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문제 정의
- C. tropicalis에 의한 xylitol의 생산에서 고농도의 세포를 얻기 위해서는 초기 배지의 glucose 농도가 높아야 하는데, 높은 glucose 농도에서는 충분히 산소가 공급되어도 ethanol이 높은 농도로 생성되므로 ethanol의 생성을 최소화시키고 높은 세포농도를 얻기 위한 세포 배양법에 대한 연구를 수행하였다.
- 반면에 산소 공급이 제한되면 효모의 성장이 억제되고 결과적으로 xylitol 생산량도 감소한다. 따라서 xylitol 생산에서 용존산소량의 조절은 산화-환원 반응속도의 평형을 xylitol이 축적되는 방향으로 유도하여 높은 수율로 xylitol을 생산하기 위해서 필수적인데, 낮은 농도로 용존산소량을 조절하는 것이 어려워서 production-stage 동안에 교반을 500 rpm으로 고정시키고 가장 적절한 통기조건을 찾기 위한 실험을 수행하였다. 이때 높은 농도의 xylitol를 생산하기 위하여 232.
제안 방법
- C. tropicalis ATCC 20336을 이용하여 높은 수율과 생산성으로 xylitol을 생산하기 위하여 glucose 배지에서 짧은 시간에 고농도로 세포를 배양한 후에 xylose를 첨가하여 xylitol로 전환하는 2단계 유가식 발효공정에 관한 연구를 수행하였다. Cell growth-stage에서의 배지공급 방법으로는 glucose가 모두 고갈된 후에 pH가 5.
- 7 이상이 되도록 하였다. Continuous feeding 방법은 당이 거의 소모되는 8시간 배양 후부터 feeding medium의 공급속도를 16 mL/h로 시작하여 매 시간 3 mL/h씩 증가하도록 하였다. Feeding medium은 glucose와 yeast extract를 분리하여 멸균하였다.
- Glucose 농도는 Glucose analyzer(YSI SIDEKICK, USA)를 이용하여 측정하였다. Xylose와 xylitol을 비롯한 모든 당과 당알콜의 농도는 carbohydrate analysis column (Waters, USA)을 이용하여 HPLC (Waters, USA)에서 RI detector로 측정하였다.
- Production-stage에서 xylose를 공급하는 시기마다 yeast extract가 10 g/L 또는 20 g/L이 되도록 powder 상태로 함께 공급하여 xylitol 발효를 수행하였다. 이때 mineral salts인 (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4는 yeast extract 내에 존재하는 양을 고려하여 공급된 양만큼을 빼고 공급함으로써 N-source와 phosphate, magnesium을 제외한 다른 영양소의 영향만을 검토하였다.
- 측정하였다. Xylose와 xylitol을 비롯한 모든 당과 당알콜의 농도는 carbohydrate analysis column (Waters, USA)을 이용하여 HPLC (Waters, USA)에서 RI detector로 측정하였다. 배양액 중의 에탄올 농도는 flame ionization detector를 이용한 gas chromatography (Hitachi Model 263-30, Japan)로 측정하였다.
- 그래서 pH-stat에 의한 배지공급 방법에 대하여 검토하였다. 즉 당이 모두 고갈되면 pH가 상승하는 것을 신호로 배지를 공급하는 방법으로서 pH가 5.
- 이는 배양액 내의 세포농도를 고려하지 않고 KLa를 측정했기 때문으로 사료된다. 그러나 xylitol의 수율과 생산성이 첫 번째 xylose의 첨가에 의한 결과가 두 번째 xylose를 첨가한 결과보다 더 우수하고, 두 번째 xylose의 첨가 후에 xylose의 소비가 점차로 느려지는 것으로 보아 xylitol의 수율 및 생산성 향상을 위해서는 용존산소량보다도 특정한 영양소가 요구된다고 판단되어 yeast extract의 첨가에 대한 영향을 검토하였다.
- 따라서 production-stage에서 초기 xylose 농도 150 g/L에 대한 mineral salts의 첨가 농도를 최적화 하기 위하여 2 g/L (NH4)2SO4, 1 g/L K2HPO4, 0.2 g/L MgSO4· 7H2O를 분말상태로 발효기간동안에 1, 2, 3회 첨가하면서 실험을 수행하였다. 실험결과(Table 2)에서 최종 세포농도와 production-stage 동안에 xylose를 탄소원으로 이용한 것에 대한 균체의 수율은 mineral salts의 첨가회수(첨가량)가 증가할수록 감소한 반면, 최종 xylitol의 농도는 mineral salts의 첨가량이 증가할수록 증가하였다.
