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문제 정의
- 최근에는 우유에 부족한 비타민과 열처리에 의해 소실된 비타민을 보강하기 위해서 비타민류를 강화시킨 제품이 점차 증가하는 실정으로 비타민을 강화할 경우, 제품의 안전한 생산을 위해, 공정제어 및 품질관리를 위한 비타민의 정량 분석 방법에 대한 자료 축적 및 개발이 요구되는 상황이다. 따라서 이에 대한 연구가 필요할 것으로 생각되어, 본 연구에서는 UHT 살균에 따른 우유 중 수용성 비타민 5종(비타민 C, 비타민 Bi, 비타민 B2, 나이아신, folic acid)과 지용성 비타민 3종(비타민 A, 비타민 D& 비타민 E)의 함량 변화 및 강화제 첨가 방법에 따른 비타민 함량 변화를 HPLC를 이용하여 알아보고자 하였다. 특히 분석 방법의 경우 비타민 자체가 매우 불안정한 화합물이며, 산화되기 쉽고, 전처리 과정 중 쉽게 파괴되는 것을 고려하여, 수용성 비타민류는 일괄 분석하는 방법을 선택 하였다(Ball, 1994 ; P.
제안 방법
- 비타민 캡슐 약 2g을 500ml 갈색 meas flask에 정확히 취한 후 증류수로 정용하고 이를 50 °C 수욕상에서 교반한다. 캡슐의 외피가 녹아 캡슐의 형태가 파괴된 후 약 5분간 더 교반한 다음 0.45 "m MILLEX-HV13 filter(Millipore)로 여과하여 각 비타민의 함량을 측정하였다.
- HPLC는 SHISEIDO NANOSPACE SI-1 (switching valve system 포함)제품을 사용하였으며, Detector는 265nm의 UV detector를 사용하였다. Column은 분석과정에 따라 3가지가 사용되었는데, 첫 번째 과정인 전처리 단계에서는 Capcell pak MF-ph column(4.6mmx 15Omm, SHISEIDO)을, 두 번째 과정인 농축 단계에서는 Capcell pak C18 column(UG 120, 2.0mmx35mm, ' SHISEIDO)을, 마지막 과정인 분석단계에서는 Capcell pak C18 column(UG 80, 1.5mmx250mm, SHISEI-DO)을 사용하였다.
- 각각의 시료는 우선 젖소에서 채취하여 그대로 4°C 냉장 보관한 원유를 ①번 시료로 하고, 이 원유를 UHT처 리 만한 UHT 살균유를 ②번 시료로 하였으며, 미리 계량해 둔 비타 민 강화제를 ①번 시료에 넣고 용해 혼합한 후 UHH처리한 것을 ③번 시료, ②번 시료를 4°C로 냉각한 후 일정량의 비타민 강화제를 용해 혼합처리한 것을 ④번 시료, ②번 시료를 4°C로 냉각한 후 일정량의 비타민 캡슐을 넣고 혼합하여 처리한 것을 ⑤번 시료로 하였으며, 이렇게 제조된 5가지의 우 유시료는 일반 1.8L 시유용 흰색 플라스틱 용기에 담아 4°C 냉장고에 보관하였다.
- 따라서 본 연구에서는 비타민 강화 방법에 따른 UHT 우유 중 비타민 함량 변화, 즉, 비타민을 강화한 후에 UHT 처리를 한 경우와 UHT 처리를 한 후에 비타민을 강화한 경우, 그리고 UHT 처리 후에 비타민을 캡슐화하여 강화한 경우의 비타민 함량과 그 손실율을 비교분석 하였다. 그에 대한 결과는 Table 3, 4와 Fig 1, 2에 나타내었다.
- 본 실험에서 사용된 원유는 축산기술연구소에서 사육 중인 홀스타인 종 젖소로부터 생산된 것으로 살균처리는 축산 기술연구소 내 유가공장에서 살균장비를 이용하여 UHT처리 (135°C 4초 처리) 하였다. 사용된 우유 시료는 ① 원유(raw milk), ② 살균유(UHT milk), ③ 원유에 비타민 강화 후 UHT 처리한 것(살균 전 강화), ④ 원유를 UHT처리 후 비타민을 강화한 것(살균 후 강화), ⑤ 원유를 UHT 처리한 후 비타민 캡슐을 강화한 것으로 준비하였다.
