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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 AFLP-PCR 기법을 이용하여 재래흑염소 품종에 특이적인 DNA band를 개발하고 재래흑염소 육 감별에 이용하기 위한 목적으로 다양한 selective primer 조합형과 각종 제한효소를 이용하여 재래흑염소와 수입 흑염소 그리고 유용 종 염소 4품종 간의 AFLP band 양상을 비교분석하였다. Fig.
- , 1996).본 연구는 축산물 수입 개방 시대에 외래종 염소 및 염소 육 수입에 대응한 한국재래흑염소 생산농가 및 소비자를 보호하고 수입 염소 육의 불법 유통 판매 근절 및 부정육 검출을 위한 방안으로서 새로운 유전자지문분석방법인 AFLP-PCR 기법을 이용하여 재래흑염소의 생산, 가공 및 유통과정에서 신용과 품질을 보증할 수 있는 즉, 재래흑염소의 유전적 순수성을 검증하고 수입염소육과 차별화할 수 있는 순수 재래산 양육 판별기술을 개발하고 자 수행하였다.
제안 방법
- 1차 PCR 증폭 반응은 GeneAmp PCR System (Perkin-Elmer Cetus, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에서 실시하였다. 즉, 반응액은 0.
- PCR 반응은 최초 9 4 ℃에서 3분간 pre-denaturation< 실시한 다음 denaturation 9 4℃에서 1분, annealing 56℃에서 1분 extension 72℃에서 1 분간의 cycle을 총 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 5분간 extension 시킨 다음 TE buffer로 10배 희석하여 다음 과정을 수행하였다. 2차 PCR 증폭 반응은 1차 증폭산물 희석액 2 “L 에 two selective primer 각 10—30 ng를 첨가하여 1차 PCR 반응과 동일하게 조정하였다. 반응 조건은 touchdown PCR 법을 이용하여 94℃에서 30초, 65℃ ~56℃(회당 0.
- 4. Comparison of AFLP fingerprint patterns using a primer combination E35/H13 in Korean native goat(KNG), Imported black goat(IBG), Sannen(SAA), Alpine(ALP), Nu-bian(NUB) and Toggenburg(TOG). M : Molecular size marker.
- 6. Comparison of AFLP fingerprint patterns using a primer combination E35/H14 in Korean native goat(KNG), Imported black goat(IBG), Saanen(SAA), AIpine(ALP), Nu-bian(NUB) and Toggenburg(TOG). M : Molecular size marker.
- 3. Comparison of AFLP fingerprint patterns using a primer combination M11/T32 in Korean native goat(KNG), Imported black goat(IBG), Sannen(SAA), Alpine(ALP), Nu-bian(NUB) and Toggenburg(TOG). M : Molecular size marker.
- 2. Comparison of AFLP fingerprint patterns using a primer combination M12/H12 in Korean native goat(KNG), Imported black goat(IBG), Sannen(SAA), Alpine(ALP), Nu-bian(NUB) and Toggenbuie(TOG). M : Molecular size marker.
- 5. Comparison of AFLP fingerprint patterns using a primer combination M13/H13 in Korean native goat(KNG), Imported black goat(IBG), Saanen(SAA), Alpine(ALP), Nu-bian(NUB) and Toggenburg(TOG). M : Molecular size marker.
- Genomic DNA 을 EcoR I, Taq I, Hind Ⅲ 및 Mse I(BRL, Germany) 4가지 제한효소를 각각 2종류씩 조합하고 각 제 한효소를 5 unit를 첨가하여 최종 부피가 25 uL가 되 도록 조정한 후 37℃와 65℃에서 4시간 동안 반응시켜 이중 절단한 다음 2.5 volume의 ethanol을 첨가하여 -70℃에서 1 시간 동안 침 전시키고 14, 000 rpm에서 30분 동안 원심분리 하여 절단된 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA는 5-7 pmol의 double strand adapter와 1 mM ATP 및 1 unit T4 DNA ligase을 첨가하여 최종 부피가 50 uL가 되도록 조정한 후 37℃에서 3시간 ligation 시켰다.
- 7℃씩 감소)에서 30초, 72℃에서 60초간 12회 실시 후 annealing 온도를 56℃ 에서 30초로 고정하여 총 24회를 반복 수행하였다. PCR 증폭산물은 6%의 denaturing polyacrylamide gel(29:l) 전기 영동 법으로 1, 800~2,000 volt에서 약 1.5 ~2시간동안 전기영동하여 DNA 단편을 분리한 다음 silver staining kit(Bioneer Co.)로염색하여 DNA band를 검출하였다. 본 연구의 AFLP 분석에 사용한 제한효소와 adapter 및 selective primer의 sequence는 1 able 1에 나타냈고 이상과 같이 본 실험에서 이용한 AFLP 분석 방법을 도해하여 Fig.