- 따라서 본 연구에서는 2단계 유가식 배양방법을 이용하여 cell growth-stage에서는 높은 농도의 세포성장과 낮은 농도의 ethanol 생성을 위한 glucose의 공급방법, yeast extract 농도를 최적화하고, production-stage에서는 xylitol 생성을 위한 mineral salts, 초기 xylose 농도, 통기조건 및 yeast extract의 영향을 검토하여 xylitol 생산을 위한 최적조건을 결정하였다.
- 또한 초기 xylose 농도의 증가에 따라 substrate inhibition으로 세포성장 속도는 감소하지만 xylitol의 생성은 균주에 따라 차이를 보인다(15, 17). 따라서 세포성장을 위한 유가식 배양에서 feeding medium의 공급이 끝난 시점에 xylose를 powder 형태로 100 g/L에서 300 g/L이 되도록 공급하였으며, mineral salts는 2 g/L (NH4)2SO4, 1 g/L K2HPO4, 0.2 g/L MgSO4 · 7H2O가 되도록 분말상태로 첨가하였다.
- 7 g/L를 얻을 수 있었다. 따라서 이후의 실험은 production-stage에서 교반과 통기를 각각 500 rpm과 0.5 vvm(이때의 KLa 값은 25.8 h-1 임)으로 하여 xylitol 발효를 수행하였다. 이러한 실험결과는 C.
- 0 vvm의 통기 조건에서 실험을 수행하였다. 또한 yeast extract에 대한 영향은 xylose 농도 150 g/L에 대하여 10 g/L(16 g)과 20 g/L(32 g)이 되도록 powder 형태로 첨가하여 실험을 수행하였다.
- Xylose와 xylitol을 비롯한 모든 당과 당알콜의 농도는 carbohydrate analysis column (Waters, USA)을 이용하여 HPLC (Waters, USA)에서 RI detector로 측정하였다. 배양액 중의 에탄올 농도는 flame ionization detector를 이용한 gas chromatography (Hitachi Model 263-30, Japan)로 측정하였다. 이때 사용한 column은 chromosorb W/AW (60-80 mesh)에 20% carbowax 20 M을 포화시킨 물질을 packing 한 2 mm × 2.
- 0 m stainless column을 이용하였다. 세포농도는 spectrophotometer(Shimadzu, Japan)로 620 nm에서 홉광도를 측정하여 흡광도와 건조균체량의 표준곡선에 의하여 건조균체량(g/L)으로 환산하였다. 이때 C.
- 발효를 수행하였다. 이때 mineral salts인 (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4는 yeast extract 내에 존재하는 양을 고려하여 공급된 양만큼을 빼고 공급함으로써 N-source와 phosphate, magnesium을 제외한 다른 영양소의 영향만을 검토하였다. 실험 결과(Table 4)에서 yeast extract의 첨가에 의하여 세포농도는 증가하였으나 xylitol의 수율과 생산성은 yeast extract# 10 g/L가 되도록 첨가하였을 때에 가장 우수하였다.
- 위한 유가식 배양이 요구된다. 이를 위한 유가식 배양에서 배지의 첨가방법으로 continuous feeding과 pH-stat를 검토하였다. Continuous feeding에 의한 유가식 배양은 회분식 배양에서 당이 거의 소모되는 8시간 이후부터 feeding medium을 공급하였다.
- 검토하였다. 즉 당이 모두 고갈되면 pH가 상승하는 것을 신호로 배지를 공급하는 방법으로서 pH가 5.68 이하가 되면 1N NaOH가 공급되고, 당이 고갈된 후 약간의 유기산 소모로도 pH 5.7 이상이 되면 feeding medium이 첨가 되도록 하였다. 실험결과(Figure 3)에서 초기 pH가 6.
- 3 L로 하였다. 초기 glucose와 yeast extract의 농도는 각각 15 g/L와 7.5 g/L이 되도록 하였으며, 세포배양을 위한 feeding medium은 468 g/L의 glucose와 180.8 g/L의 yeast extract가 포함된 300 mL의 배지를 모두 첨가하는 경우에 배양액의 최종 glucose와 yeast extract의 농도가 각각 100 g/L과 40 g/L이 되도록 하였다. 세포배양 동안의 용존산소량(D.