- 본 실험에서는 1회 실험시마다 동일한 원유를 가지고 위의 5가지 처리 시료를 제조하였으며 반복 실험시 사용된 원유마다 최초의 비타민 함량이 조금씩 달라 원유와 UHT유의 비타민 함량은 그 평균값으로 처리하고 나머지는 감소율로 데이터를 처리하였다.
- 비타민 D3를 분석하기 위한 우유 시료는 우유시료 4g 정도를 20ml 갈색 meas flask에 정확히 취 하고 여기에 dimethyl sulfoxide 4ml를 가하여 혼합 후 하룻밤 냉암소에 방치하였다. 이를 메탄올로 정용한 후 원심분리기를 이용하여 5, 000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다.
- 이 과정을 통해 추출한 석유에테르층을 합한 후 증류수 10ml로 세척하였고, 여기에 페놀프탈레인 지시약을 첨가한 후 증류수 50ml씩 무색이 될 때까지 세척하였다. 세척한 석유에테르 층을 무수황산나트륨으로 탈수하고 갈색농축수기로 옮기고 석유에테르로 10ml씩 2회에 걸쳐서 분액깔때기를 세척한 후 무수황산나트륨을 씻어 진공농축수기에 합쳤다. 이것을 40 °C에서 감압하여 농축하였다.
- 수용성 비타민은 시료 제조후 72시간 이내에 분석하였으며 지용성 비타민은 72시간 이내에 전처리한 후 다시 48시간 이내에 분석하였다.
- 증류수 30ml를 가하여 혼합 후 갈색 분액 깔때기로 옮기고 증류수 10ml로 플라스크를 씻어 합쳤다. 여기에 석유에테르(특급)를 30ml 가하고 5〜10분 정도 잘 흔들어 호합한 후 정치시켰다. 상단의 석유에테르층을 분리한 뒤 하단의 물층을 다른 분액깔때기로 옮겨 다시 석유에테르(특급)를 가하여 층을 분리시키는 과정을 2회 반복하였다.
- 우유시료 30g을 50ml , 갈색 mess flask에 정확히 취하여, 이동상 A용액 (PIC B7 5mlM 및 acetic acid 1%를 용해한 수용액)으로 정용한 후 20분간 초음파처리를 하였다. 그 후 원심분리기를 이용해 5, 000rpm에서 20분간 원심분리하였다.
대상 데이터
- HPLC는 SHISEIDO NANOSPACE SI-1 (switching valve system 포함)제품을 사용하였으며, Detector는 265nm의 UV detector를 사용하였다. Column은 분석과정에 따라 3가지가 사용되었는데, 첫 번째 과정인 전처리 단계에서는 Capcell pak MF-ph column(4.
- HPLC는 SHISEIDO NANOSPACE SI-1 제품을 사용하였고, Detector는 325nm의 UV detector를 사용하였다. 사용된 column은 Capcell pak CIS column(UG 80 4.
- HPLC는 SHISEIDO NANOSPACE SI-1 제품을 사용하였으며, Detector는 270nm의 UV detector를 사용하였다. 사용된 column은 Capcell pak C18 column(UG 80, 4.
- 본 실험에서 사용된 표준 수용성 비타민(L-ascorbic acid, thiamin, riboflavin, niacin, niacinamide, folate)고} 지용성 비타민(all trans-retinol, cholecalciferol(D3), a-tocopherol) 및 이동 상 조제시 사용된 PIC B7( 1 -heptanesulfbnic acid sodium salt)는 Sigma-Aldrich 제품을 사용하였으며, 이동상과 희석용액으로 사용된 methanol, acetonitrile 및 isopropanol은 모두 MERCK 제품을 사용하였다.
- 본 실험에서 지용성 비타민을 분석한 우유시료는 수용성 비타민만 함유된 비타민 캡슐을 강화한 우유를 제외한 우유로 하였다. 비타민 A 및 비타민 E 분석용 시료는 우유시료 10ml (vitamin A 20—30 LU.
- 본 실험에서 사용된 원유는 축산기술연구소에서 사육 중인 홀스타인 종 젖소로부터 생산된 것으로 살균처리는 축산 기술연구소 내 유가공장에서 살균장비를 이용하여 UHT처리 (135°C 4초 처리) 하였다. 사용된 우유 시료는 ① 원유(raw milk), ② 살균유(UHT milk), ③ 원유에 비타민 강화 후 UHT 처리한 것(살균 전 강화), ④ 원유를 UHT처리 후 비타민을 강화한 것(살균 후 강화), ⑤ 원유를 UHT 처리한 후 비타민 캡슐을 강화한 것으로 준비하였다.