- 1. Schematic representation of the four basic steps of AFLP te아mique : digestion, ligation, amplification and gel analysis. Gemormic DNA was digested by restriction enzy mes and adapters were ligated to the restriction fragments.
- 2차 PCR 증폭 반응은 1차 증폭산물 희석액 2 “L 에 two selective primer 각 10—30 ng를 첨가하여 1차 PCR 반응과 동일하게 조정하였다. 반응 조건은 touchdown PCR 법을 이용하여 94℃에서 30초, 65℃ ~56℃(회당 0.7℃씩 감소)에서 30초, 72℃에서 60초간 12회 실시 후 annealing 온도를 56℃ 에서 30초로 고정하여 총 24회를 반복 수행하였다. PCR 증폭산물은 6%의 denaturing polyacrylamide gel(29:l) 전기 영동 법으로 1, 800~2,000 volt에서 약 1.
- 본 연구에 사용된 공시 재료로서 재래종 흑염소 30두와 수입국이 명확하지 않으나 호주산으로 추정되는 육용종 수입 흑염소 15두는 각 사육농가 및 흑염소가공장의 협조를 얻어 도축시 도체로부터 각각 약 10 g의 정육 시료를 채취하여 냉 장보관 상태로 운반한 후 DNA를 분리하여 냉동 보관하였다. 유용종 염소(Saanen, Alpine, Nubian 및 Toggenburg) 4개 품종은 강원도 홍천의 염소 목장에서 각각 10두씩으로부터 혈액 시료를 채취하여 genomic DNA 분리를 위한 시료로 이용하였다.
- 본 연구에서는 4bp와 6bp의 인지 부위를 갖는 Mse 1과 Taq 그리고 EcoR I과 Hind Ⅲ 4 종류의 제한효소를 사용하여 이 굴 제한효소와 primer 조합형에 따른 AFLP 유전자 지문의 출현 양상을 비교 분석하였다. Fig.
- )로염색하여 DNA band를 검출하였다. 본 연구의 AFLP 분석에 사용한 제한효소와 adapter 및 selective primer의 sequence는 1 able 1에 나타냈고 이상과 같이 본 실험에서 이용한 AFLP 분석 방법을 도해하여 Fig. 1에 제시하였다.
- 즉, 반응액은 0.5 mL tube에 희석액 5 uL, 제한효소별 one selective primer 각 75 ng, dNTP 각 200 um, 10x PCR buffer 그리고 Taq DNA polymerase limit를 첨가하여 PCR 반응액을 총 20 uL로 조정하였다. PCR 반응은 최초 9 4 ℃에서 3분간 pre-denaturation< 실시한 다음 denaturation 9 4℃에서 1분, annealing 56℃에서 1분 extension 72℃에서 1 분간의 cycle을 총 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 5분간 extension 시킨 다음 TE buffer로 10배 희석하여 다음 과정을 수행하였다.
대상 데이터
- 장보관 상태로 운반한 후 DNA를 분리하여 냉동 보관하였다. 유용종 염소(Saanen, Alpine, Nubian 및 Toggenburg) 4개 품종은 강원도 홍천의 염소 목장에서 각각 10두씩으로부터 혈액 시료를 채취하여 genomic DNA 분리를 위한 시료로 이용하였다.
이론/모형
- 혈액 약 5 mL로부터 genomic DNA의 추출 및 정제는 정 등 (2000)의 방법에 따라 추출하여 분리한 DNA 는 TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA)에 용해하였고 DNA 농도는 260 nm의 spectrophotometer로 UV 흡착에 의해 측정하였다.
성능/효과
- 2는 우리나라 재래흑염 M 육용종 수입 흑염소 및 4품종의 유용종 염소(Saanen,Xlpine, Nubian 및 Toggenburg)로부터 추출한 genomic DNA 를 Hind Ⅲ와 Mse I 제한효소로 절단한 다음 M12/H12의 elective primer 조합형으로 증폭한 후 전기영동하여 검출한 3NA 지문 양상을 보여주고 있다. 그리고 Fig. 3과 Fig. 4는 Mse I고)" Taq 1 그리고 EcoR I과 Hind Ⅲ 제한효소를 각 각기 용하여 절단한 다음 M11/T32와 E35/H13 primer 조합형으로 증폭한 DNA band 양상으로 서 약 0.2~ 1.0 kb 범위에서 품종 간 그리고 개체 간에 서로 상이한 DNA band pattern 즉, 개체 특이성을 보여주는 AFLP 유전자지문 양상이 검출되었다. 본 실험의 전기영동상에서 보는 바와 같이 제한효소와 primer 조합형에 따라 특이적인 DNA 지문 양상을 나타냈으겨 M12/H12(Fig.
