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문제 정의
- 미치는 영향을 조사하였다. 또한 미생물제재를 처리한 토양의 미생물상의 변화를 확인하여 환경에 미치는 미생물제재의 영향을 연구하였다.
- 본 연구는 유기물이 풍부한 토양에서 분리한 토양미생물을 분리하여 동정하였고, 이 미생물을 사용하여 미생물제재를 만들었으며 이 미생물제재가 배추와 토마토의 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 미생물제재를 처리한 토양의 미생물상의 변화를 확인하여 환경에 미치는 미생물제재의 영향을 연구하였다.
제안 방법
- 공시작물의 포장시험에서 시험구의 배치는 Fig1. (a)에서 보는 바와 같이 완전임의배치법 (Completely randomized design)을 이용, 3회 반복 처리로 하여 1 m×1 이의 면적에 미생물제재를 처리하지 않은 무 처리구, 제품에 명시된 표준량을 처리한 기준량 처리구, 기준량에 두 배로 처리한 배량 처리구로 하였고, 시험 처리구 당 두 종류의 공시작물의 재식은 Fig. 1. (b)와 같이 실시하였다.
- 미생물제재를 처리한 후 기계적으로 표층과 표층에서 20 cm 깊이의 하층 토양을 고루 섞어 주었다. 공시작물에 대한 미생물제재의 특성과 효과를 조사하기 위해서 배추와 토마토의 생체중으로 지상부 생체중, 경장으로 지상부의 높이, 경태로 공시작물 줄기의 직경, 근중으로 밑 둥으로부터 2 cm 하단 부의 토양을 수세시킨 후 생체중, 근장으로 뿌리를 곧게 편 후 최장길이, 엽면적으로 잎의 면적을 각각 측정하였다.
- 미생물의 탄소원 이용도를 비교하여 미생물을 동정하는 API 50CH/B kit를 사용하여 토양에서 분리하여 미생물제재의 제조에 사용한 균주를 동정하였다. 토양에서 분리하여 미생물제재의 제조에 사용한 균주의 다양한 탄소원의 이용도는 Table 1과 같으며 이 결과를 바탕으로 계산된 균주의 명칭은 Bacillus coagulansSe 확률이 98%이었다.
- 미생물제재가 배추 재배토양의 미생물 상에 미치는 영향을 조사하기 위하여 제재를 처리하지 않은 토양과 기준량 및 배량 처리한 토양을 처리 전과 처리 후의 토양을 채취하여 각각의 토양에 존재하는 총균수와 균종 별 밀도를 조사하여 토양미생물의 구성 및 균들의 수적인 변화는 Fig. 2와 균종 별 증가율은 Fig. 3에 나타냈다. 미생물제재를 처리하지 않은 배추 재배지 토양의 총균수는 179.
- 미생물제재를 처리하기 직전과 처리한 후 공시작물을 재배한 뒤, 2주 단위로 총 3회씩, 공시작물의 재배토양 표면으로부터 깊이 10 cm까지의 흙을 채취한 후, 가는 체로 고른 다음 0.85% (w/v) NaCl 멸균수에 현탁 시킨 다음 선택배지를 사용하여 미생물제재의 처리량 채취 시기별 및 균 종류별로 희석법과 한천배지 평판 도말법으로 토양내의 미생물의 종류별 계수를 실시하였다[12]. 실험에 사용한 선택배지의 종류로는 일반 세균을 선별하는 Tryptic Soy Agar (TSA), 방선균을 선별하는 Actinomycetes Isolation Agar (AIA), 곰팡이의 선별에 사용하는 Potato De×trose Agar (PDA) 에 50 ㎍/1의 Chloramphenicol을 함께 사용하였으며, 트리코데마를 선별하는데는 Malt E×tract Agar (MEA)에 항생제로 Chlorotetracyclin을 20 μg/l 첨가한 배지를 사용하였다.