- 시료 제조 시 사용한 수용성 비타민(L-ascorbic acid, thia min, riboflavin, niacin, folate)은 표준품과 동일한 것을 사용하였으며, 지용성 비타민(all trans - retinol acetate, cholecalci- ferol(D3), a-tocopherol acetate)은 ROCHE사의 상용화된 제품으로 물에 용해되도록 처리된 것을 사용하였다. 지용성 비타민 강화제 각각의 비타민 함량은 all trans - retinol acetate 강화제 중 rethinol 16.
- 이동상은 A상과 B상으로 구성하였는데 A상은 PIC B7 5mM 및 acetic acid 1%를 용해한 수용액이었으며, B상은 PIC B7 5mM 및 acetic acid 1%를 용해 한 60% MeOH이 었다. 이동상 용액의 flow rate는 0.
데이터처리
- 6) Means with the same superscripts within the same column are not significantly different at p<0.05 by Duncantfs multiple range test.
- 6) Means with the same superscripts within the same column are not significantly different at p<0.05 by Duncantfs multiple range test.
- 6) Means with the same superscripts within the same column are not significantly different at p<0.05 by Duncantfs multiple range test.
- D)로 나타내었다. 각각의 변인에 따른 평균을 one way ANOVA로 분석한 후 Duncan's multiple range test로 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
- 본 실험 데이터의 통계처리는 SAS(Statistical Analysis System) 프로그램을 이용하여 하였다. 모든 결과는 평균과 표준편차(Mean士S.D)로 나타내었다. 각각의 변인에 따른 평균을 one way ANOVA로 분석한 후 Duncan's multiple range test로 p<0.
- 본 실험 데이터의 통계처리는 SAS(Statistical Analysis System) 프로그램을 이용하여 하였다. 모든 결과는 평균과 표준편차(Mean士S.
성능/효과
- 이는 마이크로파를 이용한 고온 단시간 살균 시 에 비타민 C는 18〜43%의 파괴율을 보이는 다른 연구결과 [Kim (1999)]와 비교하였을 때, 초고온 살균에 의한 파괴가 훨씬 심하다는 것을 알 수 있었으며 또한 비타민 C는 열처리 에 의해 많은 부분이 쉽게 파괴될 뿐만 아니라 UHT 처리 과정중의 산소나 빛 등에 노출에 의해서도 산화가 촉진되어 손실되어지는 것으로 생각된다. 그러나 UHT 처리 후에 비타민을 캡슐화하여 강화시킨 경우에는 원유에 비타민을 강화한 경우와 유의한 차이를 보이지 않았으며 손실율도 2.0% 밖에 되지 않아 비타민 C 손실율이 가장 낮았다. 이러한 결과로 보아, 비타민을 캡슐화하여 첨가한 경우에는 유지 및 단백질을 주원료로 한 캡슐이 산소나 빛 등으로부터 수용성 비타민 특히, L-ascorbic acid를 보호해 주었기 때문에 그 손실율이 최소화된 것으로 여겨진다.
- 3ppm, tocopherol Ippm와 비슷한 수준을 보였다. 그러나 cholecalciferol(비타민 D3)는 함량이 적어 분석치가 나와 있지 않으며 본 실험에서도 매우 적은 양이 함유되어 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 보아 우유 중의 비타민은 대체로 소량 함유되어 있음을 알 수 있으며, 특히, folic acid(엽산)와 cholecalcif&ol(비타민 D3)는 성장기 어린이들의 성장 발달에 꼭 필요한 영양소인데도 불구하고 원유 중에는 거의 함유되어 있지 않은 결핍 영양소로서 우유 가공 시에 강화시켜야 할 필요가 있음을 알 수 있었다.
