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문제 정의
- 본 연구에서는 단백질분해효소의 산업적 이용을 위하여 kiwifruit 과육 속에 들어있는 gelatin분해활성을 조사하였다. Kiwifruit 과육에는 3개의 단백질 분해효소의 활성밴드 (PI, PH, PHI)가 관찰되었다.
- 국내의 연구보고로는 kiwifruit 단백질 분해효소의 정제 및 특성규명[8], casein의 식품학적 기능성 향상μ3]과 육류의 연화에 미치는 효과[7] 등에 관한 연구가 있으며, 최근에 배, 무화과, 파인애플, 파파야 등의 단백질 분해효소와 비교한 연구에서 kiwifruit의 단백질 분해효소 활성이 파인애플 다음으로 높은 것으로 밝혀졌다 [1]. 본연구에서는 kiwifruit 과육 속에 들어있는 단백질 분해효소의 산업적 활용을 모색하고자 그gelatin분해활성을 조사한 바, 몇 가지 특이한 결과를 얻었으므로 이에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 0)에서 37C에서 100분 동안 반응시켜 gelatin의 분해 정도를 조사하였다. 2가양이온으로는 Mg2+, Ca2+, Mn2+Z Co2+Z Cu2+, Zn2+, Hg2+등을, 3가양이온으로는 Al3+, Fe3+ 등을 사용하였고, 대조구는 양이 온 대신에 증류수를 넣어 조사하였다.
- Kiwifruit 과육의 단백질 분해효소의 유형을 알아보기 위하여 단백질 분해효소 저해제를 사용하여 그 효과를 조사하였다 (Fig. 3).그 결과, 단백질 분해효소 P I, PH, Pm 모두 cysteine proteinase 저해제인 E-64와 iodoacetate에 의해서 저해되었으며, aspartic proteinase 저해제인 pepstatin A에 서도 크게 저해되었다.
- M trans-epoxysuccinyl-L- leucylamido (4-guanidino) butane (E~64)과 10 mM iodoacetate 등을 사용하였다. 그리고, cysteine proteinase의 촉진제로서 1 mM DTT와 cysteine, 5 mM β-mercaptoethanol 의 영향도 조사하였다.
- 단백질 분해효소 활성을 정량화하기 위해서는 염색이 끝난 겔을 densitometer 로scanning하여 분석하였다. 그리고, 단백질 분해효소의 casein분해 활성을 알아보기 위해서 gelatin을 같은 농도의 casein으로 대치하여 조사하였다.
- 단백질 분해효소의 열 안정 성은 조효소액을 15~60℃까지 다양한 온도에서 1시간 동안 정치한 후 전기영동하여 gelatin분해정도를 비교하였다. 그리고, 열 안정성이 높은 단백질 분해효소를 대상으로 다양한 온도에서 48시간 동안 정치하여 같은 방법으로 안정성을 조사하였다. 대조구는 4C에서 보관 중인 조효소액을 사용하였다.
- 금속이온의 영향은 전기영동이 끝난 겔을 10mM의 양이온을 함유하는 50 mM sodium citrate 완충용액(pH4.0)에서 37C에서 100분 동안 반응시켜 gelatin의 분해 정도를 조사하였다. 2가양이온으로는 Mg2+, Ca2+, Mn2+Z Co2+Z Cu2+, Zn2+, Hg2+등을, 3가양이온으로는 Al3+, Fe3+ 등을 사용하였고, 대조구는 양이 온 대신에 증류수를 넣어 조사하였다.
- 단백질 분해효소 pi, PH, Pm 중 열에 비교적 안정한 것으로 나타난 PDI을 장시간 동안 고온에 노출시킨 후 활 성변화를 조사하였다. 그 결과, Fig.
- 025% Coomassie brilliant blue R-250용액으로 염색하여 gelatin 의 분해 여부와 그 양상을 관찰하였다. 단백질 분해효소 활성을 정량화하기 위해서는 염색이 끝난 겔을 densitometer 로scanning하여 분석하였다. 그리고, 단백질 분해효소의 casein분해 활성을 알아보기 위해서 gelatin을 같은 농도의 casein으로 대치하여 조사하였다.