- 0 vvm과 500 rpm으로 고정시켜 microaerobic 상태로 용존산소량을 조절하였다. 초기 xylose 농도의 최적화 실험은 xylose가 100 g/L에서 300 g/L이 되도록 첨가하였으며, 최적의 초기 xylose 농도에 맞는 mineral salts에 대한 실험은 (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSQ4, ・7H2O를 powder 형태로 발효동안에 1~3회 첨가하였다. 통기조건에 대한 실험은 교반속도를 500 rpm으로 고정하고 0.
- 초기 xylose 농도의 최적화 실험은 xylose가 100 g/L에서 300 g/L이 되도록 첨가하였으며, 최적의 초기 xylose 농도에 맞는 mineral salts에 대한 실험은 (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSQ4, ・7H2O를 powder 형태로 발효동안에 1~3회 첨가하였다. 통기조건에 대한 실험은 교반속도를 500 rpm으로 고정하고 0.2, 0.5, 1.0 vvm의 통기 조건에서 실험을 수행하였다. 또한 yeast extract에 대한 영향은 xylose 농도 150 g/L에 대하여 10 g/L(16 g)과 20 g/L(32 g)이 되도록 powder 형태로 첨가하여 실험을 수행하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 Candida tropicalis ATCC 20336을 생명공학 연구소로부터 분양 받아 실험에 사용하였다.
- 세포의 배양은 3.3 L 발효조(Bioflo Ⅲ, NBS, USA)를 사용하였으며, initial working volume을 1.3 L로 하였다. 초기 glucose와 yeast extract의 농도는 각각 15 g/L와 7.
이론/모형
- 62 g/L · h의 세포 생산성을 얻을 수 있었다는 보고와 유사하였다. 따라서 production-stage의 연구를 위한 세포배양은 pH-stat에 의한 유가식 배양법을 이용하였다.
- 0 vvm의 통기로 시작하여 교반속도의 조절에 의하여 40%로 유지시켰다. 배양배지의 feeding 은 pH-stat 방법과 continuous feeding 방법을 사용하였다. pH-stat에서는 pH가 5.
성능/효과
- Mineral salts 중에 어떤 요소가 xylitol 생성에 효과가 있는지 알아보기 위하여 flask 배양을 통하여 검토한 결과 (NH4)2SO4, K2HPO4 그리고 MgSO4가 xylitol 생성에 positive effect를 보였다. 이는 (NH4)2SO4가 production-stage에서 질소원으로 이용이 가능하고, K2HPO4는 C.
- 5% 이하로서 microaerobic 상태였기 때문으로 사료된다. 그러나 두 번째 xylose의 첨가(2nd feeding)에서는 통기량의 증가에 따라 최종 세포 농도는 증가하였으나, 최대의 xylitol 농도는 0.5 vvm의 통기조건에서 131.7 g/L를 얻을 수 있었다. 따라서 이후의 실험은 production-stage에서 교반과 통기를 각각 500 rpm과 0.
- 반면에 연속식 배양에 의한 xylitol의 생산에서는 회분식 배양에서보다 높은 생산성을 얻을 수 있지만, 희석속도가 증가함에 따라 최종 xylitol의 농도가 감소하고, 희석속도를 낮게 하면 생산성이 낮아진다(4). 또한 최근에는 xylitol 수율을 향상시키기 위하여 XDH-defective mutant(5,6)와 XR 유전자가 주입된 재조합 Saccharomyces cerevisiae(7)에 의한 xylitol의 생산에서 수율은 95% 이상을 얻을 수 있었지만, 세포 내에서 XR의 활성유지와 co-factor인 NAD(P)H의 재생 및 기본 대사유지에 요구되는 co-substrate의 선택에 대한 문제로 최종 xylitol 농도가 약 100 g/L 정도이었다. 따라서 최근에는 유가식 배양에 의한 xylitol의 생산에 관한 많은 연구가 진행되고 있다.
- 생성은 감소한다. 반면에 산소 공급이 제한되면 효모의 성장이 억제되고 결과적으로 xylitol 생산량도 감소한다. 따라서 xylitol 생산에서 용존산소량의 조절은 산화-환원 반응속도의 평형을 xylitol이 축적되는 방향으로 유도하여 높은 수율로 xylitol을 생산하기 위해서 필수적인데, 낮은 농도로 용존산소량을 조절하는 것이 어려워서 production-stage 동안에 교반을 500 rpm으로 고정시키고 가장 적절한 통기조건을 찾기 위한 실험을 수행하였다.
