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문제 정의
- 그래서 본 실험에서는 검은곰팡이병이 발생한 양파로부터 병원곰팡이인 A. nigere 분리하여 방제를 위한 약제 선발 실험을 수행하였다. 특히 실험실 내에서 선발한 약제들이 증기 상태에서 A.
- nigere 분리하여 방제를 위한 약제 선발 실험을 수행하였다. 특히 실험실 내에서 선발한 약제들이 증기 상태에서 A. niger의 포자 형성에 미치는 활성을 조사하여, 새로운 방제법을 제안하고자 하였다.
제안 방법
- 직경 5 ㎜의 균사 조각을 PDA의 중앙에 접종하고 각각의 온도에서 5일간 배양한 후, 균총의 직경을 측정하였다. A. niger 포자 현탁액의 포자 농도를 I X "/血 로 조절한 후, 96-well microtiter의 각 well당 50p7씩을 분 주하고 각각의 온도에서 8시간 배양한 후, 포자 발아의 정도를 조사하였다.
- 살균제의 훈증 처리 효과. 3(TC의 PDA에서 형성된 A. niger AnYD-1의 포자를 250(ig/mZ의 tween 20을 포함 하고 있는 PD broth를 이용하역 수확하였다. Van Gestel 등(1981)의 방법을 사용하여 살균제의 훈증 효과를 조사하였다.
- niger AnYD- 1에 대한 균사 생육 억제 효과를 실험하였다. DMSO (Dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 살균제들은 멸균한 PDA 가 굳기 전에 정해진 농도로 희석하여 첨가하였다. 이때 배지의 DMSO 최종농도는 1%로 조절하였다.
- 기존 살균제의 균사 생장 억제 실험. Hexaconazole을 비롯한 6 가지의 기존의 살균제를 사용하여 A. niger AnYD- 1에 대한 균사 생육 억제 효과를 실험하였다. DMSO (Dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 살균제들은 멸균한 PDA 가 굳기 전에 정해진 농도로 희석하여 첨가하였다.
- 301의 PDA에서 5일간 배양한A. niger의 균사 선단에서 직경 5 ㎜의 균사 조각을 떼어내어 양파 조직을 떼어낸 부위에 삽입하여 접종하였다. 양파는 플라스틱 상자에 넣어 습실 처리하며 정해진 온도에서 일주일을 보관한 후에 발병 정도를 조사하였다.
- 1에서처럼 배지를 담은 petri dish를 거꾸로 뒤집었다. 거꾸로 뒤집은 petri dish 의 뚜껑에 직경 5 ㎜의 paper disc를 올려놓고 정해진 농도의 살균제를 50μg씩 처리하였다. 포자를 접종한 배지 는 거꾸로 뒤집은 채로 30℃에서 5일간 배양한 후에 균사의 생장과 포자의 형성이 억제된 부분의 직경을 측정하여 효과를 조사하였다.
- 훈증 처리에 의한 살균제의 4 niger AnYD-1의 포자 형성. 기존에 사용되고 있는 20종의 살균제를 acetone에 녹여 위에서 서술한 것과 같은 훈증 처리 방법대로 paper disc(직경; 6 ㎜)에 50|ig씩 처리하고, A. niger AnYD-1의 포자 형성 억제 효과를 형성이 억제된 부위의 직경을 측정하여 조사하였다. A.
- 또한 살균제를 용해하는데 사용하는 용매의 종류, 살균제의 처리 농도, 병원균의 배양 온도가 flusilazole의 A. nigere 대한 훈증 효과에 미치는 영향을 조사하였다.
- 병원균의 생육과 병원성 조사 A. niger AnYD-1의 균 사 생육과 포자 발아를 15, 20, 25, 30, 35℃에서 조사하였다. 직경 5 ㎜의 균사 조각을 PDA의 중앙에 접종하고 각각의 온도에서 5일간 배양한 후, 균총의 직경을 측정하였다.