- 단백질 분해효소의 열 안정 성은 조효소액을 15~60℃까지 다양한 온도에서 1시간 동안 정치한 후 전기영동하여 gelatin분해정도를 비교하였다. 그리고, 열 안정성이 높은 단백질 분해효소를 대상으로 다양한 온도에서 48시간 동안 정치하여 같은 방법으로 안정성을 조사하였다.
- 단백질 분해효소의 최적 pH는 전기영동이 끝난 겔을 pH1.0~ 10.0의 완충용액 (10 mM CaCl2 포함)에서 37℃에서 100분 동안 반응시켜 gelatin의 분해 정도를 조사하였다. 완충용액은 50 mM의 용액을 사용하였으며 pH에 따라 potassium chloride-HCl (pH 1.
- 5).대조구는 Ca2+을 제거한 조건으로 하였으며 이를 금속이온이 첨가된 조건과 비교하였다. 그 결과, C* a을 처리하였을 때는 단백질 분해효소 PI, PH, Pffl 모두 대조구보다 활성이 높았다.
- 0; 10 mM CaCh)에서 100분 동안 37E에서 정치하여 반응시켰다. 반응시킨 겔은 0.025% Coomassie brilliant blue R-250용액으로 염색하여 gelatin 의 분해 여부와 그 양상을 관찰하였다. 단백질 분해효소 활성을 정량화하기 위해서는 염색이 끝난 겔을 densitometer 로scanning하여 분석하였다.
- 여러 가지 금속이온이 첨가된 조건에서 금속이온이 단백질분해효소 PI, PH, PHI의 gelatin분해활성에 미치는 영향을 조사하였다 (Fig. 5).대조구는 Ca2+을 제거한 조건으로 하였으며 이를 금속이온이 첨가된 조건과 비교하였다.
- 0의 완충용액 (10 mM CaCl2 포함)에서 37℃에서 100분 동안 반응시켜 gelatin의 분해 정도를 조사하였다. 완충용액은 50 mM의 용액을 사용하였으며 pH에 따라 potassium chloride-HCl (pH 1.0), glycine-HCl (pH 2.0), sodium citrate (pH 3.0 ~4.0), sodium acetate (pH 5.0 ~6.0), Tris-HCl (pH 7.0 ~ 9.0)과 sodium carbonate (pH10.0)를 사용하였다.
- 저해제의 영향은 전기영동이 끝난 겔을 저해제가 포함된 50 mM sodium citrate 완충용액 (pH 4.0; 10 mM CaCL)에서 37℃에서 100분 동안 반응시켜 gelatin의 분해 정도를 조사하였다. 단백질 분해효소 저해제로는 metalloproteinase 저해제로 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)와 0.
- 전기영동분석은 Heussen과 Dowdle[6]의 방법을 변형한 Oh 등[1이의 방법으로 gelatin의 분해 여부를 통하여 분석하였다. 즉, 조효소액을 시료용 완충용액(0.125 M Tris- HC1, pH 6.8; 0.005% bromophenol blue, 40% glycerol, 5% -mercaptoethanol)과 동량 혼합하여 0.1% gelatin을 함유하는 12.5% SDS-polyacrylamide gel 위에 넣어 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후, 겔은 1% Triton X-100을 함유하는 25 mM sodium citrate 완충용액 (pH 4.
대상 데이터
- 1 mM 3, 4-dichloroisocumarin (DCI)을, aspartic proteinase 저해제로 10 mM pepstatin A를, cysteine pro- teinase의 저해제로 20 p. M trans-epoxysuccinyl-L- leucylamido (4-guanidino) butane (E~64)과 10 mM iodoacetate 등을 사용하였다. 그리고, cysteine proteinase의 촉진제로서 1 mM DTT와 cysteine, 5 mM β-mercaptoethanol 의 영향도 조사하였다.
- 그리고, 열 안정성이 높은 단백질 분해효소를 대상으로 다양한 온도에서 48시간 동안 정치하여 같은 방법으로 안정성을 조사하였다. 대조구는 4C에서 보관 중인 조효소액을 사용하였다.
- 본 실험에서는 중국에서 수집한 야생종 kiwifruit (Actinidia의 과실을 제주 농업시험장으로부터 공급받아 사용하였다.
