단세포전기영동법(single Cell Gel Electrophoresis Assay)을 이용한 농약 살포자의 DNA손상 평가 Evaluation of DNA damage in Pesticide Sprayers using Single Cell Gel Electrophoresis원문보기
Single cell gel electrophoresis (SCGE) assay, also called comet assay, is a rapid and sensitive method to detect DNA damage in single cell level. To evaluate the DNA damage of lymphocytes of pesticides sprayers, SCGE assay was carried out for 50 pesticides sprayer and 58 control subjects. They were ...
Single cell gel electrophoresis (SCGE) assay, also called comet assay, is a rapid and sensitive method to detect DNA damage in single cell level. To evaluate the DNA damage of lymphocytes of pesticides sprayers, SCGE assay was carried out for 50 pesticides sprayer and 58 control subjects. They were interviewed with structured questionnaire to get the information about the kinds and amount of pesticide. Insecticides and fungicides were predominant among pesticides. Major components of pesticides were organophosphorus, organosulfate, cartap, carbamates, and triazole. Sprayed pesticides were classified into two groups. Group I included organophosphorus, organoarsenic, organotin, tetrazine, triazole and gramoxone, which were known to cause DNA damages. Group II pesticide were carbamates, surfactants, organosulfates, etc., which were not found as DNA damaging agents in scientific documents. Olive tail moments of 100 lymphocytes were measured by KOMET 3.1 program for each person. The means of tail moments were compared between farmers exposed to pesticides and control subjects. Farmers showed higher tail moments than control subjects (2.07$\pm$1.40 vs 1.53$\pm$0.77, p<0.05). The means of tail moments also were compared among group I sprayers (n=36), group II sprayers (n=24) and, control subject, and the means or tail moments were 3.4s$\pm$3.2o, 2.66$\pm$2.20 and 1.53$\pm$0.77 respectively. The difference between means of group I sprayers and controls was statistically significant (p<0.05). In conclusion, this study showed higher DNA damage in farmers exposed to pesticides than control subjects, and comet assay could be useful as a biological monitoring method of genotoxic pesticides for farmers.
Single cell gel electrophoresis (SCGE) assay, also called comet assay, is a rapid and sensitive method to detect DNA damage in single cell level. To evaluate the DNA damage of lymphocytes of pesticides sprayers, SCGE assay was carried out for 50 pesticides sprayer and 58 control subjects. They were interviewed with structured questionnaire to get the information about the kinds and amount of pesticide. Insecticides and fungicides were predominant among pesticides. Major components of pesticides were organophosphorus, organosulfate, cartap, carbamates, and triazole. Sprayed pesticides were classified into two groups. Group I included organophosphorus, organoarsenic, organotin, tetrazine, triazole and gramoxone, which were known to cause DNA damages. Group II pesticide were carbamates, surfactants, organosulfates, etc., which were not found as DNA damaging agents in scientific documents. Olive tail moments of 100 lymphocytes were measured by KOMET 3.1 program for each person. The means of tail moments were compared between farmers exposed to pesticides and control subjects. Farmers showed higher tail moments than control subjects (2.07$\pm$1.40 vs 1.53$\pm$0.77, p<0.05). The means of tail moments also were compared among group I sprayers (n=36), group II sprayers (n=24) and, control subject, and the means or tail moments were 3.4s$\pm$3.2o, 2.66$\pm$2.20 and 1.53$\pm$0.77 respectively. The difference between means of group I sprayers and controls was statistically significant (p<0.05). In conclusion, this study showed higher DNA damage in farmers exposed to pesticides than control subjects, and comet assay could be useful as a biological monitoring method of genotoxic pesticides for farmers.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
따라서 이 연구는 국내에 comet assay를 사람에 적용한 예가 없으므로 일반인에 대한 참고치를 제시하고, 농약 살포근로자의 노출 영향을 평가하는 새로운 생물학적 지표로서 comet assay를 사용한 DNA 손상정도를 평가하여 노출평가에 대한 새로운 결과를 제시하고자 하였다.
제안 방법
슬라이드 간의 편차를 줄이기 위하여 슬라이드 상에 이름을 적은 부분 쪽부터 일정한 방향으로 관찰되는 모든 세포에 대하여 무작위로 tail moment 값을 측정하였다. 개인 간 또는 개인 내의 림프구 variability나 개인 건강상태를 고려하기 위하여 SCGE assay를 수행 시 개인 당 2개의 슬라이드를 제작하였으므로 적어도 100개의 세포를 관찰하였다. 1003] 관찰하여 얻은 tail moment 값의 Cronbach a는 0.
