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문제 정의
- 본 연구는 성별과 연령에 따라 서로 상이한 결과가 보고되어 있는 흡연과 백혈구 내 DNA의 손상정도와의 관계를 평가하여, DNA 수준에서 흡연의 위해를 명확히 하기 위하여 실시되었다. 구강, 폐, 인두, 식도, 신장, 방광, 췌장, 자궁경부암 발생은 흡연과 명백한 연관성이 있다고 알려져 있으며 이러한 암 발생에 관여하는 주 요인으로 고려되고 있는 것이 흡연의 세포독성에 의한 DNA의 손상이다(Rojas 등, 1996).
- 단세포 전기영동법은 유해화학물질 노출, 환경오염, 식이습관, 생활양식과 질병 등 다양한 원인(Dhawan 등, 2001)에 의해 일어나는 DNA 손상정도를 개개의 세포 수준에서 감지할 수 있는 방법으로, 흡연의 유전독성을 평가하는데 자매염 색체교환분석보다 더 민감한 방법으로 평가되고 있다(Betti 등, 1994, 1995). 본 연구에서는 단세포전기영동법을 이용하여 건강한 한국인에서 흡연력, 연령 및 성별 등에 따른 DNA 손상 정도를 평가하였다.
제안 방법
- 0, GenDix, Korea)으로 관찰하였다(515-560 nm excitation, 590 run barrier filter, 400배). 슬라이드 당 5。개(시료당 100개)의 세포를 무작위로 선택하여 이미지를 캡쳐하고, 이미지 분석 프로그램 (Scion Image, Scion Corporation, MD)으로 head를 포함해 tail까지의 total comet length ptm단위로 측정하였다. 손상된 세포의 빈도는 현미경 하에서 DNA 손상이 가시화되는, total comet length가 22.
- 0(mean土 SD)세, 20~59세) 이 자의로 연구에 참여하였다. 대상자는 자기기입식 설문 조사를 통하여 개인의 일반적 특성 , 커피음용량 및 음주량, 흡연자의 경우 흡연기간(년), 하루 흡연량(개피) 등의 흡연력, 비흡연자의 경우 과거흡연여부, 금연년수 및 직장과 가정에서의 일상적인 간접흡연 노출 정도를 조사하였다. 간접흡연 노출의 조사는 없다', 조금', 보통', '많다'의 4점 척도를 활용하였으나, 척도간의 계량화가 어렵고 답변에 주관적 요소가.
- 본 실험에는 전혈 시료를 활용하였으며(Wojewod如 등, 1998), 손가락 끝 부위에서 말초혈액 15111 정도를 heparinized capillary tube에 채취하여 500(11의 ice-cold serum-free RPMI 1640 배양액(GIBCO)에 섞어 준 후, 즉시 시료 당 2개의 슬라이드를 준비하고 단세포전기영동을 시행하였다.
- 시행하였다. 상관분석시 성별, 흡연여부 등의 변수는 0과 1로 가변수(dummy variable)화 하여 분석하였다.
- 슬라이드 당 5。개(시료당 100개)의 세포를 무작위로 선택하여 이미지를 캡쳐하고, 이미지 분석 프로그램 (Scion Image, Scion Corporation, MD)으로 head를 포함해 tail까지의 total comet length ptm단위로 측정하였다. 손상된 세포의 빈도는 현미경 하에서 DNA 손상이 가시화되는, total comet length가 22.8 |im 이상인 세포의 백분율로 계산하였다.
- 슬라이드를 건조시킨 후 50μ1의 ethidium bromide (20ug/ml)로 염색하고 형광현미경 (Zeiss Axiolab)이 부착된 image processing system(ChIPS-FISH ver 3.0, GenDix, Korea)으로 관찰하였다(515-560 nm excitation, 590 run barrier filter, 400배). 슬라이드 당 5。개(시료당 100개)의 세포를 무작위로 선택하여 이미지를 캡쳐하고, 이미지 분석 프로그램 (Scion Image, Scion Corporation, MD)으로 head를 포함해 tail까지의 total comet length ptm단위로 측정하였다.