이론/모형
- 전기영동분석은 Heussen과 Dowdle[6]의 방법을 변형한 Oh 등[1이의 방법으로 gelatin의 분해 여부를 통하여 분석하였다. 즉, 조효소액을 시료용 완충용액(0.
성능/효과
- Kiwifruit 과 육에서 추출한 조효소액을 다양한 온도에서 1시간 동안 정치하고 gelatin분해활성을 조사하여 열 안정 성을 조사한 결과(Fig. 6), P I 과 PⅡ는 온도가 증가함에 따라 점차 감소하여 60℃에서는 활성이 극히 낮았다. 그러나, PHI는 PI 이나 PEN] 비해 고온에 비교적 안정한 것으로 조사되었다.
- Kiwifruit 과육에서 추출한 조효소액의 gelatin분해활성 과 casein분해활성을 조사한 결과(Fig. 1), 활성이 높은 2개의 밴드 (PI과 PM)와 활성이 낮은 1개의 밴드(PU)가 관찰되었다. 분자량 지표 단백질의 Rf (relative mobility)값을 이용하여 표준곡선을 작성하고 이들 3개의 단백질분해 효소의 분자량을 산출한 결과, 단백질 분해효소 PI 은 220 kD, PU는 51 kD, PHI는 26 kD에 해당하는 것으로 추정할 수 있었다.
- 하지만, Co2+Z Cu2+, Al3+, Fe3+ 등 금속이온의 영향이 다소 다르게 나타났다. Kiwifruit 과육의 단백질분해효소 P I, PH, Pffl 중에서 P I 과 PⅡ는 온도가 증가함에 따라 활성이 점차 낮아졌으나 Pni는 비교적 안정한 것으로 조사되었다. 특히, pm는 50℃ 이내의 범위에서 48시간 경과시에도 75% 이상의 활성을 보여 이 범위의 온도에서는 상당 시간 동안 안정한 것으로 나타났다.
- 대조구는 Ca2+을 제거한 조건으로 하였으며 이를 금속이온이 첨가된 조건과 비교하였다. 그 결과, C* a을 처리하였을 때는 단백질 분해효소 PI, PH, Pffl 모두 대조구보다 활성이 높았다. 그리고 Mg?+과
- 단백질 분해효소 pi, PH, Pm 중 열에 비교적 안정한 것으로 나타난 PDI을 장시간 동안 고온에 노출시킨 후 활 성변화를 조사하였다. 그 결과, Fig. 7에서 보는 바와 같이 48시간 경과시에도 15~37℃의 범위에서는 90% 이상의 활성을, 그리고 50℃에서는 75% 이상의 활성을 나타내어, 50 ℃ 이하의 온도에서는 상당 시간 동안 안정한 것으로 조사되었다. 그리고 60℃에서는 1시간 동안 처리했을 때 그 활성이 50% 정도 감소하고, 그 이상 시간에서는 급격하게 감소하여 12시간 반응시 완전히 저해되었다.
- 3).그 결과, 단백질 분해효소 P I, PH, Pm 모두 cysteine proteinase 저해제인 E-64와 iodoacetate에 의해서 저해되었으며, aspartic proteinase 저해제인 pepstatin A에 서도 크게 저해되었다. 그리고, serine proteinase 저해제인 PMSF와 DCI에서도 다소 저해되었으나 E-64z iodoacetate, pepstatin A에 비해 저해 정도는 매우 낮았다.
- 이들 단백질분해효소 PI, PH, PH1는 모두 cysteine proteinase 저해제인 E-64와 iodoacetate에 의해서 저해되었으며, cysteine proteinase 를 촉진하는 DTT, cysteine 및 6-mercaptoethanol에 의해서 활성이 증가하였다. 그 중 단백질 분해효소 PDI는 분자량과 효소의 특성으로 보아 actinidin (EC 3.4.22.14)과 동일한 것으로 판단되었다. 단백질 분해효소 PI, PH, PDI는 모두 Ca2+, Mg2+과 Mr2+에 의해 촉진되었으며 Z* n과 Hg2+에 의해 완전히 저해되는 것으로 나타났다.