- 공시작물인 배추와 토마토를 재배할 토양에 투여된 미생물제재의 처리는 토양 1 n? 당 물 10 1를 살포한 무 처리구, 물 10 1에 미생물제재 400 g을 녹여 토양 1 n?에 살포한 기준량 처리구와 물 10 1에 미생물제재 800 g을 녹여 토양 1 mMl 살포 한 배량 처리구로 구분지어 처리하였다. 미생물제재를 처리한 후 기계적으로 표층과 표층에서 20 cm 깊이의 하층 토양을 고루 섞어 주었다. 공시작물에 대한 미생물제재의 특성과 효과를 조사하기 위해서 배추와 토마토의 생체중으로 지상부 생체중, 경장으로 지상부의 높이, 경태로 공시작물 줄기의 직경, 근중으로 밑 둥으로부터 2 cm 하단 부의 토양을 수세시킨 후 생체중, 근장으로 뿌리를 곧게 편 후 최장길이, 엽면적으로 잎의 면적을 각각 측정하였다.
- , Korea)에 멸균되어 준비된 5 L의 동일 배지에 5% (v/v)를 접종하여 전배양과 동일한 방법으로 3일간 배양하였다. 배양액 1 1를 9 kg의 미강에 혼합시킨 후, 30℃에서 24시간 배양하여 10% (w/w) 이하의 수분함량을 유지하는 미 생물제재 를 제조하였으며 미 생물제재에 존재하는 생균의 함량은 9.6 ± 0.6 × 106 CFU/g이었다.
- 전배양은 고체 배지에서 일정시간 배양한 균주를 백금이에 취하여 500 ml 용량의 플라스크에 멸균하여 준비된 120 ml의 배지에 접종한 후, 30℃에서 180 rpm의 진탕 속도로 48시간 진탕 배양하였다. 본배양은 전배양한 배양액을 7 L 용량의 생물 배양기(KoBioTech Co. Ltd., Korea)에 멸균되어 준비된 5 L의 동일 배지에 5% (v/v)를 접종하여 전배양과 동일한 방법으로 3일간 배양하였다. 배양액 1 1를 9 kg의 미강에 혼합시킨 후, 30℃에서 24시간 배양하여 10% (w/w) 이하의 수분함량을 유지하는 미 생물제재 를 제조하였으며 미 생물제재에 존재하는 생균의 함량은 9.
- 채취한 토양 시료는 멸균수로 희석한 후 Nutrient agar 배지를 사용하여 평판 도말법으로 미생물을 분리하였다. 분리한 균주는 API 50CH/B kit (BioMerieu×, France)를 사용하여 일차 동정하였으며 16s rRNA의 염기서열을 분석하여 확인하였다.
- 실험에 사용한 선택배지의 종류로는 일반 세균을 선별하는 Tryptic Soy Agar (TSA), 방선균을 선별하는 Actinomycetes Isolation Agar (AIA), 곰팡이의 선별에 사용하는 Potato De×trose Agar (PDA) 에 50 ㎍/1의 Chloramphenicol을 함께 사용하였으며, 트리코데마를 선별하는데는 Malt E×tract Agar (MEA)에 항생제로 Chlorotetracyclin을 20 μg/l 첨가한 배지를 사용하였다. 선별 배지에 도말한 미생물은 30℃에 48 시간 배양하여 형성된 콜로니수를 측정하였다. 토양 상의 총균수는 이들 선택배지를 사용하여 계수된 개별 미생물들의 생균수의 총 합계로 계산하였다.
- (b)와 같이 실시하였다. 공시작물인 배추와 토마토를 재배할 토양에 투여된 미생물제재의 처리는 토양 1 n? 당 물 10 1를 살포한 무 처리구, 물 10 1에 미생물제재 400 g을 녹여 토양 1 n?에 살포한 기준량 처리구와 물 10 1에 미생물제재 800 g을 녹여 토양 1 mMl 살포 한 배량 처리구로 구분지어 처리하였다. 미생물제재를 처리한 후 기계적으로 표층과 표층에서 20 cm 깊이의 하층 토양을 고루 섞어 주었다.
