중합도 n$\leq$10을 갖는 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)을 미생물 Serratia marcesce-ns QM B14f6의 최소배지 회분식 발효를 이용하여 키틴 및 키토산을 분해하는 효소 키티나제(1.5 unit/mL) [키토바이아제(3.48 unit/mL)가 포함됨]를 생성시킨다. 효소 반응에 의한 키토올리고당의 생성 활성을 규명하기 위하여 부분적으로 탈아세틸화된 키토산을 효소적 가수분해 반응시킴으로써 생성된 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루코사민의 키토올리고당의 생성 패턴을 확인 조사한다. 이 혼합 올리고머로부터 CM-Sephadex의 컬럼 크로마토그래피에 의하여 당별로 분획시켜 추출한 헤테로 키토 올리고당들을 각각 N-아세틸화하고 이 최종 생성물을 전기투석 장치로서 정제하여 키토올리고 1-7당을 제조하였다. 부분적으로 탈아세틸화 키토산(환원당으로서 2697 mg/mL)을 효소반응에 의해 생성시킨 키토올리고당은 1당으로서 GlcNAc=4.25%, 2당 $(GlcNAc)_2$=4.49%, 3당 $(GlcNAc)_3$=11.1%, 4당 $(GlcNAc)_4$=2.5%, 5당 $(GlcNAc)_{5}$ =0.64%, 6당$(GlcNAc)_{6}$=2.12%, 7당 $(GlcNAc)_{7}$=1.21%가 각각 제조되었다.
중합도 n$\leq$10을 갖는 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)을 미생물 Serratia marcesce-ns QM B14f6의 최소배지 회분식 발효를 이용하여 키틴 및 키토산을 분해하는 효소 키티나제(1.5 unit/mL) [키토바이아제(3.48 unit/mL)가 포함됨]를 생성시킨다. 효소 반응에 의한 키토올리고당의 생성 활성을 규명하기 위하여 부분적으로 탈아세틸화된 키토산을 효소적 가수분해 반응시킴으로써 생성된 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루코사민의 키토올리고당의 생성 패턴을 확인 조사한다. 이 혼합 올리고머로부터 CM-Sephadex의 컬럼 크로마토그래피에 의하여 당별로 분획시켜 추출한 헤테로 키토 올리고당들을 각각 N-아세틸화하고 이 최종 생성물을 전기투석 장치로서 정제하여 키토올리고 1-7당을 제조하였다. 부분적으로 탈아세틸화 키토산(환원당으로서 2697 mg/mL)을 효소반응에 의해 생성시킨 키토올리고당은 1당으로서 GlcNAc=4.25%, 2당 $(GlcNAc)_2$=4.49%, 3당 $(GlcNAc)_3$=11.1%, 4당 $(GlcNAc)_4$=2.5%, 5당 $(GlcNAc)_{5}$ =0.64%, 6당$(GlcNAc)_{6}$=2.12%, 7당 $(GlcNAc)_{7}$=1.21%가 각각 제조되었다.
N-acetyl-D-glucosamine oligosaccharides [(GlcNAc)n] whose degree of polymer-ization is from one to ten (n=1-10) were fractionated by column chromatography on CM-Sephadex. Electro dialysis from a partially deacetylated chitosan hydrolysate prepared crudely with the N-acetyl-D-glucosaminidase(chitinas...