- 3) primer 조합형은 품종 내 그리고 품종 간에 다양한 개체변이를 보여주고 있으나 IE35/H13(Fig. 4) primer 조합형의 경우는 품종 내 또는 품종 간에 공통적으로 존재하는 DNA band가 확인되었다. 즉, Fig.
- Fig. 5에서 보는 바와 같이 M13/H13 primer 조합형에서 각염소 품종간의 차이를 명확히 구별할 수 있는 품종 특이적인 AFLP band가 다수 검출되었다. 즉, 재래흑염소에서 공통적으로 출현하는 약 1.
- 3개(22~39개)의다형적 band 수보다는 상대적으로 낮은 경향이었다. 그리고 재래산양의 AFLP 다형성 비율은 E35-T38 조합형에서 42.0 %로 가장 높은 수준을 보인 반면 T38/M13 primer 조합형은 16.0%로 가장 낮은 수준의 AFLP 다형 성을 보였으며 재 래산양의 평균 다형율은 26.8%로서 수입 흑염소와 기타 유용종의 20.2%~25.3% 보다 다소 높은 변이성을 보였다. 한편, 본 연구의 이러한 결과는 Ajmone-Marsan 등 {1997)이 Holstein종에서 보고한 다 형성 수준 22.
- 08 kb 크기의 band가 각각 해당 품종의 특이적 DNA band로 검출되었다. 따라서 10종류의 primer 조합형 가운데 M13/H13 primer 조합형에서 가장 많은 품종 특이적 DNA band가 검출되어 재래흑염 소육 감별에 가장 이상적인 조합형으로 확인되었다. 또한, E35/H14 primer 조합형에서도 각 품종 간에 특이적으로 발현하는 band들을 확인할 수 있었는데 재래흑염소에서는 1.
- iFLP 분석을 통해 검출되는 DNA band는 genome 내 산재되어 있는 유전자 돌연변이에 따라 품종 또는 개체간의 유전 m 보에 매우 귀중한 자료를 제공해줄 수 있고 특히, 높은 수 드의 DNA 다 형성은 DNA marker로서 이용 가능성이 증가 하게 된다. 따라서, AFLP 유전자지문분석 기법은 기존의 <APD와 RFLP 방법에 비해 검출 가능한 polymorphic DNA , and의 수가 현저히 많아 고도의 DNA 다 형성과 변이성을 , 확인할 수 있어 동물종이나 동종 내 품종 판별 및 육과 육제 품의 품종식별에 유용한 DNA marker로서 활용가치가 높다고 할 수 있다.
- 따라서 10종류의 primer 조합형 가운데 M13/H13 primer 조합형에서 가장 많은 품종 특이적 DNA band가 검출되어 재래흑염 소육 감별에 가장 이상적인 조합형으로 확인되었다. 또한, E35/H14 primer 조합형에서도 각 품종 간에 특이적으로 발현하는 band들을 확인할 수 있었는데 재래흑염소에서는 1.65 kb band가 조사한 모든 개체에서 검출되어 품종 특이적 DNA marker로 확인되었고 수입 흑염소에서는 1.38 kb band가 조사한 개체에서 모두 존재하여 수입 흑염소 품종에 특이적인 marker로 추정되며 Saanen종에서는 1.33 kb 그리고 Toggenburg종에서는 2.04 kb band가 각 품종에 특이적인marker로 확인할 수 있었다. 최근 Ajmone-Marsan 등(1999)은 염소에서 AFLP의 재현율이 95% 이상이라고 보고하고 있어 이들 각 품종 특이적인 DNA band들은 재래흑염소와 수입 흑염소 그리고 유용 종 염소들 간의 품종구별은 물론 도축 후 정육 형태로 유통 판매되는 염소 육과 육제품의 품종식별을 위한 진단기술로 이용 가능한 유전적 표지 인자(genetic marker)로 확인되었다.