- 선별 배지에 도말한 미생물은 30℃에 48 시간 배양하여 형성된 콜로니수를 측정하였다. 토양 상의 총균수는 이들 선택배지를 사용하여 계수된 개별 미생물들의 생균수의 총 합계로 계산하였다.
대상 데이터
- 미생물제재의 제조에 사용된 미생물은 경남 김해에 위치하는 동아대학교 부속농장의 유기물이 풍부한 토양에서 분리하였다. 채취한 토양 시료는 멸균수로 희석한 후 Nutrient agar 배지를 사용하여 평판 도말법으로 미생물을 분리하였다.
- 미생물제재의 효과를 검정하기 위한 공시작물로는 배추와 토마토를 사용하였다. 시험 장소는 경상남도 김해시 소재 동아대학교 생명자원과학부 실험 농장에서 실시하였으며, 미생물 동정 및 토양 이화학적 조성규명 시험과 공시작물의 포장시험으로 나누어 두 가지의 시험을 동시에 수행하였다.
- 분리한 균주를 5.0 g/1의 K2HPO4, 1.0 g/1의 NaCl, 0.2 g/1 의 MgSO4 - 7H2Oz 0.6g/l의 (NH4)2SO4 (Sigma Co., U.S.A) 및 2.5 g/1의 효모 추출물(yeast e×tract, Difco Lab.,USA.)이 포함된 배지를 사용하여 배양하였으며, 탄소원으로 포도당을 별도로 멸균한 후, 멸균된 배지에 무균적으로 2.0%(w/v)으로 혼합하여 사용하였다. 전배양은 고체 배지에서 일정시간 배양한 균주를 백금이에 취하여 500 ml 용량의 플라스크에 멸균하여 준비된 120 ml의 배지에 접종한 후, 30℃에서 180 rpm의 진탕 속도로 48시간 진탕 배양하였다.
- 토마토를 사용하였다. 시험 장소는 경상남도 김해시 소재 동아대학교 생명자원과학부 실험 농장에서 실시하였으며, 미생물 동정 및 토양 이화학적 조성규명 시험과 공시작물의 포장시험으로 나누어 두 가지의 시험을 동시에 수행하였다. 공시작물의 포장시험에서 시험구의 배치는 Fig1.
- 85% (w/v) NaCl 멸균수에 현탁 시킨 다음 선택배지를 사용하여 미생물제재의 처리량 채취 시기별 및 균 종류별로 희석법과 한천배지 평판 도말법으로 토양내의 미생물의 종류별 계수를 실시하였다[12]. 실험에 사용한 선택배지의 종류로는 일반 세균을 선별하는 Tryptic Soy Agar (TSA), 방선균을 선별하는 Actinomycetes Isolation Agar (AIA), 곰팡이의 선별에 사용하는 Potato De×trose Agar (PDA) 에 50 ㎍/1의 Chloramphenicol을 함께 사용하였으며, 트리코데마를 선별하는데는 Malt E×tract Agar (MEA)에 항생제로 Chlorotetracyclin을 20 μg/l 첨가한 배지를 사용하였다. 선별 배지에 도말한 미생물은 30℃에 48 시간 배양하여 형성된 콜로니수를 측정하였다.
이론/모형
- 채취한 토양 시료는 멸균수로 희석한 후 Nutrient agar 배지를 사용하여 평판 도말법으로 미생물을 분리하였다. 분리한 균주는 API 50CH/B kit (BioMerieu×, France)를 사용하여 일차 동정하였으며 16s rRNA의 염기서열을 분석하여 확인하였다.
성능/효과
- 균 종 별 구성은 배추 재배토양과 유사하게 세균과 방선균이 주종을 이루었으며, 곰팡이와 트리코데마의 비율은 매우 낮았다. 미생물제재를 기준량과 배량 처리한 토마토 재배토양에서 3차 채취한 토양 중에 존재하는 방선균의 수는 미생물제재를 처리하지 않은 토양에 비하여 각각 21.