- 단백질분해효소 PI 과 PH는 온도가 증가함에 따라 점차적으로 감소하는 경향을 보여 이들 단백질분해효소 들은 고온에서 3차원적 구조를 유지하는 결합력의 약화 또는 변성으로 효소 활성도가 낮아진 것으로 해석된다. 그리고 단백질 분해효소 PM는 고온에서도 비교적 안정한 것으로 조사되었는데, 이는 PHI가 비교적 열에 안정한 특성을 나타내거나 또는 Fig. 1에서 살펴본 바와 같이 고분자 단백질분해효소인 pⅠ 이나 PII가 PHI의 cross-linking 산물일 가능성을 생각해 볼 때 이들 단백질분해효소 PI 의 분리된 결과가 아닌 가 사료된다.
- 14)과 동일한 것으로 판단되었다. 단백질 분해효소 PI, PH, PDI는 모두 Ca2+, Mg2+과 Mr2+에 의해 촉진되었으며 Z* n과 Hg2+에 의해 완전히 저해되는 것으로 나타났다. 하지만, Co2+Z Cu2+, Al3+, Fe3+ 등 금속이온의 영향이 다소 다르게 나타났다.
- 단백질 분해효소 PI, PH, PH1 의 gelatin분해활성을 pH 를 달리하여 조사한 결과(Fig. 2), PI, PH, Pffl 모두 pH2.0~5.0 범위에서 높은 활성을 보였으며 pH 4.0에서 가장 높게 나타났다. 그리고, casein분해활성도 같은 결과를 나타내었다 (자료 미제시).
- 1), 활성이 높은 2개의 밴드 (PI과 PM)와 활성이 낮은 1개의 밴드(PU)가 관찰되었다. 분자량 지표 단백질의 Rf (relative mobility)값을 이용하여 표준곡선을 작성하고 이들 3개의 단백질분해 효소의 분자량을 산출한 결과, 단백질 분해효소 PI 은 220 kD, PU는 51 kD, PHI는 26 kD에 해당하는 것으로 추정할 수 있었다.
- 단백질분해효소 PI 은 220 kD, PII는 51 kD, PHI는 26 kD에 해당하는 것으로 추정할 수 있었다. 이들 단백질분해효소 PI, PH, PDI는 모두 pH2.0~5.0 범위에서 높은 활성을 보였으며 pH 4.0에서 가장 높게 나타났다. 이들 단백질분해효소 PI, PH, PH1는 모두 cysteine proteinase 저해제인 E-64와 iodoacetate에 의해서 저해되었으며, cysteine proteinase 를 촉진하는 DTT, cysteine 및 6-mercaptoethanol에 의해서 활성이 증가하였다.
- 0에서 가장 높게 나타났다. 이들 단백질분해효소 PI, PH, PH1는 모두 cysteine proteinase 저해제인 E-64와 iodoacetate에 의해서 저해되었으며, cysteine proteinase 를 촉진하는 DTT, cysteine 및 6-mercaptoethanol에 의해서 활성이 증가하였다. 그 중 단백질 분해효소 PDI는 분자량과 효소의 특성으로 보아 actinidin (EC 3.
- 이상의 Fig. 1~5의 결과로 보아 kiwifruit 과육에서 관찰되는 3개의 밴드들은 모두 cysteine proteinase임을 알 수 있었다. 그 중 단백질 분해효소 PM는 분자량과 효소의 일반적인 특성이 actinidin (EC 3422.
- Kiwifruit 과육의 단백질분해효소 P I, PH, Pffl 중에서 P I 과 PⅡ는 온도가 증가함에 따라 활성이 점차 낮아졌으나 Pni는 비교적 안정한 것으로 조사되었다. 특히, pm는 50℃ 이내의 범위에서 48시간 경과시에도 75% 이상의 활성을 보여 이 범위의 온도에서는 상당 시간 동안 안정한 것으로 나타났다.
- 반면에 Zr2+과 Hg2+을 처리하였을 때에는 모든 단백질 분해효소들의 활성이 완전히 저해되는 것으로 나타났다. 한편, C* o을 처리했을 때에는 PMe 대조구와 유사하였으나 PI 이 거의 저해 되었고,Hg2+을 처리하였을 때에는 PI 에 비해 PHI의 저해 정도가 더 큰 것으로 나타났다. 반면에 3가 양이온인 Al3+ 과 Fe3+을 처리하였을 때에는 단백질 분해효소 PH, PHI는 금속이온을 처리하지 않은 대조구와 거의 유사하게 나타났으나 PI는 대조구보다 활성이 매우 낮게 나타났다.