- 8 VX35cm), 300 mA에서 20분간 전기 영동하였다. 전기영동 과정 중에는 완충액의 수위를 조절하여 전류를 300 mA로 유지하였고 또한 완충액은 순환시켜서 salt gradient를 최소화시켰다. 전기영동 완료 후 중화 완충액 (0.
- 정도 관리로서 비흡연자이며 직장과 가정에서의 담배 연기에의 노출이 거의 없는 26세의 여성 1명 (control-1)과 50세의 남성 1명 (control-2)의 말초혈액 시료를 control cell로서 매 실험 batch마다 분석하였다. 그 결과 한번의 실험 batch 에서 1회 100개 comet length 평균치를 8회 반복 측정한 within-batch CV(coefficient of variation)는 control-1 이 L84%(22.
- 직장과 가정에서 간접흡연(ETS) 노출 여부에 따른 DNA 손상의 차이를 비흡연자에서 비교하였다(표 4). 남성은 직장에서 간접흡연 노출 집단과 비노출 집단 사이에 DNA 손상은 유의한 차이가 없었고, 여성에서도 직장 또는 가정에서 간접흡연에의 노출여부에 따라서는 DNA 손상에 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
대상 데이터
- 방지하였다. Normal melting point agarose(NMA, A0576), low melting point agarose(LMA, A4018) 등 실험에 사용된 모든 시약은 Sigma사 제품을 사용하였으며, Triton X-100, N-lauroyl sarcosine-Na, Trizima base, NaCl 은 molecular biology용 시약을 사용하였다.
- 직업적으로 환경유독물질에 노출되지 않은 건강한 20-50 대의 일반인 총 99 명 (34.0±10.0(mean土 SD)세, 20~59세) 이 자의로 연구에 참여하였다. 대상자는 자기기입식 설문 조사를 통하여 개인의 일반적 특성 , 커피음용량 및 음주량, 흡연자의 경우 흡연기간(년), 하루 흡연량(개피) 등의 흡연력, 비흡연자의 경우 과거흡연여부, 금연년수 및 직장과 가정에서의 일상적인 간접흡연 노출 정도를 조사하였다.
데이터처리
- SPSS 통계프로그램을 이용하여 t-test, ANOVA test 및 상관분석을 시행하였다. 상관분석시 성별, 흡연여부 등의 변수는 0과 1로 가변수(dummy variable)화 하여 분석하였다.
이론/모형
- 본 실험은 Singh 등(1988)의 방법에 준해 시행하였고, 전 과정은 암실에서 시행하여 실험 과정 중의 추가적인 DNA 손상을 방지하였다. Normal melting point agarose(NMA, A0576), low melting point agarose(LMA, A4018) 등 실험에 사용된 모든 시약은 Sigma사 제품을 사용하였으며, Triton X-100, N-lauroyl sarcosine-Na, Trizima base, NaCl 은 molecular biology용 시약을 사용하였다.
성능/효과
- 실험 batch마다 분석하였다. 그 결과 한번의 실험 batch 에서 1회 100개 comet length 평균치를 8회 반복 측정한 within-batch CV(coefficient of variation)는 control-1 이 L84%(22.6 ±0.42(mean 土 SD)|丄m), control-2^ 2.94%(24.6 ±0.72 μm)이었다. 한편 매 실험 batch마다 control 시료를 1회 측정한 between-batch CV는 control-1°1 5.
- 총 대상자를 분석한 결과 comet length와 손상된 세포의 빈도가 비흡연자에 비해 흡연자에서 유의하게 높게 나타났으며(표 1), DNA 손상과 성별, 연령, 흡연여부, 음주량 등의 몇몇 변수와의 상관성 분석 결과에서도 흡연 여부만이 높은 상관관계를 갖고있음을 알 수 있었다(표 2). 또한 40세 이상과 미만 및 흡연여부로 전체 대상자를 4개 군으로 나누어 비교한 DNA 손상 정도(그림 1)도 단지 흡연 집단과 40세 미만의 비흡연 집단 간에서만 DNA 손상에 유의한 차이가 있다고 나타났다. 남성이나 일부 연령에서 DNA 손상 정도가 유의하게 높다고 나타난 것은 본 연구에 참여한 여성들이 모두 비흡연자이며 일부 연령군에서 홉연자의 비율이 높았기 때문에 흡연이 혼란요인으로 작용해 나타난 결과로 보이며, 흡연여부에 대해 보정해준 이후 성별과 연령에 따른 연관성은 소실되었다(표 2).