- 균 종별 구성으로는 세균과 방선균이 주종을 이루었고, 곰팡이와 트리코데마의 비율은 매우 낮았다. 이는 자연 환경에 존재하는 미생물의 일반적인 구성과 미생물 개체수의 변화를 보여 주는 것이다.
- 확인되었다. 따라서 유기질이 풍부한 토양에서 분리하여 미생물제재의 제조에 사용한 균의명칭을 Bacillus coagulans DL-1 으로 명명하였다.
- 0배가 증가하였다. 미생물 제재를 기준량과 배량 처리한 배추 재배지 토양에서 3차 채취한 토양 중에 존재하는 트리코데마의 수는 미생물 제재를 처리하지 않은 토양에 비하여 각각 11.7배 및 62.1 배가 증가하였다.
- 5배 정도가 증가하였다. 미생물제재를 기준량 및 배량 처리한 토마토 재배토양에서 3차 채취한 토양 중에 존재하는 곰팡이의 수는 미생물제재를 처리하지 않은 토양에 비하여 각각 19.4배 및 10.2배가 증가하였다. 미생물제재를 기준량과 배량 처리한 토마토 재배토양에서 3차 채취한 토양 중에 존재하는 트리코데마의 수는 미생물제재를 처리하지 않은 토양에 비하여 각각 20.
- 3배가 증가하였다. 미생물제재를 기준량과 배량 처리한 배추 재배지 토양에서 3차 채취한 토양 중에 존재하는 곰팡이의 수는 미생물제재를 처리하지 않은 토양에 비하여 각각 37.5배 및 50.0배가 증가하였다. 미생물 제재를 기준량과 배량 처리한 배추 재배지 토양에서 3차 채취한 토양 중에 존재하는 트리코데마의 수는 미생물 제재를 처리하지 않은 토양에 비하여 각각 11.
- 이는 자연 환경에 존재하는 미생물의 일반적인 구성과 미생물 개체수의 변화를 보여 주는 것이다. 미생물제재를 기준량과 배량 처리한 배추 재배토양에서 3차 채취한 토양 중에 존재하는 방선균의 수는 미생물제재를 처리하지 않은 토양에 비하여 각각 5.7배 및 9.3배가 증가하였다. 미생물제재를 기준량과 배량 처리한 배추 재배지 토양에서 3차 채취한 토양 중에 존재하는 곰팡이의 수는 미생물제재를 처리하지 않은 토양에 비하여 각각 37.
- 낮았다. 미생물제재를 기준량과 배량 처리한 토마토 재배토양에서 3차 채취한 토양 중에 존재하는 방선균의 수는 미생물제재를 처리하지 않은 토양에 비하여 각각 21.3배 및 15.5배 정도가 증가하였다. 미생물제재를 기준량 및 배량 처리한 토마토 재배토양에서 3차 채취한 토양 중에 존재하는 곰팡이의 수는 미생물제재를 처리하지 않은 토양에 비하여 각각 19.
- 2배가 증가하였다. 미생물제재를 기준량과 배량 처리한 토마토 재배토양에서 3차 채취한 토양 중에 존재하는 트리코데마의 수는 미생물제재를 처리하지 않은 토양에 비하여 각각 20.2배 및 11.9배로 증가하였다.
- 3에 나타냈다. 미생물제재를 처리하지 않은 배추 재배지 토양의 총균수는 179.9 × 106 CFU/g 이었으나 시간의 경과에 따라 계속 감소하여 2 차 채취시기에 약 21.5 × 106 CFU/g 이었으며, 이 후, 약간 증가하여 3차 채취시기의 총균수는 52.2 × 106 CFU/g이었다. 제재의 기준량 및 배량 처리한 배추 재배토양의 총균수는 3차 채취시기에 각각 227.
