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문제 정의
- 따라서 본 연구는 불용성 단백질이 80% 함유된 ESM을 분해하여 수용화한 후 식품소재로 활용하고자 Bacillus lichetiiformis로 분해한 효소분해 난각막분해물(enzyme-degradation egg shell membrane hydrolysate, EESMH)과 IN NaOH-Ethanol로 분해한 알칼리분해 난각막 분해물(alkalic -degradation egg shell membrane hydrolysate, AESMH)을 제조하여 성분을 분석하고, 난각막 분해물의 기포성, 유화성, 항산화성 등의 식품학적 기능을 확인하였다.
- 본 연구는 난긱막(egg shell membrane)에 keratinase를 생성하는 Bacillus licheniformis를 배양하여 제조한 효소분해난각막분해물(enzyme-degradation egg shell membrane hydrolysate, EESMH)과 IN NaOH-Ethanol로 분해한 알칼리분해 난각막분해물(alkalic-degradation egg shell membrane hydrolysate, AESMH)을 제조하여 식품소재로 활용하고자 성분분석 및 분해물의 유화성, 거품형성력, 항산화력 등의 식품학적 기능을 확인하였다. 즉, EESMH의 생산수율은 약 15% 였고 AESMH의 경우 약 70%의 수율로 가수분해물이 생성됐으며 아미노산 분석 결과 EESMH와 AESMH의 아미노산구성은 주성분이 aspartic acid, glutamic acid, cystine으로 큰차이가 없었으나 EESMH의 경우 histidine] 18.
제안 방법
- 0으로 조절한 후 균질기로 8, 500rpm에서 30초간 거품을 형성하였다. 거품 형성력은 생성된 거품 부피(ml)로 나타내었으며 안정성은 0, 10, 20, 30, 60분 간격으로 방치시간에 따른 거품부피 변화로나타내었다.
- 수율은 약 70%였다. 그리고 EESMHe ESM이 30g 첨가된 1, 의 Nitrobacter 203배지에 Bacillus licheni-㎛mis를 접종하여 50℃에서 1주일간 배양한 후 규조토 여과 및 원심 분리하여 분해되지 않은 난각막을 제거하고, 고형분이 제거된 상등액에 30—80% ammonium sulfate로 단백질을침전시켜 투석 후 동결 건조하여 수율 약 15%의 분해물을 획득하였다.
- 0으로 조절하였다. 그리고 난각 막 분해물을 탈염기 (Microacilyzer G3, Japan)로 탈염한 후 70%ehtanol로 단백질을 침전시켰으며 침전된 단백질을 원심분리 (8.000rpm, 15min)하여 동결 건조하고 화학적 ESM 가수 분해물인 AESMH를 제조하였다. EESMH는 Nitrobacter 203 배지에 ESM 3 %와 0.
- 난각막 분해물의 유화 활성은 pH 6.5, 20E에서 실험하였으며, 500nm에서 혼탁도의 변화로서 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 원심분리 후 상등액을 사용하여 Bradford법(Tsaffrir and Zvi, 1996)으로 595nm에서 단백질을 정 량하였다. 단백질용해성은 난각막 분해물 1g중의 단백질 함량을 기준으로 상등액의 단백질 함량을 분석하여 백분율로 측정하였다.
- 즉 2% NaCl 용액에 단백질 농도가 5%가 되도록 건조된 단백질 시료를 첨가하여 용해시킨 후soybean oil과 1 : l(v : v)로 혼합하였다. 이 혼합물을 polytron (PT3000, Switzerland)으로 9, 500rpm에서 1분간 균질한 후 유화물을 75℃, 30분간 가열하여 분리된 soybean oil 량을측정하였고, 가열 전 soybean oil 함량과 비교하여 잔량을 측정하였다.
- 즉, 각 시료 2g에 증류수 20ml씩을 가하여 눈금 실린더에 취하고 pH를 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0 및 12.0으로 조절한 후 균질기로 8, 500rpm에서 30초간 거품을 형성하였다. 거품 형성력은 생성된 거품 부피(ml)로 나타내었으며 안정성은 0, 10, 20, 30, 60분 간격으로 방치시간에 따른 거품부피 변화로나타내었다.
- 0까지 측정하였다. 즉, 증류수 10ml에 난각막 분해 물 1g을 첨가하여 실온에서 1시간동안 용해시키고 25℃에서 15분간 원심 분리(8000rpm) 하였다. 원심분리 후 상등액을 사용하여 Bradford법(Tsaffrir and Zvi, 1996)으로 595nm에서 단백질을 정 량하였다.