후속연구
- 하지만, 단백질 분해효소 PI 과 PH가 PM와 어떠한 관련성이 있는지 또는 PD1 와는 전혀 다른 단백질 분해효소인 지를 밝힐 필요가 있다. 그리고, 본 단백질 분해효소의 산업적 이용을 위해서는 kiwifruit 과실의 발달과 저장기간 중에 이들 효소들의 출현 시기와 활성 변화 등 생화학적인 특성과 다래나무 속 식물 전체를 대상으로 한 포괄적인 연구가 필요하다. 더불어 gelatin과 casein 등 천연기질뿐만 아니라 여러 가지 합성기질을 이용한 기질특이성을 조사하여 kiwifruit 단백질 분해효소의 새로운 활용도를 탐색할 필요가 있다.
- 그리고, 본 단백질 분해효소의 산업적 이용을 위해서는 kiwifruit 과실의 발달과 저장기간 중에 이들 효소들의 출현 시기와 활성 변화 등 생화학적인 특성과 다래나무 속 식물 전체를 대상으로 한 포괄적인 연구가 필요하다. 더불어 gelatin과 casein 등 천연기질뿐만 아니라 여러 가지 합성기질을 이용한 기질특이성을 조사하여 kiwifruit 단백질 분해효소의 새로운 활용도를 탐색할 필요가 있다.
- 우리나라에는 1977년 뉴질랜드로부터 도입되어 제주도를 포함한 남해안 지역에서 대량으로 재배되고 있고 생산량도 증가하고 있는 추세이다. 더욱이, kiwifruit 과실은 일정 기간이 지나면 과육이 쉽게 물러지고 기호도가 떨어지는 점을 고려해 볼 때, kiwifruit 과실의 활용방 안을 강구할 필요가 있는데, actinidin을 포함한 단백질 분 해효소의 산업적 이용이 그 방안이 될 수 있을 것이다.
- 하지만, Co2+, Cu2+, Al3+, Fe3+ 등 금속이온의 영향이 다소 다르게 나타나서 단백질 분해효소 PI, PH, PHI는 서로 별개의 효소일 가능성 또한 배제할 수 없을 것으로 보인다. 앞으로 이들 단백질 분해효소 PI, PH, PHI의 1차 구조 또는 면역학적 친화성 등을 면밀히 검토할 필요가 있다고 사료된다.
- 산업적 가치를 고려해 볼 때 단백질 분해 효소는 우선적으로 넓은 기질특이성과 열 안정성이 높아야 한다. 위의 Fig. 6~7의 연구 결과로 보아 kiwifruit에서 추출한 단백질 분해효소는 40℃ 전후에서 최대의 활성을 보이고, 고온에서도 상당 시간 비교적 안정한 특성을 보여 식품제조, 식육연화 등 식품산업 분야에서의 활용 가능성이 높을 것으로 보이며, 나아가 단백질이 갖는 식품학적 기능성을 높이는 데에도 사용할 수 있을 것으로 판단된다. 더욱이 이들 단백질 분해효소는 추출원이 과실이기 때문에 식품첨가제로서 안전성이 있어 그 이용가치가 충분한 것으로 사료된다.
- 이상의 연구결과를 종합해보면 kiwifruit의 단백질 분 해효소 중 PDI는 최적pH와 열 안정성이 동물성 단백질 분 해효소인 pepsin (EC 3.4.23.1.)이나 곰팡이 (Aspergillus niger var. macrosporus)^} acid protease (EC 3.4.23.6)의 것과 유사하 예4], 효소 활성도 및 경제성 측면에서 pepsin이 나 acid protease의 대용으로서 가치가 있을 것으로 주정 된다. 하지만, 단백질 분해효소 PI 과 PH가 PM와 어떠한 관련성이 있는지 또는 PD1 와는 전혀 다른 단백질 분해효소인 지를 밝힐 필요가 있다.
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