농약 살포자에 대한 조사는 조사대상 지역의 각 가구를 직접 방문하여 실시하였으며 조사대상자의 일반적인 특성인 성, 연령, 농작업과 관련된 총 농업종사기간, 현재 경작현황, 경작물 및 2000년 1월 이후 조사시점까지의 농약 살포 횟수, 또한 조사대상자의 DNA 손상에 영향을 끼칠 수 있는 흡연 관련 변수인 흡연량, 흡연기간, 상용하는 담배 명 및 음주관련 변수인 주량, 음주량, 주당 음주 횟수 및 음주 기간 등을 조사하였다.
대조군의 경우 면접 조사자가 건강진단센타와 산업의 학센타 및 시 보건소를 직접 방문하여 연구에 참여하기를 동의한 사람을 대상으로 농약살포자용과 같은 설문지를 이용하여 면접 조사를 실시하였다.
유기인계, 유기유황계, 칼탑제, 카바마이트계와 트리 아졸계 순으로 많았다. 사용된 농약은 DNA 손상이 알려진 유기인제 , 유기비소, 유기주석 , 테트라진, 트리아졸, 그라목손을 group I으로 그 외 기타 농약을 group II로 구분하여 group I, II 및 대조군의 tail moment값을 서로 비교하였다.
상완정맥에서 헤파린 처리된 진공 주사기(Becton Dickinson vacutainer systems)^- 약 1 ml의 혈액을 채혈 후 ice box 에 보관하여 채혈 당일에 실험실로 운반하여 즉시 림프구를 분리하여 comet assay에 사용하였다. 혈액 1 ml을 15 ml 의 conical tube(Coming, USA)에 옮긴 후, 동량의 serum- free RPMI 1640(Gibco BRL, USA)2로 희석한 후, 이를 1ml의 Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia, Sweden)을 이용하여 림프구를 분리하였다.
1)을 이용하여 슬라이드 당 50개의 세포로부터 olive tail moment(tail moment阁을 측정하였다. 슬라이드 간의 편차를 줄이기 위하여 슬라이드 상에 이름을 적은 부분 쪽부터 일정한 방향으로 관찰되는 모든 세포에 대하여 무작위로 tail moment 값을 측정하였다. 개인 간 또는 개인 내의 림프구 variability나 개인 건강상태를 고려하기 위하여 SCGE assay를 수행 시 개인 당 2개의 슬라이드를 제작하였으므로 적어도 100개의 세포를 관찰하였다.
슬라이드 관찰직전에 DNA inercalating agent인 ethidium bromids (10 eVml) 50仕1로 형광염색하여 515-560 nm의 excitation filter와 590 nm barrier filter를 이용하여 형광현미경 하에서 판독하였다. 염색한 슬라이드는 형광현미경하에서 image analysis software(Komet 3.1)을 이용하여 슬라이드 당 50개의 세포로부터 olive tail moment(tail moment阁을 측정하였다. 슬라이드 간의 편차를 줄이기 위하여 슬라이드 상에 이름을 적은 부분 쪽부터 일정한 방향으로 관찰되는 모든 세포에 대하여 무작위로 tail moment 값을 측정하였다.
1800 rpm에서 15분간 원심분리한 후 분리된 림프구를 serum free RPMI 1640으로 세 번 세정하였다. 적정 세포수를 얻기 위해 혈구측정기 (Improved neubauer haematocytometer, Germany)로 세포수를 계수하여 약 5~6X 105/ml이 되도록 희석 또는 농축하였으며 림프구 분리 후 즉시 comet assay를 실시하였다.
4)에 5분씩 세 번 washing한다. 직접 결과 관찰을 하지 않을 슬라이드는 에탄올(absolute ethanol, Sigma)로 5분간 고정한 후 추후 관찰하였다. 실험은 추가적인 DNA 손상을 막기 위하여 황색등 아래서 실시하였다.
대상 데이터
대조군으로는 서울시 일부대학 건강진단센타와 산업의학센타의 건강진단에 참여한 사람 및 일부 도시 보건소 방문자를 대상으로 하였으며 이 중 직업적으로 농약에 노출된 적이 없고 혈액채취와 면접조사에 응한 58명을 연구 대상으로 하였다.