- 본 연구에서는 36명의 흡연자에서 홉연량에 따른 DNA 손상정도의 차이도 비교하였는데, 총흡연기간, 하루흡연량 및 SPY(smoke pack years)로 정량한 흡연총량의 증가에 따라서 DNA 손상에 유의한 차이가 나타나지는 않았다(표 3). Dhawan 등(2001)도 SPY로 정량한 흡연량의 증가에 따라 DNA 손상이 증가하는 경향은 나타나지 않았고, Betti 등 (1995)과 Femzilli 등(1997)도 DNA 손상과 흡연량 또는 하루 흡연량의 연관성은 발견할 수 없었다고 보고한 바 있다.
- 출되는 일반대중의 규모가 크기 때문에 심각한 공중보건의 위험요소로 규정되어 있다(Jenkins 등, 1996). 본 연구에서는 간접흡연의 영향을 평가하기 위해 남성과 여성 비흡연자에서 가정 또는 직장에서 ETS 노출에 따른 DNA 손상차이를 분석하였는데 남성과 여성 모두에서 유의한 차이를 발견할 수 없었다(표 4). 이는 직장과 가정에서의 일상적인 간접흡연 노출의 계량화가 어려웠고 2점 척도답변에 주관적 요소가 크게 영향을 미쳤을 가능성이 있으며, 한과 김(2000)은 ETS 노출된 비흡연자에서 nicotine의 대사산물인 뇨 cotinine 농도가 유흥업소 종사자(과대 노출자)를제외하고는 비노출자와 유의한 차이가 없었음을 보고한 바 있다.
- 본 연구에서는 단세포전기 영동분석으로 비흡연자에 비해 흡연자에서 DNA 손상정도가 유의하게 증가함을 확인할 수 있었다. 총 대상자를 분석한 결과 comet length와 손상된 세포의 빈도가 비흡연자에 비해 흡연자에서 유의하게 높게 나타났으며(표 1), DNA 손상과 성별, 연령, 흡연여부, 음주량 등의 몇몇 변수와의 상관성 분석 결과에서도 흡연 여부만이 높은 상관관계를 갖고있음을 알 수 있었다(표 2).
- Piperakis 등(1998)은 서로 다른 두 연령 그룹을 대상으로 백혈구 DNA에서 흡연과 연령의 영향을 평가하였는데 흡연자와 고연령군에서 DNA 손상이 증가하였고 흡연이 더 강력한 영향을 미친다고 보고하였다. 본 연구에서도 흡연군에서는 저연령군과 고연령군 간에 아무런 차이가 없었으나, 비흡연군에서는 통계적인 유의성은 없었지만 고연령군의 DNA 손상 정도가 4-11% 정도 높은 것으로 관찰되어 흡연의 DNA 손상에 미치는 영향이 연령보다 훨씬 강함을 알 수 있었다. 앞의 여러 연구결과를 종합해 볼 때 본 연구결과와 마찬가지로 DNA 손상정도에 가장 큰 영향을 미치는 것은 흡연력이라 할 수 있을 것이다.
- 같았다. 비흡연자에서 40세 미만과 40세 이상 군 사이의 comet length나 손상된 세포의 빈도의 차이는 통계적으로 유의하지 않았으며, 흡연군에서도 연령에 따른 차이는 관찰되지 않았다. 그러나 40세 이상 및 미만 군 모두에서 홉연자는 40세 미만의 비흡연자보다 comet length나 손상된 세포의 빈도가 유의하게 (p< 0.
