 배양하여 효소의 발현 양상과 효소의 특성에 연구에 대한 결과를 보면, phenol에서 배양하였을 경우에는 isoA가 90% 이상 발현되었고, benzoate 상에서는 isoA와isoB의 비율이 40:60으로 나타났다. isoA와 IsoB 는 42〜47。(2의 높은 온도에서도 활성을 나타났고, pH 6에서 안정한 활성을 나타내었다(6).
- radioresistens Cl, 20는 Acinetobacter sp. KS-1 에 비해 높은 온도와 낮은 pH에서 최대 활성을 나타내는 것으로 나타났다. Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13259의 경우는 catechol, 3- methylcatechol, 4-methylcatechol 에 대해 활성을 가지며 적정 pH가 9로 나타났으며, Pseudomonas putida Cl은 catechol 과 4-methylcatechol에만 활성을 나타내는 것으로 보고된 바 있다(19).
- 금속에 의한 C 1, 20의 효소활성 억제에 대한 조사에서 Hg+, Ag+, Cu2는 Cl, 20에 대하여 각각 10%, 7%, 40% 정도로 효소 활성이 저해되는 것으로 나타났지만, Fe3+에 의해서는 억제되지 않았다. C1, 2O는 구조 내에 철(II)를 포함하고 있기 때문에 기질과의 반응 시에 철이 조효소의 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (7, 18).
- C1, 2O는 구조 내에 철(II)를 포함하고 있기 때문에 기질과의 반응 시에 철이 조효소의 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (7, 18). 본 실험에서도 철 이온은 효소의 활성에 영향을 주지 않거나 효소의 활성을 증가시키는 것으로 나타났다(Fig. 3). Achro- mobader gr.
- 분리한 Cl, 20를 아미노산 염기 서열 분석기를 통하여 N-말단 으로부터 분석한 아미노산 서열은 'MNYQQIDALVKQMN- VDTAKG20로 나타났다. 분석된 아미노산 서열을 BLAST search 프로그램에서 검색한 결과 A. radioresistens의 C1, 2O와는 95%, A. calcoaceticus의 C1, 2O와 75% 그리고 A. calcoaceticus ADP1 Cl, 20와는 20%의 유사성이 있는 것으로 나타났다. Acinetobater 에 속하는 균주들의 C1, 2O와 많은 유사성이 있는 것으로 나타났다.
- calcoaceticus ADP1 Cl, 20와는 20%의 유사성이 있는 것으로 나타났다. Acinetobater 에 속하는 균주들의 C1, 2O와 많은 유사성이 있는 것으로 나타났다. N-말단에서 분석된 20개의 아미노산 서열은 A.
- 5). 흡광도 수치가 높은 trypsin-9, 11, 17을 선택하여, MALDI-TOF를 실시한 결과 분자량이 966.3 Da ('SQSDFNLRR9), 2081.7 Da ('TIEGPLYVAGA- PESVGFAR19), 1933.8 Da (EGNRPSHVHYFVSA-PGYR18)으로 각각 확인되었다. A.
- KS-1 Cl, 20에서 얻어진 peptide fragment와 동일한 분자량의 peptide fragment를 확인하였다(8). N-말단과 내부 서열 분석을 통하여 분석한 결과 A. redioresistens Cl, 20와 상당 부분에서 일치하는 것으로 확인되었다.
- 본 실험에서 benzoate를 기질로 하여 배양된 Acinetobacter sp. KS-1 에서 생산된 Cl, 20를 분리 정제하여 물리화학적 특성 규명하였으며, 이를 통하여 C1, 2O는 지금까지 다른 세균에서 보고된 C1, 2O의 특성과 매우 유사함이 밝혀졌다. Caposio 등(8)이 보고한 A.
- radioresistens의 C1, 20에서의 N-말단 서열 분석 연구는 본 연구에서 수행된 Acinetobacter sp. KS-1 의 Cl, 20에서 N-말 단 서열을 분석 결과와 유사성이 높은 것으로 확인되었으며, MALDI-TOF를 이용한 내부 서열 분석에서도 서열이 일치하는 것으로 분석되었다. A.
후속연구
- 6). 증폭된 결과는 A. radioresistens에서 분리된 C1, 2O의 DNA 서열로부터 예상되는 절편의 크기가 일치하는 것으로 나타났고(8), PCR로 얻어진 절편은 유전자 서열분석을 통하여 좀 더 많은 균주들과의 유사성을 분석하고, Southern blotting에서 Cl, 20를 암호화하는 유전자를 찾는 probe로 이용될 것으로 기대된다.
- 향후 본 연구에서 얻어진 결과를 바탕으로 기질의 종류에 따라 Acinetobacter sp. KS-1 에서 다르게 발현되는 Cl, 20의 패턴과 관련 유전자의 분자생물학적 특성 규명 실험이 진행될 것이다.
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