N-acetyl-D-glucosamine oligosaccharides [(GlcNAc)n] whose degree of polymer-ization is from one to ten (n=1-10) were fractionated by column chromatography on CM-Sephadex. Electro dialysis from a partially deacetylated chitosan hydrolysate prepared crudely with the N-acetyl-D-glucosaminidase(chitinase) and exo-N, N'-diacetylchito-biohydrolase(chitobiase) of Serratia marcescens QM B1466. Reducing sugar compositions and sequences of the N-acetyl-glucosamine oligosaccharides were identified by N-acetylation, randomly cleavage with chitinase and ego-splitting with chitobiase. N-acetyl-glucosamine heterochitooligosaccharides with glucosamine oligosaccharides, (GlcN)n at the reducing end residues together with $(GlcN)_1\sim(GlcN)_4$ were detected. Separation was accomplished by prefractionation with election by 0 to 1.0 M NaCl gradient solution. $(GlcNAc)_1 =4.25%,\; (GlcNAc)_2=4.49%,; (GlcNAc)_3=11.1%,\; (GlcNAc)_4=2.5%,$$$(GlcNAc)_{5}$=0.64%, $(GlcNAc)_{6}$=2.12% and $(GlcNAc)_{7}$=1.21%, respectively, were crystallized after electrodialysis and lyophilization Each N-acetyl-D-glucosamine oligosaccharides content were detected by HPLC.
N-acetyl-D-glucosamine oligosaccharides [(GlcNAc)n] whose degree of polymer-ization is from one to ten (n=1-10) were fractionated by column chromatography on CM-Sephadex. Electro dialysis from a partially deacetylated chitosan hydrolysate prepared crudely with the N-acetyl-D-glucosaminidase(chitinase) and exo-N, N'-diacetylchito-biohydrolase(chitobiase) of Serratia marcescens QM B1466. Reducing sugar compositions and sequences of the N-acetyl-glucosamine oligosaccharides were identified by N-acetylation, randomly cleavage with chitinase and ego-splitting with chitobiase. N-acetyl-glucosamine heterochitooligosaccharides with glucosamine oligosaccharides, (GlcN)n at the reducing end residues together with $(GlcN)_1\sim(GlcN)_4$ were detected. Separation was accomplished by prefractionation with election by 0 to 1.0 M NaCl gradient solution. $(GlcNAc)_1 =4.25%,\; (GlcNAc)_2=4.49%,; (GlcNAc)_3=11.1%,\; (GlcNAc)_4=2.5%,$$$(GlcNAc)_{5}$=0.64%, $(GlcNAc)_{6}$=2.12% and $(GlcNAc)_{7}$=1.21%, respectively, were crystallized after electrodialysis and lyophilization Each N-acetyl-D-glucosamine oligosaccharides content were detected by HPLC.
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문제 정의
이 효소는 무정형 키틴과 결정성 키틴 두 가지 모 두를 가수 분해하는 활성을 갖고 있으며, 특히 결정성 키틴 에 대한 활성은 특수공정에서 요구되는 키틴의 처리과정을 줄일 수 있으므로 경제적으로는 매우 매력이 있다. 결정성 키틴을 기질로 하여 S. marcescens 균주의 고농도 세포발효 에 대한 연구와 효소 키티나제와 키토바이아제의 키틴성 소 재에 대한 효소적 가수분해 반응을 연구하였다.(23)
또한 p-nitrophenyl 유도체나 형광기질도 고감도의 측정 법으로서 속도론적량을 구하는데 사용되었다. 목적에 알맞게 생산될 수 있도록 부분적으로 탈아세틸화한 키토산의 여러 기질로부터 효소 반응시킴으로서, N-아세틸-D-글루코사민-올 리고당;(GlcNAc)璀 의 각 올리고당을 분리 추출하여 제조하고 또한 고도로 정밀한 정제된 제품을 얻는데 그 목적을 두 었다 그리고 경제적으로 저렴하게 올리고당을 제조하기 위하여 정제되지않은 효소 키티나제를 직접 반응시켰다.
본 연구에서는 키틴의 부분탈아세틸화도(75-99%)에 의존되어 변화되는 효소가수분해물의 생성올리고당에 영향을 미치는 키티나제의 기질특이성과 그 작용양식에 대하여 연구하였다. 효소 키티나제의 활성은 불용성의 기질로서 콜로이달 키 틴이, 가용성의 기질로서는 글리콜 키틴을 이용하였다.