사전에 면접조사방법과 설문내용에 대하여 교육을 받은 2 명의 면접조사원이 개인면접법을 이용하여 설문조사 자료를 수집하였다. 농약 살포자에 대한 조사는 조사대상 지역의 각 가구를 직접 방문하여 실시하였으며 조사대상자의 일반적인 특성인 성, 연령, 농작업과 관련된 총 농업종사기간, 현재 경작현황, 경작물 및 2000년 1월 이후 조사시점까지의 농약 살포 횟수, 또한 조사대상자의 DNA 손상에 영향을 끼칠 수 있는 흡연 관련 변수인 흡연량, 흡연기간, 상용하는 담배 명 및 음주관련 변수인 주량, 음주량, 주당 음주 횟수 및 음주 기간 등을 조사하였다.
조사대상 농약 살포자는 의정부시 농업기술센타의 협조를 얻어 비교적 농작업이 많은 것으로 생각되어지는 6개 동(전체 12개 동)의 농민 72명을 대상으로 직접 방문하여 설문조사와 채혈을 시행하였다. 조사대상자 중 현재 농사일을 중단하였거나 2000년 1월 이후 농약을 살포한 적이 없거나 부적합한 22명을 제외한 50명을 분석대상으로 하였다.
채혈을 시행하였다. 조사대상자 중 현재 농사일을 중단하였거나 2000년 1월 이후 농약을 살포한 적이 없거나 부적합한 22명을 제외한 50명을 분석대상으로 하였다.
데이터처리
사용하였다. 농약을 살포한 농민들과 대조군과의 비교는 t-testf- 수행하였다. 살포한 농약의 종류에 둘로 분류하였는더】, 유기인제, 유기비소, 유기주석, 테트라진, 트리아졸, 그라목손 등 유전자 손상이 보고된 농약을 group 으로 그 외유 전자 손상에 대한 보고가 없는 농약을 group II로 구분하여 , I군, 2군, 대조군의 tail moment를 분산분석을 이용하여 분석하였고, 다중 비교는 Duncan 방법을 사용하였다.
농약을 살포한 농민들과 대조군과의 비교는 t-testf- 수행하였다. 살포한 농약의 종류에 둘로 분류하였는더】, 유기인제, 유기비소, 유기주석, 테트라진, 트리아졸, 그라목손 등 유전자 손상이 보고된 농약을 group 으로 그 외유 전자 손상에 대한 보고가 없는 농약을 group II로 구분하여 , I군, 2군, 대조군의 tail moment를 분산분석을 이용하여 분석하였고, 다중 비교는 Duncan 방법을 사용하였다.
조사대상자들의 일반적 특성에 관한 통계적 유의성은 Chi- square test로로 분석하였고, tail moment 값은 각 조사대상자당 100개 세포를 관찰하여 그 평균값을 tail momnet 값으로 사용하였다. 농약을 살포한 농민들과 대조군과의 비교는 t-testf- 수행하였다.
성능/효과
82이였다. 대조군의 1.53에 비해 group I과 group "를 살포한 경우에 통계적으로 유의하게 증가된 tail moment을 보였고 (p<0.05 by ANOVA), 분산분석 후의 다중비교를 실시한 결과 세 개의 군 중에서 group J를 살포한 경우와 대조군이 통계적으로 유의하였다(Eble 6).
55로 나타났다(Table 2). 그러나 이 연구 이후 우리 실험실에서 Komet 4.0 프로그램을 사용하여 대조군 41 명에 대한 조사를 한 결과 90 percentile값은 1.9로 낮게 나왔다. 그러나 평균값은 1.
69였다. 남녀 간에 차이가 통계적으로 유의하지 않았고, 표본크기도 작기 때문에 참고치를 구하기 위해 전체 대조군의 90 percentile 값을 구한 결과 2.55로 나타났다(Table 2). 그러나 이 연구 이후 우리 실험실에서 Komet 4.