- 1 (w/v)% 되게 시료를 균질, 용해시킨 후 15ml 을 취하여 5ml의 soybean oil(제일제당)을 가하고 polytron (PT3000, Switzerland)으로 9, 500rpm에서 1분간 균질, 혼합하였다. 혼합된 유화물 50㎕를 5ml의 0.1% SDS 용액에 가하고 교반 후 즉시 500nm의 흡광도에서 혼탁도의 변화로서 유화 활성을 측정하였다. 유화 안정성은 Kim과 Han(1991)의 방법을 변형하여 실험하였다.
- 0ml에 난각막 분해물을 농도별로 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 혼합물은 37℃에서 27시간동안 반응시키면서 3 시간 간격으로 반응액 0.1ml 취해 80% ethyl alcohol을 9.7ml 을 첨가하고, 30% ammonium thiocyanate O.ltnl와 20mM ferrous ammonium sulfate-3.5% hydrochloric acid의 0.1ml을첨가한 다음, 3분후 500nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 난각막은 계란 할란후 폐기물로 발생되는 난각막이 부착된 난각에서 난각막을 회수한 후 흐르는 물로 5회 이상 세척하여 난각 및 난백을 제거하고 50℃의 열풍건조기로 건조하여 분쇄한 후 사용하였다.
이론/모형
- Bacillus licheniformis와 IN NaOH-Ethanol에 의해서 분해된 ESM의 아미노산 조성은 Pico-Tag(Young In Science Co, 1992) 방법에 따라 HPLC(HP 1100 HPLC system, USA)로분석하였으며 분석 조건은 Table 1과 같다.
- Kato 등(1987)의 방법에 따라 2% NaCI(pH 6.5)용액에 단백질 함량이 0.1 (w/v)% 되게 시료를 균질, 용해시킨 후 15ml 을 취하여 5ml의 soybean oil(제일제당)을 가하고 polytron (PT3000, Switzerland)으로 9, 500rpm에서 1분간 균질, 혼합하였다. 혼합된 유화물 50㎕를 5ml의 0.
- 거품 형성력은 Wang과 Kinsella(1976)의 방법을 이용하였다. 즉, 각 시료 2g에 증류수 20ml씩을 가하여 눈금 실린더에 취하고 pH를 2.
- 즉, 증류수 10ml에 난각막 분해 물 1g을 첨가하여 실온에서 1시간동안 용해시키고 25℃에서 15분간 원심 분리(8000rpm) 하였다. 원심분리 후 상등액을 사용하여 Bradford법(Tsaffrir and Zvi, 1996)으로 595nm에서 단백질을 정 량하였다. 단백질용해성은 난각막 분해물 1g중의 단백질 함량을 기준으로 상등액의 단백질 함량을 분석하여 백분율로 측정하였다.
- 항산화력 실험은 Jeon 등(1997)과 Kiharu 등(1990)의 방법에 따라 증류수 1ml에 linolenic acid(Sigma Co.) 2mg를 첨가한 용액과 증류수 1ml에 Tween-20 10mg를 첨가한 용액 그리고 1시간동안 aeration시킨 0.2M potassium phosphate(pH7.4) 1.0ml에 난각막 분해물을 농도별로 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 혼합물은 37℃에서 27시간동안 반응시키면서 3 시간 간격으로 반응액 0.
성능/효과
- 유화 활성의 경우 EDESMH가 더 효과가 있었으며, 유화 안정성도 EESMH 가 AESMH보다 약 8% 안정하였다. 거품 형성력은 AESMH 가 EESMH보다 모든 pH 범위에서 약 2배 정도 높았으며 안정성도 우수하였다. 항산화력의 경우 AESMU가 항산화력 이 높은 것으로 확인하였고 EESMH의 경우 전체적으로 매우 약하게 나타났다.
- George등(1981)은 6M HC1 을 이용하여 가수분해한 난각막의 아미노산의 조성을 보고하였는데, 이 보고된 내용과 비교했을 때 AESMH는 아주 유사한 함량을 보여주었고, AESMH와 마찬가지로 HC1 로 분해했을 때 보다 EESMH의 경우는 histidine의 함량이 약 6배 정도 높게 나타났다. 결과적으로 전체적인 아미노산의 함량 차이는 화학적인 분해 방법과 keratinase의 분해 방법에 따른 차이로 사료된다.