제안 방법
75-99% 부분 탈아세틸화한 키토산의 키티나제(1.0 unit/mL)와 키토바이아제(3.48 unit/mL)에 의한 가수분해에서 생성된 키토올리고당들을 확인하기 위하여 효소 분해 생성물을 CM- Sephadex C-25 컬럼의 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 중합도와 글루코사민 잔기수로서 분리하였다. 전기투석[F1 本 旭化成社製 Micro Acilyzer-Gl 및 Aciplex cartridge(AC- 220-10) 을 사용하였다]된 가수분해 생성물(환원당으로 총 2697 mg) 을 0.
그러므로 부분 탈아세틸 화키토산을 가용성의 기질로 사용할 때의 가수분해속도와 그 기질에 대한 효소 키티나제의 작용활성의 규명이 요구된다. S. marcescens기원의 키티나제의 효소분해 생성물의 분리추출 과 정제시험을 행하였다. N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루코 사민으로 구성된 부분적으로 탈아세틸화한 키토산(partially 物:D-glucosamine(GlcN), O: W-acetyl-D-glucosamine(GlcNAc), 0: Reducing end residue (a) The condition of homogeneous composition between GlcNAc and GlcN (b) The composition is heterogeneous chain-from deacetylated 아litosan ; PDC)은 온도와 알카리 농도의 변화에 의존되어 키틴을 알카리 가수분해하여 여러가지 탈아세틸화 도를 갖는 키토산을 제조할 수 있다.
각 분획물에 따른 HPLC 분석에 의한 정성분석을 통하여 올리고당 사슬 구조를 분석하였다. 예로서 GlcNAc-GlcNAc- GlcN-GlcNAc 결합을 갖는 헤테로 올리고당의 경우 이것을 B -N-acetylglucosaminidase로서 분해 시 키 면 N- 아세 틸 글루코사 민과 Figure 5의 A-1 이 생성된다.
이와 같이 F-9에 이르는 분획 추출물은 nM10의 중합도를 갖는 것으로 추정될 수 있다. 각종 키토올리고 다당의 잔기 수는 N-아세틸화 공정을 통하여 헤테로 키토올리고당 잔기중의 D-글루코사민을 N-아세틸-D-글루코사민으로 변환하여 호 모 다당을 제조한 후에 HWLC에 의하여 분석하여 결정하였다.
성장-제한 양분에 대한 시험을 위하여 아미노산 이나 비타민 또는 인, 황 및 질소원 그리고 Mg, Co, Fe 등과 같은 소량의 금속양분을 첨가하였다. 기본 배지조성의 농도 는 glucose 또는 결정성 키틴의 탄소원의 농도에 관계시켜 설정하여 회분배양과 고밀도발효에 함께 적용하였다. Table 1에 배양과 발효에 적합시킨 배지조성을 나타내었다.
효소 키티나제의 활성은 불용성의 기질로서 콜로이달 키 틴이, 가용성의 기질로서는 글리콜 키틴을 이용하였다. 기질 에따른 효소활성과 효소반응후 유리되는 환원당량을 정량하였다. 또한 p-nitrophenyl 유도체나 형광기질도 고감도의 측정 법으로서 속도론적량을 구하는데 사용되었다.
6%로 500 mL를 제조한 효소 반응 혼합물을 37℃에서 48시간 반 응시킨 후 5분간 끓임으로서 반응을 정지하였다. 반응 혼합 물은 35℃이하에서 감압한 회전 증발기에서 농축시켰으며 전 기투석기(Micro Acilyzer Gl, Asahikasei kogyo Co., Ltd. Japan)에 의하여 투석하였다. 투석용액은 1 N acetic acid를 가하여 pH 6.
와 아주 유사하며 증식곡선(세대시간 3시간)도 거의 같은 모양 을 나타낸다. 성장-제한 양분에 대한 시험을 위하여 아미노산 이나 비타민 또는 인, 황 및 질소원 그리고 Mg, Co, Fe 등과 같은 소량의 금속양분을 첨가하였다. 기본 배지조성의 농도 는 glucose 또는 결정성 키틴의 탄소원의 농도에 관계시켜 설정하여 회분배양과 고밀도발효에 함께 적용하였다.