농약 살포자와 대조군의 tail moment값의 분포를 조사한 결과 농약 살포자에서 tail moment의 평균값이 높은 것은 전체적인 농약 살포자와 대조군이 서로 다른 분포를 보이는 것이 아니라 일부 농약 살포자의 tail moment값이 높기 때문이라는 것을 알 수 있다. 이것은 농약 살포량, 살포 농약, 살포 기간 등 다양한 요인들로 인해서 농약 살포에 따른 DNA손상이 많은 사람들이 일부 존재한다는 것을 보여주고 있다.
연령군에 따른 tail moment 값은 연령이 증가함에 따라 일정한 형태를 보여주지 않고 있으며, 통계적으로도 유의한 차이를 보이지 않았다(Table 2). 대조군의 평균 tail moment값으로부터 일반인들의 참고치를 구하기 위해 90 percentile값을 구한 결과 2.55가 산출되었는데, 이후 Komet 4.0으로 수행한 서울지역 대조군에 대한 우리 실험실의 다른 연구에서는 90 percentil 값이 1.9였다(unpublished data) (Table 2).
살포 농약에 따라 유전자 손상을 일으키는 것으로 보고된 경우와 그렇지 않은 경우를 나누어서 분석한 결과 유전자 손상을 일으키는 농약을 살포한 경우가 그렇지 않은 농약을 살포한 경우보다 tail moment값은 높았지만, 분산 분석의 다중비교에서는 통계적인 차이를 보이지 않았다(Table 6). 두 종류의 농약 살포에 따른 tail moment값의 차이가 통계적으로 유의하지 않은 것은 표본의 크기가 작을 뿐 아니라, 여러 종류의 농약을 살포하기 때문에 실제로 DNA손상을 일으키는 농약을 살포한 양^ 대한 조사가 이뤄지지 못한 한계를 가지고 있기 때문인 것으로 생각한다.
우리 연구 결과 농약 살포자에 있어서 tail moment 값은 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 높게 나타났고(농악살포자 2.07, 대조군 1.53, Table 5), 연령, 성별, 흡연에 따른 차이는 유의하지 않았다(Table 2-4). 이러한 결과는 Garaj- Vrhovac와 Zeljezic(1999, 2000)의 결과와 일치하는 것이며 농약 살포근로자에 있어 염색체 이상을 증가시키고, 자매염색분체 교환을 야기한다는 결과와 일치하는 것이다.
유전자 독성을 검사하는데 있어 comet assay의 민감성과 간편성 등을 고려해 볼 때 농약 살포에 따른 유전 독성을 평가하는 방법으로 comet assay가 유용할 것으로 판단되었다. 따라서 이 연구는 국내에 comet assay를 사람에 적용한 예가 없으므로 일반인에 대한 참고치를 제시하고, 농약 살포근로자의 노출 영향을 평가하는 새로운 생물학적 지표로서 comet assay를 사용한 DNA 손상정도를 평가하여 노출평가에 대한 새로운 결과를 제시하고자 하였다.
이 연구 결과 조사대상자와 대조군 간에 성별, 연령별, 흡연 등에 의한 tail moment값의 차이를 보이지 않았고, 농약 살포 자와 대조군 간에 유전자 손상이 농약 살포자에서 일반인보다 통계적으로 유의하게 높았으며 특히 DNA 손상이 알려진 group I 농약을 살포한 경우 높은 DNA 손상 정도를 보였다. 그러므로 이 연구는 농약 노출에 의해 림프구 DNA손상이 증가한 결과를 보였다.
후속연구
그러므로 이 연구는 농약 노출에 의해 림프구 DNA손상이 증가한 결과를 보였다. 림프구의 DNA 손상이 개인 간의 변이가 매우 큰 것을 감안할 때 각 개인에서의 유전자 손상에 대한 절대평가에는 제한적이지만 림프구에서의 comet assay 결과는 농약 살포자에 대한 집단적인 유전자 손상을 평가하는 방법으로는 매우 유용할 것으로 생각하며, 향후 개인적인 감수성, 농약 노출 지표에 의한 노출 평가 등을 통해 개인 수준에서의 농약 노출에 의한 유전자 손상연구가 필요할 것으로 생각한다.
이것은 농약 살포량, 살포 농약, 살포 기간 등 다양한 요인들로 인해서 농약 살포에 따른 DNA손상이 많은 사람들이 일부 존재한다는 것을 보여주고 있다. 이런 현상이 농약 살포에 의한 것인지 개인적인 감수성 등에 의해 영향을 받는지 여부 등은 향후 조사가 더 이뤄져야 할 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.