- 있었다. 미생물제재를 처리한 토양에서 상대적으로 밀도가 증가된 곰팡이는 유해한 곰팡이보다는 유익한 곰팡이임을 배추와 토마토 재배 실험의 결과로 확인되었다. 토양 중에 존재하는 미생물들의 기능은 다양하나 일반적으로 Bacillus 속에 속하는 미생물은 식물체의 잔사 등에 포함되어 있는 유기물을 분해하는 능력이 우수한 미생물로서 토양내에 서식하는 대표적인 유효 미생물로 알려져 있다.
- 미생물제재를 처리한 토양에서는 처리하지 않은 토양에 비해 곰팡이와 트리코데마의 상대적인 밀도가 증가함을 알 수 있었다. 미생물제재를 처리한 토양에서 상대적으로 밀도가 증가된 곰팡이는 유해한 곰팡이보다는 유익한 곰팡이임을 배추와 토마토 재배 실험의 결과로 확인되었다.
- 미생물제재의 처리가 배추의 생육에 미치는 영향은 Fig. 6에서 보는 바와 같이 기준량을 처리하였을 경우에는 배추의 생체중량, 엽 장, 엽 수는 무 처리구에 비해서 21.5%, 10.6%, 10.0% 정도 증가하였다. 전체적인 조사항목으로 볼 때는, 기준량 처리가 배량 처리 보다 더 우수한 결과를 나타내고 있어 배추의 경우 기준량 처리가 바람직한 것으로 확인되었다.
- 미생물제재의 처리가 토마토의 생육에 미치는 영향은 Fig. 7에서 보는 바와 같이 기준량을 처리하였을 경우에는 토마토 열매의 생체중량, 근장으로 뿌리를 곧게 편 후 최장길이 및 열매의 직경은 무 처리구에 배해 30.4%, 10.6%, 10.0% 정도 증가하였다. 미생물제재의 처리가 배추의 생육에 미치는 영향과 유사하게 기준량 처리가 배량 처리 보다 우수한 결과를 나타내고 있으므로 토마토의 경우도 배추 재배와 마찬가지로 기준량 처리가 바람직하였다.
- 일정한 시간이 경과된 후, 미생물제재를 처리한 토양 의미생물 수는 처리하지 않은 배추 재배토양에 비하여 세균뿐만 아니라 방선균, 곰팡이 및 트리코데마도 일정한 비율로 증가하였다. 이는 미생물제재의 구성 균 종이 배추 재배토양에 안정적으로 정착하여 생존하는 것으로 판단되어지며, 배추 재배토양 미생물 상을 구성하는 여러 종류의 미생물에 대하여 유익하고, 지속적인 효과를 나타내고 있는 것으로 판단되어진다.
- 일정한 시간이 경과한 후, 미생물제재를 처리한 토마토 재배토양은 처리하지 않은 토마토 재배토양에 비하여 세균뿐만 아니라 방선균, 곰팡이 및 트리코데마 역시 일정한 비율로 증가된 결과를 확인하였으나 세균을 제외한 나머지 종류의 미생물의 경우, 배추 재배토양에서와 같이 처리한 미생물제재의 양에 비례하여 증가하지는 않았다.
- 0% 정도 증가하였다. 전체적인 조사항목으로 볼 때는, 기준량 처리가 배량 처리 보다 더 우수한 결과를 나타내고 있어 배추의 경우 기준량 처리가 바람직한 것으로 확인되었다.
- 제조에 사용한 균주를 동정하였다. 토양에서 분리하여 미생물제재의 제조에 사용한 균주의 다양한 탄소원의 이용도는 Table 1과 같으며 이 결과를 바탕으로 계산된 균주의 명칭은 Bacillus coagulansSe 확률이 98%이었다. 16srRNA의 염기서열 분석을 통하여 동정한 결과 균주의 명칭은 Bacillus coagulansS.
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