10 L 의 발효기에서 working volume 7 L를 30℃로 발효하였다. 용존산소(DO)는 공기유속 7.5 L/min와 교반속도 200 rpm에 의하여 20-30%로 유지하였으며 소포제로서 2% SIGMA antifoam C를 첨가하였다. 7일 배양후에 8000 rpm 15분간 원 심분리한 상층액을 효소용액으로 사용하였다.
효소 반응에 의한 키토올리고당의 생성 활성을 규명 하기 위하여 부분적으로 탈아세틸화된 키토산을 효소적 가수 분해 반응시킴으로써 생성된 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글 루코사민의 키토올리고당의 생성 패턴을 확인 조사한다. 이 혼합 올리고머로부터 CM-Sephadex의 컬럼 크로마토그래피에 의하여 당별로 분획시켜 추출한 헤테로 키토 올리고당들을 각각 N-아세틸화하고 이 최종 생성물을 전기투석 장치로서 정제하여 키토올리고 1-7당을 제조하였다. 부분적으로 탈아세 틸화 키토산(환원당으로서 2697 mg/mL)을 효소반응에 의해 생성시킨 키토올리고당은 1당으로서 GlcNAc=4.
48 unit/mL)에 의한 가수분해에서 생성된 키토올리고당들을 확인하기 위하여 효소 분해 생성물을 CM- Sephadex C-25 컬럼의 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 중합도와 글루코사민 잔기수로서 분리하였다. 전기투석[F1 本 旭化成社製 Micro Acilyzer-Gl 및 Aciplex cartridge(AC- 220-10) 을 사용하였다]된 가수분해 생성물(환원당으로 총 2697 mg) 을 0.02 M 아세테이트 완충용액(pH 5.0)으로 평형화시킨 컬 럼(2.6X45 cm) 상에서 분리추출시켰다.
키티나제 활성은 pH 6.0의 Mcllvaine 완충용액에 1.4 mL 의 0.2% 글리콜 키틴과 0.1 mL의 효소 용액을 포함하는 반 응 혼합물을 37℃에서 15분간 항온 시킨 후 측정하였다. 발 색 시약 용액은 0.
48 unit/mL)가 포함됨]를 생성 시킨다. 효소 반응에 의한 키토올리고당의 생성 활성을 규명 하기 위하여 부분적으로 탈아세틸화된 키토산을 효소적 가수 분해 반응시킴으로써 생성된 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글 루코사민의 키토올리고당의 생성 패턴을 확인 조사한다. 이 혼합 올리고머로부터 CM-Sephadex의 컬럼 크로마토그래피에 의하여 당별로 분획시켜 추출한 헤테로 키토 올리고당들을 각각 N-아세틸화하고 이 최종 생성물을 전기투석 장치로서 정제하여 키토올리고 1-7당을 제조하였다.
대상 데이터
HPLC계는 875-UV/VIS detector (Japan Spectroscopic Co. Ltd.)와 D-2500 Chromato-Integrator (Hitachi Ltd.)를 사용하였다. M 아세틸-。-글루코사민과 D-글루코사민키토-올리고머의 환원당은 분당 2.
본 실험실에서 탈아세틸화 공정을 통하여 제조된 75-99% 의 부분적으로 탈아세틸화된 키토산을 사용하였으며 분자사 슬의 심한 분해를 막기 위하여 증류수에 의한 간헐적 세척으 로 중성화시키면서 재탈아세틸화하여 제조하였다. 100%로 탈 아세틸화한 키토산은 알칼리 가수분해의 농도 및 온도와 반 응시간을 조절함으로써 제조될 수 있었다.