- 8개보다 다소 많은 수의 band들이 검출되었다. 또한, 다형적 band 의 수는 primer 조합형에 따라 9 ~24개로 다양하였으며 평 균다형적 band의 수는 14.9개였고 이 같은 결과는 Ajmone-Marsan 등(2001)이 7종류의 primer 조합형을 이용하여 Italian 7개 염소 품종에서 보고한 평균 31.3 ±7.3개(22~39개)의다형적 band 수보다는 상대적으로 낮은 경향이었다. 그리고 재래산양의 AFLP 다형성 비율은 E35-T38 조합형에서 42.
- 78 kb band의 경우 재래흑염소에서는 조사한 모든 개체에서 검출되었으나 Saanen종에서는 전혀 그 출현이 인정되지 않았다. 반대로 약 0.8 kb band는 Saanen종 개체에서는 모두 검출되었고 Alpine종에서는 1개체만이 확인되었으나 재래흑염소와 그 외 타 품종에서는 전혀 출현되지 않았다. 따라서 재래흑염소와 개량종 Saanen 염소 품종 간에 뚜렷하게 차이를 보이는 DNA band를 이용하여 두 품종 간의 육감별 이 재래흑염소육을 특히, 개량종 Saanen 염소육과 구별이 가능할 것으로 기대된다.
- 우리나라 재래흑염소의 AFLP band 출현율은 약 0.2 kb~1.0 kb 범위에서 검출된 DNA band를 기준으로 10종류의 primer 조합형 가운데 H12/M12, T32/M11 및 T38/M13 primer 조합형에서 각각 평균적으로 74개,67개 및 62개 순으로 많은 AFLP band가 검출된 반면 E35/H13과 E32/H11 primer 조합형의 AFLP band수는 각각 평균 36개와 42개로 가장 낮은 수준을 나타냈다. 재래흑염소에서 총 555개의 AFLP band를 검출할 수 있었으며 이 가운데 149개의 band가 polymorphic 한 band로 확인되었고 각 primer 조합 당 평균 AFLP band의 수는 55.
- 그동안 각종 원료육과 육제품 등 축육자원의 축종 판별을 위한 기술로서 면역 효소측정법과 등 전점 전기영동법 등이 비교적 정확도가 높은 방법으로 사용되어져 왔다. 이들 면역학적 및 전기영동 방법은 축종간에 단백질 조성 및 구조적 차이에 따른 종특이적 단백질(species-specific protein)을 검출함으로써 축종식별이 가능하였다. 그러나, 종특이적 단백질은 종내에서는 동일하기 때문에 동종 내 품종 간의 판별에 이용은 사실상 불가능하다고 할 수 있다.
- marker를 이용 가능성을 제시하고 있다. 이상의 결과를 종합해볼 때 DNA band의 고도의 다량성, 재현성 및 다형성의 유전적 특성을 갖는 AFLP-PCR 유전자 분석기법은 정확하면서도 간편하고 신속한 재래흑염 소 품종 및 흑염소 육의 육류 감별을 위한 매우 유용한 DNA 진단기술이라고 할 수 있다.
- 0 kb 범위에서 검출된 DNA band를 기준으로 10종류의 primer 조합형 가운데 H12/M12, T32/M11 및 T38/M13 primer 조합형에서 각각 평균적으로 74개,67개 및 62개 순으로 많은 AFLP band가 검출된 반면 E35/H13과 E32/H11 primer 조합형의 AFLP band수는 각각 평균 36개와 42개로 가장 낮은 수준을 나타냈다. 재래흑염소에서 총 555개의 AFLP band를 검출할 수 있었으며 이 가운데 149개의 band가 polymorphic 한 band로 확인되었고 각 primer 조합 당 평균 AFLP band의 수는 55.5개로 수입 흑염소와 기타 유용종의 52.4~53.8개보다 다소 많은 수의 band들이 검출되었다. 또한, 다형적 band 의 수는 primer 조합형에 따라 9 ~24개로 다양하였으며 평 균다형적 band의 수는 14.
- 4) primer 조합형의 경우는 품종 내 또는 품종 간에 공통적으로 존재하는 DNA band가 확인되었다. 즉, Fig.4에서 보는 바와 같이 약 1.0 kb와 0.65 kb는 재래흑염소, 수입 흑염소 및 Alpine종에 공통적으로 존재하는 반면 Saanen종에서는 그 출현이 인정되지 않았고 Nubian과 Toggenburg종은 일부 개체에서만 band가 나타났다. 또한, 0.