- 본 연구에서도 흡연군에서는 저연령군과 고연령군 간에 아무런 차이가 없었으나, 비흡연군에서는 통계적인 유의성은 없었지만 고연령군의 DNA 손상 정도가 4-11% 정도 높은 것으로 관찰되어 흡연의 DNA 손상에 미치는 영향이 연령보다 훨씬 강함을 알 수 있었다. 앞의 여러 연구결과를 종합해 볼 때 본 연구결과와 마찬가지로 DNA 손상정도에 가장 큰 영향을 미치는 것은 흡연력이라 할 수 있을 것이다. 노화가 DNA 손상에 미치는 영향대한 연구들이 일관된 결과를 보이고 있지는 않지만 몇몇 연구는 고연령군에서 DNA 손상이 유의하게 증가한다는 결과를 보이고 있고, 이를 설명하는 대표적인 가설은 나이가 들어감에 따라 DNA 단일가닥 절단과 염기손상은 증가하지만 동시에 회복 능력은 줄어든다는 것이다(Piperakis 등, 1998; Zhu 등, 1999; Dhawan 등, 2001).
- 총 대상자를 분석한 결과 comet length와 손상된 세포의 빈도가 비흡연자에 비해 흡연자에서 유의하게 높게 나타났으며(표 1), DNA 손상과 성별, 연령, 흡연여부, 음주량 등의 몇몇 변수와의 상관성 분석 결과에서도 흡연 여부만이 높은 상관관계를 갖고있음을 알 수 있었다(표 2). 또한 40세 이상과 미만 및 흡연여부로 전체 대상자를 4개 군으로 나누어 비교한 DNA 손상 정도(그림 1)도 단지 흡연 집단과 40세 미만의 비흡연 집단 간에서만 DNA 손상에 유의한 차이가 있다고 나타났다.
- 하루 커피음용량이나 음주량에 따른 comet length와 손상된 세포의 빈도는 유의한 차이가 없었으나, 단지 주당 음주량이 소주 2병 이상인 군과 음주를 하지 않는 군 사이에는 유의한(p<0.05) 차이가 관찰되었다. 한편 성별과 연령에 따라서는 comet length나 손상된 세포의 빈도에 유의한 차이가 있는 것으로 관찰되었다.
- 05) 차이가 관찰되었다. 한편 성별과 연령에 따라서는 comet length나 손상된 세포의 빈도에 유의한 차이가 있는 것으로 관찰되었다.
- 흡연자에서 흡연량^ 따라 DNA 손상차이를 분석한 결과, 총흡연기간, 흐]루흡연개피수, SPY(smoke pack years, 20cigarettes per day per year)에 따라서 comet length와 손상된 세포의 빈도의 유의한 차이는 나타나지 않았다(표 3).
- 흡연자와 비흡연자의 comet length(|im)와 손상된 세포의 빈도는 통계적으로 유의한 차이가 관찰되어서, 흡연자의 평균 comet length 비흡연자에 비하여 8% 정도, 그리고 손상된 세포의 빈도는 29% 정도 높은 것으로 조사되었다(표 1). 하루 커피음용량이나 음주량에 따른 comet length와 손상된 세포의 빈도는 유의한 차이가 없었으나, 단지 주당 음주량이 소주 2병 이상인 군과 음주를 하지 않는 군 사이에는 유의한(p<0.
후속연구
- 이는 직장과 가정에서의 일상적인 간접흡연 노출의 계량화가 어려웠고 2점 척도답변에 주관적 요소가 크게 영향을 미쳤을 가능성이 있으며, 한과 김(2000)은 ETS 노출된 비흡연자에서 nicotine의 대사산물인 뇨 cotinine 농도가 유흥업소 종사자(과대 노출자)를제외하고는 비노출자와 유의한 차이가 없었음을 보고한 바 있다. 또한 Wojewodzka 등(1999)이 지적하였듯이 DNA 손상이 세포의 회복능력으로 신속히 복구될 만큼 ETS 노출이 적다면 유의한 차이가 관찰되지 못하였을 것이며 앞으로 간접흡연의 세포독성을 규명하는데는 과대 노출자를 포함하는 보다 세밀한 연구가 필요하다.
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