- 5, 6, 7에 나타내었다. 그 결과 EESMH보다 AESMH가 항산화력이 우수한 것으로 나타났으며, 농도별로 볼 때 AESMH 0.5%일 경우에 항산화력 이 인정되었다. 식품에 많이 사용되고 있는 천연 항산화제인 0.
- 5, 20E에서 실험하였으며, 500nm에서 혼탁도의 변화로서 측정하였다. 그 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 유화 활성은 대조구로 사용한lecithin (A)의 유화력이 가장 높았고, EESMH(B), AESMH (C)의 순으로 나타났다. 또한 EESMH는 단백질 농도가 0.
- Kim 등(1987)에 의하면 등전점 부근에서 거품형성력이 최소 값을 나타낸다고 보고하였고, 거품 형성력과 안정성은 단백질 용액의 pH, 이온 강도, 이물질, 온도 등에 영향을 크게 받는다고 보고되었다. 그러나 본 실험에서는 등전점 부근에서 최소값이 확인되지 않았으며 따라서 EESMH와 AESMH는 pH에는 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한 거품 안정성은 Table 3에서 보는 바와 같이 EESMH의 경우 10분 후에 거의 기포가 소멸하는 것을 확인할 수 있었고, AESMH는 10분까지는 안정하였으나 30분 후에는 거의 소멸되었다.
- 그리고 각 단백질은 시간이 경과함에 따라 유화력이 서서히 감소하였다. 난각막 분해 단백질의 유화활성은 lecithin보다는 낮았지만 pH에 거의 영향을 받지 않는 안정한 유화 성을 보여주었다. 中村禮郎 등(1986)에 의하면 유화성은 용해성과 아주 유사한 양상을 나타낸다고 보고한 바와 같이 AESMH 보다 EESMH가 유화활성이 더 높게 나타났다.
- 난각막 분해물의 용해성을 측정하기 위해 pH 2.0부터 pH 12.0까지 실험한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 EESMH는 99% 이상 용해되었고 AESMH의 경우는 96% 이상 용해성을 나타냈다. Park 등(1990)과 Yang(1996)은 식품성 단백질과 whey protein을 가수 분해한 peptide가 등전점 부근에서용해성이 낮게 나타난다고 보고하였으나 난각막 분해물 의용 해성은 pH 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다.
- 56%에 비해 6배 정도 함량이 높게 나타났다. 단백질의 기능적 특성 측면에서 용해성은 EESMU와 AESMH 모두 95%이상의 높은 용해성을 나타내었다. 유화 활성의 경우 EDESMH가 더 효과가 있었으며, 유화 안정성도 EESMH 가 AESMH보다 약 8% 안정하였다.
- 2에서 보는 바와 같이 유화 활성은 대조구로 사용한lecithin (A)의 유화력이 가장 높았고, EESMH(B), AESMH (C)의 순으로 나타났다. 또한 EESMH는 단백질 농도가 0.5 %부터는 AESMH에 비해 약간 높은 유화력을 보여주었다. 그리고 각 단백질은 시간이 경과함에 따라 유화력이 서서히 감소하였다.
- 이 중 EESMH의 경우 histidine, aspartic acid, glutamic acid, cystine등의 순으로 구성되어 있었으며, AESMH는 glutamic acid, cystine, aspartic acid, pro-line 등의 순으로 확인되었다. 또한 EESMH와 AESMH의 아미노산 구성은 대체적으로 큰 차이는 없었지만, 아미노산중에서 histidine의 경우 EESMH이 18.69%였고 AESMH는 2.56%으로 큰 차이를 보여주었으며, aspartic acid는 10.58%, 8.67% 그리고 glutamic acid는 9.39% 와 13.56%로 약간의 차이를 보여줬다. George등(1981)은 6M HC1 을 이용하여 가수분해한 난각막의 아미노산의 조성을 보고하였는데, 이 보고된 내용과 비교했을 때 AESMH는 아주 유사한 함량을 보여주었고, AESMH와 마찬가지로 HC1 로 분해했을 때 보다 EESMH의 경우는 histidine의 함량이 약 6배 정도 높게 나타났다.