- 이때 mineral salts인 (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4는 yeast extract 내에 존재하는 양을 고려하여 공급된 양만큼을 빼고 공급함으로써 N-source와 phosphate, magnesium을 제외한 다른 영양소의 영향만을 검토하였다. 실험 결과(Table 4)에서 yeast extract의 첨가에 의하여 세포농도는 증가하였으나 xylitol의 수율과 생산성은 yeast extract# 10 g/L가 되도록 첨가하였을 때에 가장 우수하였다. 즉 첫 번째 232.
- tropicalis의 세포성장과 xylitol 생성에 최적 질소원으로 알려졌기 때문이다. 실험결과(Figure 1)에서 glucose는 18시간 동안에 모두 소비되었고, pH는 초기 6.3에서 13시간 배양 후에 3.7까지 낮아졌다. 최대 세포농도는 40 g/L 이었으며, 이때 세포 수율은 0.
- Continuous feeding에 의한 유가식 배양은 회분식 배양에서 당이 거의 소모되는 8시간 이후부터 feeding medium을 공급하였다. 실험결과(Figure 2)에서 feeding medium은 10시간 동안에 모두 공급되었고, 총 배양시간은 18시간이었으며, 최대 세포농도는 42.4 g/L이었다. 이때의 세포 수율은 0.
- 실험결과(Table 1)에서 초기 xylose 농도가 100 g/L인 경우에 xylitol 수율은 60%로 xylose 농도 150 g/L에서의 57% 보다 높았으나 xylitol의 최종 농도와 생산성은 150 g/L에서 각각 86.7 g/L 과 2.06 g/L ·h로 가장 높았다. 이러한 결과는 Gong 등(18)이 C.
- 2 g/L MgSO4· 7H2O를 분말상태로 발효기간동안에 1, 2, 3회 첨가하면서 실험을 수행하였다. 실험결과(Table 2)에서 최종 세포농도와 production-stage 동안에 xylose를 탄소원으로 이용한 것에 대한 균체의 수율은 mineral salts의 첨가회수(첨가량)가 증가할수록 감소한 반면, 최종 xylitol의 농도는 mineral salts의 첨가량이 증가할수록 증가하였다. 즉 mineral salts의 첨가에 의하여 세포의 성장은 억제된 반면에 xylitol의 생성은 촉진되었다.
- 실험결과(Table 3)에서 첫 번째 xylose의 첨가(1st feeding)에서는 통기조건에 대하여 세포성장과 xylitol 생산에 큰 차이가 없었다. 이러한 이유는 용존산소량이 모든 실험에서 0.
- 실험 결과(Table 4)에서 yeast extract의 첨가에 의하여 세포농도는 증가하였으나 xylitol의 수율과 생산성은 yeast extract# 10 g/L가 되도록 첨가하였을 때에 가장 우수하였다. 즉 첫 번째 232.5 g의 xylose를 첨가한 경우에 배양액의 volume은 1.58 L이고 xylitol 농도는 108.1 g/L이 되어 수율과 생산성은 73.8%와 3.26 g/L ·h이었고, 두 번째 232.5 g의 xylose를 첨가한 경우에 배양액의 부피가 1.67 L이 되었고 193 g/L의 xylitol 농도를 얻었으며 수율은 69.7%로 감소하였지만, 생산성은 3.55 g/L·h로 증가하였다(Figure 5). 이것은 전체 발효기간 중에서 세포성장을 위한 시간이 감소하였기 때문이다.
- 49 g/L ·h이었다. 최대 ethanol 농도는 15.5 g/L로 회분식 세포배양보다 50% 정도 감소하였지만, 여전히 높은 농도로 축적됨을 알 수 있었다. Glucose 농도는 배지의 공급시기부터 0.
- 효모에 의한 xylose의 대사과정에서 과량의 산소가 공급되면 NADH/NAD+의 비율이 감소하여 생성된 xylitol의 많은 부분이 xylulose로 전환되고, 그 결과 효모의 성장속도는 증가하지만 xylitol 생성은 감소한다. 반면에 산소 공급이 제한되면 효모의 성장이 억제되고 결과적으로 xylitol 생산량도 감소한다.
후속연구
- 이러한 결과는 보고된 문헌 중에 cell recycle fed-batch(ll)에서의 생산성보다는 약간 낮았지만, Oh 등(10)과 Kim 등(14)이 유가식 배양에서 얻은 생산성과는 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 결론적으로 N-source와 phosphate, magnesium 외에도 yeast extract 내에는 xylitol 생성에 큰 영향을 미치는 영양요소가 있다고 판단되어 현재 이 영양소의 탐색에 관한 연구가 수행 중이다.
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