- 5에서 보는 바와 같이 M13/H13 primer 조합형에서 각염소 품종간의 차이를 명확히 구별할 수 있는 품종 특이적인 AFLP band가 다수 검출되었다. 즉, 재래흑염소에서 공통적으로 출현하는 약 1.26과 2.01 kb 크기의 두 band는 조사한 30두 모두에서 공통적으로 검출되었으나 타 품종의 공시축에서는 전혀 검출되지 않아 재래흑염소에 특이적인 AFLP marker로 확인되었다. 한편, 수입흑염소에서는 0.
- 01 kb 크기의 두 band는 조사한 30두 모두에서 공통적으로 검출되었으나 타 품종의 공시축에서는 전혀 검출되지 않아 재래흑염소에 특이적인 AFLP marker로 확인되었다. 한편, 수입흑염소에서는 0.87, 0.96, 2.03 및 2.19 kb 크기의 4개 band가 분석한 15두에서 공통적으로 확인되어 품종 특이적 band로 확인되었고 Saanen종에서는 2.13 kb 크기의 band 그리고 Nubian 종에서는 2.08 kb 크기의 band가 각각 해당 품종의 특이적 DNA band로 검출되었다. 따라서 10종류의 primer 조합형 가운데 M13/H13 primer 조합형에서 가장 많은 품종 특이적 DNA band가 검출되어 재래흑염 소육 감별에 가장 이상적인 조합형으로 확인되었다.
- 따라서 재래흑염소와 개량종 Saanen 염소 품종 간에 뚜렷하게 차이를 보이는 DNA band를 이용하여 두 품종 간의 육감별 이 재래흑염소육을 특히, 개량종 Saanen 염소육과 구별이 가능할 것으로 기대된다. 한편, 재래흑염소육은 비교 대상 5개 품종 가운데 수입 흑염소 육과 공통적인 DNA band가 가장 많은 것으로 나타났으며 DNA 지문 양상도 유사성이 매우 높아 우리나라 재래종 흑염소가 유용 종 염소보다는 육용의 수입흑염소와 유전적 근연관계가 더 가까운 것으로 추정되었다.
후속연구
- 최근 Ajmone-Marsan 등(1999)은 염소에서 AFLP의 재현율이 95% 이상이라고 보고하고 있어 이들 각 품종 특이적인 DNA band들은 재래흑염소와 수입 흑염소 그리고 유용 종 염소들 간의 품종구별은 물론 도축 후 정육 형태로 유통 판매되는 염소 육과 육제품의 품종식별을 위한 진단기술로 이용 가능한 유전적 표지 인자(genetic marker)로 확인되었다. 그러나, 본 연구는 소수의 한정된 시료를 대상으로 한 결과이기 때문에 보다 더 정확한 결론을 얻기 위해서는 조사 두수를 더욱 확대하여 다수의 시료를 대상으로 검증해 볼 필요가 있다고 판단된다.
- 8 kb band는 Saanen종 개체에서는 모두 검출되었고 Alpine종에서는 1개체만이 확인되었으나 재래흑염소와 그 외 타 품종에서는 전혀 출현되지 않았다. 따라서 재래흑염소와 개량종 Saanen 염소 품종 간에 뚜렷하게 차이를 보이는 DNA band를 이용하여 두 품종 간의 육감별 이 재래흑염소육을 특히, 개량종 Saanen 염소육과 구별이 가능할 것으로 기대된다. 한편, 재래흑염소육은 비교 대상 5개 품종 가운데 수입 흑염소 육과 공통적인 DNA band가 가장 많은 것으로 나타났으며 DNA 지문 양상도 유사성이 매우 높아 우리나라 재래종 흑염소가 유용 종 염소보다는 육용의 수입흑염소와 유전적 근연관계가 더 가까운 것으로 추정되었다.
- 3% 보다 다소 높은 변이성을 보였다. 한편, 본 연구의 이러한 결과는 Ajmone-Marsan 등 {1997)이 Holstein종에서 보고한 다 형성 수준 22.0%와 매우 유사한 결과를 보여 이들 제한효소와 primer 조합형은 가축 품종의 AFLP 다형 분석에 배우 유용할 것으로 기대된다. 한편, Ovilo 등(2000)이 Iberian pig 품종 14두를 대상으로 EcoR I/Mse I 제 한효소로긴단한 후 12개의 primer 조합형을 이용하여 총 1, 733개의 / FLP band를 검출하고 이 가운데 다 형적 band가 106개 (, :rimer조합 당 평균 8.
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