- 부패한 양파에서 분리한 A. niger AnYD-1 을 여러 온도에서 배양하며 균사의 생육과 병원성을 조사하였다. AnYD- 1은 저온보다는 고온에서 균사 생육이 왕성하였는데, 5일간 배양한 후 조사한 균총의 직경은 25, 30, 35℃에서58.
- 병원균의 분리와 온도에 따른 병원균의 생육 및 병원성. 신안군의 저장고에서 채집한 부패한 양파의 이병 조직으로부터 Fig. 2에서와 같은 검정곰팡이를 분리하여 현미경 하에서의 형태를 관찰하였다. Fig.
- 이때 배지의 DMSO 최종농도는 1%로 조절하였다. 약제를 첨가한 PDA에 AnYD-1의 균사 조각(직경 5 ㎜)을 접종 하여 3WC에서 5일간 배양한 후 균총의 직경을 측정하였다. 약제의 효과는 1%의 DMSO만을 첨가한 대조구의균총의 직경에 대한 약제 배지에서의 균총을 비교한 균 사 생장 억제율을 아래의 식을 이용하여 계산하였다.
- niger의 균사 선단에서 직경 5 ㎜의 균사 조각을 떼어내어 양파 조직을 떼어낸 부위에 삽입하여 접종하였다. 양파는 플라스틱 상자에 넣어 습실 처리하며 정해진 온도에서 일주일을 보관한 후에 발병 정도를 조사하였다.
- niger AnYD-1의 균 사 생육과 포자 발아를 15, 20, 25, 30, 35℃에서 조사하였다. 직경 5 ㎜의 균사 조각을 PDA의 중앙에 접종하고 각각의 온도에서 5일간 배양한 후, 균총의 직경을 측정하였다. A.
- 거꾸로 뒤집은 petri dish 의 뚜껑에 직경 5 ㎜의 paper disc를 올려놓고 정해진 농도의 살균제를 50μg씩 처리하였다. 포자를 접종한 배지 는 거꾸로 뒤집은 채로 30℃에서 5일간 배양한 후에 균사의 생장과 포자의 형성이 억제된 부분의 직경을 측정하여 효과를 조사하였다.
대상 데이터
- 병원균의 분리 및 동정. 전라남도 신안군의 양파 저장고에서 검은곰팡이병이 발생한 양파에서 양파의 이병 부와 건전부의 경계면 조직(5㎜X5㎜)을 잘라, 1% sodium hypochloride에서 1분간 표면 살균한 후, 200 pig/ m/의 streptomycin을 함유한 Potato Dextrose Agar(PDA, Difco)에 치상하고, 25℃에서 3일간 배양하였다. 치상한 이병조직의 끝에서 자란 A.
- 전라남도 신안군의 양파 저장고에서 검은곰팡이병이 발생한 양파에서 양파의 이병 부와 건전부의 경계면 조직(5㎜X5㎜)을 잘라, 1% sodium hypochloride에서 1분간 표면 살균한 후, 200 pig/ m/의 streptomycin을 함유한 Potato Dextrose Agar(PDA, Difco)에 치상하고, 25℃에서 3일간 배양하였다. 치상한 이병조직의 끝에서 자란 A. niger의 균사 선단을 새로운 PDA로 옮겨 배양하였고, 형성된 포자에서 단포자 분리하여 얻은 균주를 실험에 사용하였다.
이론/모형
- niger AnYD-1의 포자를 250(ig/mZ의 tween 20을 포함 하고 있는 PD broth를 이용하역 수확하였다. Van Gestel 등(1981)의 방법을 사용하여 살균제의 훈증 효과를 조사하였다. 포자의 농도를 1X 106/m/5- 조절하여 0.