- 이상의 결과로 보아 우유를 보다 완전한 식품으로 만들기 위해서는 원활한 비타민의 공급을 위해, 우유 제품 제조 시 우유 중에 풍부한 칼슘의 흡수를 돕는 비타민 D3인 cholecal- ciferol 및 에너지 대사에 필수적인 비타민 Bi (thiamin)과 비타민 B2 (Riboflavin), 항산화 효과로 잘 알려진 비타민 E (tocopherol)와 비타민 C (L-ascorbic acid), 그리고 그 이외에 극미량 함유되어 있는 비타민들을 강화할 필요가 있다고 생각된다. 그러나 이러한 비타민들이 우유의 살균 및 제조 가 공 중 열이나 다른 요인에 의해서 쉽게 파괴되는 것을 방지하기 위해서 유지 및 단백질을 보호용 물질로 사용하는 비타민 캡슐을 사용할 경우 비타민을 열뿐만 아니라 산소 빛 등으로부터, 효과적으로 차단 보호하여 비타민의 영양가를 최대한으로 함유하도록 한다는 것을 알 수 있었다.
- 따라서 원유와 UHT 처리시의 비타민 함량 변화에 대하여 실험한 결과, 원유 중 ascorbic acid 함량은 4.87ppm인데 비해 UHT처리 우유 중 ascorbic acid 함량은 1.24ppm으로 약 74.5%가 감소하여 유의한 차이를 나타냈다. 이는 다른 연구보고 (Leel, 1996)에서도 저온 살균과정에서 약 10〜25%, UHT처리 과정에서는 25% 혹은 그 이상의 손실이 일어나는 것으로 확인되었으며, 국내 UHT 처리 시유의 비타민 C 함량에 대한 연구보고에서도 원유를 130°C로 가열 처리한 후에 비타민 C가 28% 정도 손실된 것으로 나타나 본 실험결과와 같은 경향이었다.
- 따라서 Table 2에서도 나타난 바와 같이 비 타민 E의 경우 열에 의한 직접적인 손실이 아니라 항산화제로서의 역할에 따른 손실로 여겨진다. 또한 소장 점막에서 칼슘과 인의 능동 수송 및 뼈에서의 재흡수 등 칼슘과 인의 체내 대사에 있어서 매우 중요한 역할을 담당하고 있는 비타민 D3는 UHT 처리 전에 비타민을 강화한 경우가 UHT처 리 후에 강화한 경우에 비해 그 손실율이 높은 경향을 보였으나 통계적으로 유의하지는 않았다.
- 지용성 비타민의 경우 비교적 열에 안정하여 가열살균 과정 중 손실에 따른 함량 변화는 크지 않은 것으로 알려져 있다. 본 실험결과에서는 비타민을 강화한 원유에 비해 비타민을 강화한 후 UHT 처리한 우유나 UHT처리 후에 비타민을 강화한 우유 모두 tocopherol 함량이 유의하게 적었다. 그러나 손실율에 있어 UHT 처리 전에 비타민을 강화한 경우와 UHT처리 후에 비타민을 강화한 경우간에는 유의한 차이를 보이지 않았다.
- 이러한 결과로 보아, 비타민을 캡슐화하여 첨가한 경우에는 유지 및 단백질을 주원료로 한 캡슐이 산소나 빛 등으로부터 수용성 비타민 특히, L-ascorbic acid를 보호해 주었기 때문에 그 손실율이 최소화된 것으로 여겨진다. 수용성 비타민 중 niacin 이 나 folic acid, thiamine 등은 UHT 처리 후에 캡슐화된 비타민을 강화시킨 경우가 UHT 처리 전이나 후에 비타민을 첨가한 경우에 비해 그 손실율이 적은 경향을 보였으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않아 이러한 비타민들은 이미 알 려진 바와 같이 열에 의한 파괴가 그다지 크지 않음을 알 수 있었다.
- 수용성 비타민중 L-ascorbic acid 함량은 비타민을 강화한 후에 UHT를 처리한 경우나 UHT 처리 후에 비타민을 강화한 경우 모두 유의적으로 감소하여(P<0.05) 비타민을 강화한 후에 UHT 처리를 한 경우에는 71.1%의 손실율을, UHT 처리 후 비타민 C를 강화하였을 경우에는 60.4%의 손실율을 나타내었다. 이는 마이크로파를 이용한 고온 단시간 살균 시 에 비타민 C는 18〜43%의 파괴율을 보이는 다른 연구결과 [Kim (1999)]와 비교하였을 때, 초고온 살균에 의한 파괴가 훨씬 심하다는 것을 알 수 있었으며 또한 비타민 C는 열처리 에 의해 많은 부분이 쉽게 파괴될 뿐만 아니라 UHT 처리 과정중의 산소나 빛 등에 노출에 의해서도 산화가 촉진되어 손실되어지는 것으로 생각된다.