- 그러나 본 실험에서는 등전점 부근에서 최소값이 확인되지 않았으며 따라서 EESMH와 AESMH는 pH에는 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한 거품 안정성은 Table 3에서 보는 바와 같이 EESMH의 경우 10분 후에 거의 기포가 소멸하는 것을 확인할 수 있었고, AESMH는 10분까지는 안정하였으나 30분 후에는 거의 소멸되었다. Chun 등(1998) 은 참깨박 단백질이 거품 형성 후 30분 이후에 거품 부피가 50% 이하로 떨어졌고, 효소 처리한 경우에는 90분 경과 시 최고 80%까지 유지되었다고 보고하였다.
- 이것은 용해성과 유화 활성은 분자의 표면상태에 의하여 영향을 받는 것으로 생각된다. 유화 안정성은 Fig. 3에 나타낸 바와 같이soybean oil을 lecithin, EESMH 그리고 AESMH와 l:l(v:v)으로 혼합한 다음 75 ℃ 에서 30분간 가열한 후 분리된 soybean oil을 측정한 결과 lecithine 27%가 분리되었고, EESMH는 40.2% 그리고 AESMH는 48.8%로 나타났다. 유화 안정성도 AESMH보다 EESMH의 경우가 약 8% 정도 안정성을 보여줬다.
- 단백질의 기능적 특성 측면에서 용해성은 EESMU와 AESMH 모두 95%이상의 높은 용해성을 나타내었다. 유화 활성의 경우 EDESMH가 더 효과가 있었으며, 유화 안정성도 EESMH 가 AESMH보다 약 8% 안정하였다. 거품 형성력은 AESMH 가 EESMH보다 모든 pH 범위에서 약 2배 정도 높았으며 안정성도 우수하였다.
- Kim과 Lee(1987)와 Kim과 Han(1991)이 보고한 루우핀 콩 단백질, 혈장 단백질과 근원 섬유 단백질의 기능적 특성에서 NaCl과 pH 조절에 의한 용해성이 약 80% 정도이며, Park 등(1990)은 참깨 단백질이 약 73%, 들깨 단백질은 63% 그리고 대두 단백질이 86%이라고 보고하였다. 이 결과로 볼 때 난각막 분해물은 Kim 등(1987)과 Kim 등(1991)이 보고한 단백질보다 용해성이 우수함을 확인하였다.
- 기능을 확인하였다. 즉, EESMH의 생산수율은 약 15% 였고 AESMH의 경우 약 70%의 수율로 가수분해물이 생성됐으며 아미노산 분석 결과 EESMH와 AESMH의 아미노산구성은 주성분이 aspartic acid, glutamic acid, cystine으로 큰차이가 없었으나 EESMH의 경우 histidine] 18.69%로 AESMU의 2.56%에 비해 6배 정도 함량이 높게 나타났다. 단백질의 기능적 특성 측면에서 용해성은 EESMU와 AESMH 모두 95%이상의 높은 용해성을 나타내었다.
- 거품 형성력은 AESMH 가 EESMH보다 모든 pH 범위에서 약 2배 정도 높았으며 안정성도 우수하였다. 항산화력의 경우 AESMU가 항산화력 이 높은 것으로 확인하였고 EESMH의 경우 전체적으로 매우 약하게 나타났다.
- 효소분해 (EESMH)와 화학적 분해 (AESMH) 난각막 단백질 가수분해물의 거품 형성력을 측정한 결과는 Fig. 4에서보는 바와 같이 거품형성 즉시 pH 2~12 범위에서 AESMH가 EESMH보다 약 2배 정도 거품 형성력이 높았다. 이는 AESMH와 EESMH를 구성하고 있는 단백질의 함량과 구성 아미노산의 차이에 의한 것으로 생각된다.
후속연구
- 즉, Dipeptide0] 경우 alanine을 N말단으로 하였을 때 Ala -His, Ala-Met, Ala-Tyr 및 Ala-Try의 항산화력이 좋은 것으로 나타났으며, 특정 아미노산이 N 말단에 위치하는가 C 말단에 위치하는가에 의하여 항산화력이 크게 영향을 받기 때문에 peptide중의 아미노산의 위치에 의한 입체 배위가 항산화력에 크게 관여한다고 추정하고 있다. 따라서, EESMH와 AESMH의 항산화 효과는 peptide 함량과 생성된 peptide의 종류 즉 peptide의 분자량이 나 구성 아미 노산의 종류 등에 기인하는 것으로 생각되며 분해물 내에 존재하는 peptide에 대한 연구가 좀더 진행되어야 명확할 것으로 사료된다.
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