성능/효과
- nigere 30~ 35℃의 온도에서 균사의 생육, 포자 발아, 그리고 양파에 대한 병원성이 높은 것으로 나타났다(Table 2). 15。(2에서 배양하였을 때 A. niger AnYD-l의 균사 생장은 30℃ 에 비하여 71.1%나 감소하였으며, 포자가 전혀 발아하지 못하였고, 양파에 상처를 내고 A. niger AnYD-1의 균사를 접종하여도 병이 발생하지 않았다. A.
- niger AnYD-1의 포자 형성 억제 효과를 형성이 억제된 부위의 직경을 측정하여 조사하였다. A. niger AnYD-1의 포자를 도말하고 위에서 기술한 것과 동일한 방법으로 flusilazole 과 hexaconazole을 처리한 PDA에서는 바닥에 흰색의 균사가 균일하게 생장하여 있었으나, 넓은 지역에서 4 niger AhYD-1의 검정색 포자가 형성되지 않았다(Table 4와 Fig.3). Dichlofluanid는 위의 2가지 살균제와는 다르게 포자의 형성뿐만 아니라 균사의 생육까지도 억제하는 clear zone을 형성하였다.
- 동정되었다. A. 戒ger AnYD-1은 30℃에서 균사생 장, 포자발아 그리고 양파에 대한 병원성이 가장 양호하였다. PDA 배지 상에서 실시한 in 两成의 실험에서 flusilazole과 hexaconazolee A.
- niger AnYD-1 을 여러 온도에서 배양하며 균사의 생육과 병원성을 조사하였다. AnYD- 1은 저온보다는 고온에서 균사 생육이 왕성하였는데, 5일간 배양한 후 조사한 균총의 직경은 25, 30, 35℃에서58.2, 69.7, 69.1 ㎜로 30℃에서 가장 빠른 균사 생장을 보였다(Table 2). 포자 발아율도 3CFC에서 가장 높았으며, 양파에 상처 접종하여 실시한 병원성 실험에서도 301과 35℃에서 가장 심한 병원성을 보였다.
- 증기 상태에서의 포자 형성 억제 효과를 보인 3종의 살균제를 농도 별로 실험한 결과, Table 6에서와 같이 flusilazole과 hexaconazolee 처리한 약제의 농도가 높아짐에 따라 포자 형성 억제 지역의 직경이 넓어졌다. Dichlofluanid는 50 mg/mZ의 처리구에서 포자 형성 억제 지역의 크기가 10 mg/mZ의 처리보다 작아지는 경향을 보였다. 이 결과의 원인은 좀 더 실험을 진행하여 규명하고 자 한다.
- Flusilazole 과 hexaconazole의 훈증의 효과는 사용하는 용매, 처리 농 도와 배양 온도에 따라서 차이가 있었다. Dimethylsulfoxide 와 dimethylformamide를 용매로 사용하였을 때 가장 높은 효과가 나타났으며, 고온에서 배양할수록 포자형성 억 제 효과가 크게 나타났다.
- 戒ger AnYD-1은 30℃에서 균사생 장, 포자발아 그리고 양파에 대한 병원성이 가장 양호하였다. PDA 배지 상에서 실시한 in 两成의 실험에서 flusilazole과 hexaconazolee A. niger AnYD-1의 균사 생장 억제 효과는 적었지만, 병원균에 살균제를 직접 처 리하지 않고 증기 상태로 처리하였을 때 포자의 형성을 강하게 억제하는 특이적인 훈증효과를 보였다. Flusilazole 과 hexaconazole의 훈증의 효과는 사용하는 용매, 처리 농 도와 배양 온도에 따라서 차이가 있었다.
- niger AnYD-1의 균사 생장 억제 효과는 Table 3에서 보는 것과 같이 다른 스테롤 생합성 저해 살균제에 비하여 크게 떨어지는 것으로 나타났다. Table 4에서 실험에 사용한 fenarimol, nuarimol, prochloraz, triforine, triadimefon과같은 다른 스테롤 생합성 저해 살균제와 비교하여 균사 생장 억제 효과는 떨어지지만 증기 상태에서 A. niger AnYD-1의 포자 형성을 특이적으로 억제함으로써, 두 살 균제가 A. niger의 포자 형성 과정에 특이적으로 영향을 미치고 있음을 알 수 있었다.