- 원유의 비타민 함량 측정 결과는 제 7차 개정 한국인의 영양권장량에 수록된 원유 중의 비타민 함량인 L-ascorbic acid 20ppm, thiamin 0.4ppm, riboflavin 1.5ppm, niacin Ippm, folic acid 0.006ppm, retinol 0.3ppm, tocopherol Ippm와 비슷한 수준을 보였다. 그러나 cholecalciferol(비타민 D3)는 함량이 적어 분석치가 나와 있지 않으며 본 실험에서도 매우 적은 양이 함유되어 있는 것으로 나타났다.
- 그러나 cholecalciferol(비타민 D3)는 함량이 적어 분석치가 나와 있지 않으며 본 실험에서도 매우 적은 양이 함유되어 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 보아 우유 중의 비타민은 대체로 소량 함유되어 있음을 알 수 있으며, 특히, folic acid(엽산)와 cholecalcif&ol(비타민 D3)는 성장기 어린이들의 성장 발달에 꼭 필요한 영양소인데도 불구하고 원유 중에는 거의 함유되어 있지 않은 결핍 영양소로서 우유 가공 시에 강화시켜야 할 필요가 있음을 알 수 있었다. 특히, 수용성 비타민 중 L-ascorbic acid의 경우 우유내 그 함량은 매우 적으나 다른 비타민들의 보호 차원에서 매우 중 요한 역할을 하여 ascorbic acid함량이 적을 경우 식품 내 vitamin Bn가 많이 분해되고 folic acid의 산화가 증가된다고 한다(Ford et al, 1967).
- 시료 제조 시 사용한 수용성 비타민(L-ascorbic acid, thia min, riboflavin, niacin, folate)은 표준품과 동일한 것을 사용하였으며, 지용성 비타민(all trans - retinol acetate, cholecalci- ferol(D3), a-tocopherol acetate)은 ROCHE사의 상용화된 제품으로 물에 용해되도록 처리된 것을 사용하였다. 지용성 비타민 강화제 각각의 비타민 함량은 all trans - retinol acetate 강화제 중 rethinol 16.84%, cholecalciferol 깅화제 중 cholecalciferol 0.18%, tocopherol acetate강화제 중 tocophe rol 53.90%였다. 그 외 캡슐로 보호된 비타민 강화제는 L-ascorbic acid와 thianmin은 BASF Takeda제품이며 nicotinic acid는 有機合成藥品工業(株), folic acid는 金剛化學(株)제품으로 그 함량은 L-ascorbic acid가 4.
후속연구
- 그러나 niacin과 엽산은 수용성 비타민임에도 불구하고 열처리에 의한 손실이 다른 수용성 비타민류보다 적었으며, 오히려 지용성 비타민인 비타민 E와 비타민 D3의 손실율이 더 크게 나타나는 것으로 보아, 지용성 비타민의 감소를 막기 위한 제조공정 및 강화 방법의 개선이 필요하다고 생각된다. 따라서 niacin이나 엽산과 같이 UHT 처리 시 감소가 미미한 영양소보다는 열처리에 따른 산화에 민감한 지용성 비타민인 비타민 D3나 비타민 E를 캡슐화하여 강화한다면 비타민의 영양 강화 및 소비자에게 충분한 비타민을 공급한다는 목적을 실현하는데 보다 효과적이라 생각된다.
- 이상의 결과로 보아 우유를 보다 완전한 식품으로 만들기 위해서는 원활한 비타민의 공급을 위해, 우유 제품 제조 시 우유 중에 풍부한 칼슘의 흡수를 돕는 비타민 D3인 cholecal- ciferol 및 에너지 대사에 필수적인 비타민 Bi (thiamin)과 비타민 B2 (Riboflavin), 항산화 효과로 잘 알려진 비타민 E (tocopherol)와 비타민 C (L-ascorbic acid), 그리고 그 이외에 극미량 함유되어 있는 비타민들을 강화할 필요가 있다고 생각된다. 그러나 이러한 비타민들이 우유의 살균 및 제조 가 공 중 열이나 다른 요인에 의해서 쉽게 파괴되는 것을 방지하기 위해서 유지 및 단백질을 보호용 물질로 사용하는 비타민 캡슐을 사용할 경우 비타민을 열뿐만 아니라 산소 빛 등으로부터, 효과적으로 차단 보호하여 비타민의 영양가를 최대한으로 함유하도록 한다는 것을 알 수 있었다.
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