본 연구에서는 키틴의 부분탈아세틸화도(75-99%)에 의존되어 변화되는 효소가수분해물의 생성올리고당에 영향을 미치는 키티나제의 기질특이성과 그 작용양식에 대하여 연구하였다. 효소 키티나제의 활성은 불용성의 기질로서 콜로이달 키 틴이, 가용성의 기질로서는 글리콜 키틴을 이용하였다. 기질 에따른 효소활성과 효소반응후 유리되는 환원당량을 정량하였다.
이론/모형
기질 에따른 효소활성과 효소반응후 유리되는 환원당량을 정량하였다. 또한 p-nitrophenyl 유도체나 형광기질도 고감도의 측정 법으로서 속도론적량을 구하는데 사용되었다. 목적에 알맞게 생산될 수 있도록 부분적으로 탈아세틸화한 키토산의 여러 기질로부터 효소 반응시킴으로서, N-아세틸-D-글루코사민-올 리고당;(GlcNAc)璀 의 각 올리고당을 분리 추출하여 제조하고 또한 고도로 정밀한 정제된 제품을 얻는데 그 목적을 두 었다 그리고 경제적으로 저렴하게 올리고당을 제조하기 위하여 정제되지않은 효소 키티나제를 직접 반응시켰다.
부분적으로 탈아세틸화 키토-올리고당을 Barker et al. (26) 을 수식한 방법으로 N-아세틸화 하였다.
키티나제 활성 1 unit는 1 분간에 환원당 1 m이을 생성시키는 효소의 양으로 정의하였다. 유리된 환원당의 양은 N-아세틸-D-글루코사민의 표준시 약을 사용하고 Schales 법을 수식(25)한 방법으로 측정하였다.
성능/효과
이 효소는 엔도형의 작용양식에서 부분 N-아세틸키토 산을 분해하지만 GlcNAc-GlcNAc 사이와 GlcNAc-GlcN 사이를 절단하고 그의 분해생성물도 6아노머형이다. HPLC분석 에 있어서 F-1, 2, 3, 4, 5, 8, 9는 거의 균일하게 확인 될 수가 있으며 키토올리고당의 확인 분석에서는 F-2, 4, 6은 Exo-B 잉ucosaminidase에 의하여 완전히 가수분해되어 (GlcNAc)2이 최종산물이 되었고 F-3, 5, 9는 가수분해되어 최종생성물로 GlcNAc로만 검출되었다.
이 혼합 올리고머로부터 CM-Sephadex의 컬럼 크로마토그래피에 의하여 당별로 분획시켜 추출한 헤테로 키토 올리고당들을 각각 N-아세틸화하고 이 최종 생성물을 전기투석 장치로서 정제하여 키토올리고 1-7당을 제조하였다. 부분적으로 탈아세 틸화 키토산(환원당으로서 2697 mg/mL)을 효소반응에 의해 생성시킨 키토올리고당은 1당으로서 GlcNAc=4.25%, 2당 (G1cNAc)2=4.49%, 3당(G1cNAc)3=11.1%, 4당(G1cNAc)4=2.5%, 5당(G1cNAc)5=0.64%, 6당(G1cNAc)6=2.12%, 7당(G1cNAc)7=L21% 가 각각 제조되었다.
또한 세균성 질병들로부터 보호하는 중요한 역할과 키틴성 다당류분해를 포함한 그 외 의 공정들도 갖고 있다(16-19). 세균성 균주Serratia 속중에서 Serratia marcescens(20-22) QM B1466은 특수하게 키틴 존재 하에서 고도수준의 키틴성 분해효소가 생성됨이 밝혀졌다(약 1 mg/L). 이 효소는 무정형 키틴과 결정성 키틴 두 가지 모 두를 가수 분해하는 활성을 갖고 있으며, 특히 결정성 키틴 에 대한 활성은 특수공정에서 요구되는 키틴의 처리과정을 줄일 수 있으므로 경제적으로는 매우 매력이 있다.
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