- 그런데 flusilazole과 hexaconazole의A. niger AnYD-1의 균사 생장 억제 효과는 Table 3에서 보는 것과 같이 다른 스테롤 생합성 저해 살균제에 비하여 크게 떨어지는 것으로 나타났다. Table 4에서 실험에 사용한 fenarimol, nuarimol, prochloraz, triforine, triadimefon과같은 다른 스테롤 생합성 저해 살균제와 비교하여 균사 생장 억제 효과는 떨어지지만 증기 상태에서 A.
- 살균제의 균사 생육 억제 효과. 공시한 6가지의 살균제 중에서 prochloraz는 1.0 ㎍/mZ 처리에서도 93.1%의 균사 생장 억제 효과를 보였다(Table 3). Benomyl, iprodione, PCNB와 같은 살균제는 10 ㎍/mZ의 처리에서 90% 이상의 억제 효과를 나타냈다.
- Benomyl, iprodione, PCNB와 같은 살균제는 10 ㎍/mZ의 처리에서 90% 이상의 억제 효과를 나타냈다. 그러나 prochloraz와 같이 병원균의 스테롤 생합성을 저해하는 것으로 알려진 hexaconazole 과 flusilazolee 100 ㎍/mZ의 처리구에서도 77.1%와 80.2%의 효과만을 보여 실험에 사용한 살균제 중에서 가강 낮은 균사 생장 억제 효과를 보였다.
- ifalicum과 같이 온도에 따라서 억제 정도가 확실하게 나타나지는 않았지만, 배양 온도가 상승할수록 flusilazole과 hexaconazole의 포자 형성 억제 효과뿐만이 아니라 dichlofluanid에 의한 균사 생장 억제 효과도 증가하였다. 또한 flusilazolee 용매의 종류에 따라서도 포자 형성 억제 효과가 변화하였는데, ethyl ether에서 가장 우수한 효과가 나타났다. 특히 휘발성이 높지는 않은 dimethylformamide와 dimethylsulfoxide 에서 37.
- 본 실험에서 사용한, 양파에서 분리한 A. nigere 30~ 35℃의 온도에서 균사의 생육, 포자 발아, 그리고 양파에 대한 병원성이 높은 것으로 나타났다(Table 2). 15。(2에서 배양하였을 때 A.
- itali㎝의 생육이 억제되는 clear zone의 면적이 증가하였다고 보고하고 있다. 본 실험에서는 Van Gestel(1981)과 같이 약제를 24시간 동안만 정해진 온도에서 처리한 것이 아니고 모든 배양 기간동안 각각의 온도에서 장시간 처리하며 포자의 형성 억제 정도를 조사하였기 때문에 P. ifalicum과 같이 온도에 따라서 억제 정도가 확실하게 나타나지는 않았지만, 배양 온도가 상승할수록 flusilazole과 hexaconazole의 포자 형성 억제 효과뿐만이 아니라 dichlofluanid에 의한 균사 생장 억제 효과도 증가하였다. 또한 flusilazolee 용매의 종류에 따라서도 포자 형성 억제 효과가 변화하였는데, ethyl ether에서 가장 우수한 효과가 나타났다.
- 이처럼 살균제가 갖는 훈증의 효과는 단순한 작용 특성으로 간주되는 것이 아니라, 살균제를 실제 사용하는데 있어서 그 효과를 높여줄 수 있는 요인으로 작용하고 있다. 본 실험에서도 dichlofluanid, flusilazole, hexaconazole 등에서 A. niger AnYD-1의 포자 형성을 억제하는 효과를 관찰할 수 있었다(Table 4). 선발된 3가지의 살균제 중에서 dichlofluanid는 포자의 형성뿐만 아니라 포자의 발아도 억제하였다.
- niger AnYD-1의 포자 형성을 억제하는 효과를 관찰할 수 있었다(Table 4). 선발된 3가지의 살균제 중에서 dichlofluanid는 포자의 형성뿐만 아니라 포자의 발아도 억제하였다. Fig.
- 대부분의 양파는 수확 후 저온 저장고를 이용하여 보관하고 있는데, 저장고 내에서의 양파의 부패율은 약 30%에 달할 정도로 높고 저온 저장고를 유지하기 위해서도 과다한 경비가 지출되고 있기 때문에, 상온에서 양파를 보관하려는 노력이 있어 왔다. 양파를 저장고에 저장하기 전에는 수확 시에 발생한 상처를 통하여 병원균이 침입하는 것을 방지하기 위해서 28~32℃에서 10~14 일간 처리하는데, 1998년 전라남도 신안군에서 상온 저장하기 위하여 고온 처리하고 저장하던 양파에서 검은 곰팡이병이 대량으로 발생하였고, 병든 양파로부터 병원 균을 분리하여 동정한 결과, Aspergillus niger로 동정되었다. 전세계적으로 A.
- 하지만 dichlofluanid는 살균제를 처리한 paper disc 의 바로 윗 부분에서 균사의 생장이 억제되는 뚜렷한 clear zone을 형성하는 것으로 보아 증기 상태에서 병원균의 생 육을 억제하는 특성이 다름을 알 수 있었다. 특히 가장 우수한 포자 형성 억제 효과를 보인 flusilazole의 처리구 에서 A. niger의 포자낭경과 vesiclee 정상적으로 형성되어 있고 포자의 형성만이 억제되어 있는 것을 확인함으 로써 flusilazole이 A. nigerS] 포자 형성 과정에 특이적으로 작용함을 알 수 있었다. 식물병원곰팡이의 스테롤 생합성을 저해하는 살균제는 곰팡이의 포자 발아 능력은 떨 어지지만, 균사 생장' 억제 능력은 우수한 것으로 보고되어있다(Kato et al.
- 1 ㎜로 30℃에서 가장 빠른 균사 생장을 보였다(Table 2). 포자 발아율도 3CFC에서 가장 높았으며, 양파에 상처 접종하여 실시한 병원성 실험에서도 301과 35℃에서 가장 심한 병원성을 보였다. 3(TC와 35℃에서는 병반 부위에 검정색의 포자가 다량 형성되었다.
- 3에서와 같이 flusilazole의 처리구에서는 하얀 색의 균사가 고르게 생장하고, 다만 검정색의 포자 형성만이 강하게 억제되고 있었다. 하지만 dichlofluanid는 살균제를 처리한 paper disc 의 바로 윗 부분에서 균사의 생장이 억제되는 뚜렷한 clear zone을 형성하는 것으로 보아 증기 상태에서 병원균의 생 육을 억제하는 특성이 다름을 알 수 있었다. 특히 가장 우수한 포자 형성 억제 효과를 보인 flusilazole의 처리구 에서 A.
후속연구
- niger는 많은 포자를 형성하기 때문에, 저장하는 양파에서 방제가 완벽하게 이루어지지 않아서 살아남는 곰팡이들이 있을 경우 많은 포자를 만들어 저장고와 같은 정해진 공간 내에서 심하게 발생할 수 있다. 따라서 A. niger의 포자 형성만을 특이적으로 저해하는 살균제들을 사용한다면, 양파 검은곰팡이병에 대한 새로운 방제법을 제안할 수도 있을 것으로 생각한다.
- 2 ㎜의 포자 억제 반경을 보인 것은 매우 특이한 일이라고 생각한다. 이러한 용매에 의한 훈증 효과의 변화는 본살균제들의 제형을 결정하는데 매우 유용한 자료로 사용될 것으로 생각된다.
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