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문제 정의
- 본 연구는 Agrobacterium 내의 T-DNA가 식물세포의 염색체에 도입되는 과정에서 영향을 줄 것으로 생각되는 여러 요인들을 GUS유전자의 발현을 통해서 조사하였다. 그리고 그 연구 결과에서 검토된 최적의 형질전환방법을 사용하여 농업적으로 이용가치가 높은 GPAT 유전자 (phosphatidyl glycerol의 지방산 불포화도를 변화시킴으로써 내한성을 갖게 하는 유전자)를 동진벼에 도입하고.
- 그리고 그 연구 결과에서 검토된 최적의 형질전환방법을 사용하여 농업적으로 이용가치가 높은 GPAT 유전자 (phosphatidyl glycerol의 지방산 불포화도를 변화시킴으로써 내한성을 갖게 하는 유전자)를 동진벼에 도입하고. 재분화된 식물체로부터 형질전환체의 빈도를 조사하는 것이 본 연구의 최종 목적이다.
제안 방법
- 캘러스 유도배지에 0. 1, 3일간 각각 배양하였다. 배양된 각처리구의 캘러스는 상기의 pIG121Hm 유전자가 포함된 Agrobacterium EHA101 균 현탁액에 5분간 침적시킨 후 공동배양 배지 (Table 1) 위에서 28℃, 3일간 암배양하였다.
- 암조건에서 3, 6, 10. 15일간 각각 공동배양하였다. 공동배양이 끝난 각각의 처리 구의 캘러스는 상기와 동일하게 제균 및 배양한 후 GUS 염색을 하였다.
- 2, 4-D의 농도 : 2.4-D 0, 1, 2, 4, 8 (mg/L) 의 농도로 각각 조절된 공동배양배지에 균접종된 캘러스를 각 처리구별로 치상하여 공동배양하였다.
- 1975) 캘 러스 유도배지 (Table 1)에 종자를 치상하였다. 25C ±1, 3000 lux의 연속광 조건에서 20일간 배양하여 callus를 유도하였다. 완숙종자의 배유와 자엽부분을 핀셋으로 제거하고 캘러스 부분만을 채취하여 이 중 갈변되었거나 점성물질이 붙어 있는 캘러스를 제거한 후에 실험재료로 이용하였다.
- Acetosyringone의 농도 : Acetosyringone의 농도를 0, 10, 30, 50, 100 (mg/L)으로 각각 조정한 공동배양배지에 상기의 Agrobacterium EHA101 균접종 처리가 끝난 캘러스를 각 처리구별로 치상하여 공동배양하였다.
- Agrobacteriiuri을 이용한 벼의 효율적인 형질전환을 위하여 몇 가지 형질전환 조건을 조사하였다. 그리고 조사된 최적의 형질전환 방법을 이용하여 내한성에 관련된 GPAT 유전자를 식물에 도입하였다.
- Agrobacterium 감염에 영향을 줄 수 있는 공동 배양 배지의 첨가제 종류 및 농도에 따른 GUS 발현율을 다음과 같이 조사하였다.
- Agrobacterium 감염전 캘러스의 전배양기간에 따른 GUS 유전자의 발현 빈도는 table 2에서 보여준 것과 같이 3일간 캘러스 유도배지에 전배양한 처리구에서 가장 많은 GUS spot 수를 관찰하였다. 특히 전배양을 하지 않은 처리구에 비해서는 약 2배의 증가를 보여주었다 이러한 결과는 오옥신이 첨가된 새로운 배지에 일정기간 캘러스를 치상함으로써 기존의 캘러스로부터 세포분열이 활발한 새로운 세포군을 다량 확보할 수 있기 때문이고, 동시에 그러한 캘러스 집단은 Agrobac terium 감염에 대해서 대단히 용이할 것으로 생각된다.
- Betaine의 농도 : 공동배양배지 내의 betaine농도를 각각 0, 60, 120, 180 (mg/L)으로 조절한 후 균접종된 캘러스를 각 처리 구의 배지에 치상한 후 배양하였다.
- CaCL의 농도 : 공동배양배지 내의 CaCL의 농도만을 0, 50, 150, 300, 600 (mg/L)으로 각각 조절하고 균접종된 캘러스를 각 처리구별로 치상하였다.
- 이 상층액에 2배량의 에탄올을 첨가 침전시키고 원심분리하여 DNA를 추출하였다. DNA 20 을 Bam 제한효소로 절단한 후 전기영동에 의해 0.8% agrose gel에 분획한 후 nylone membrane에 전사시켰다. Hybridization은 Southern (1975) 방법에 따라 행하여졌다.
- GPAT 유전자가 형질전환된 T, 세대의 식물체를 온실에서 재배한 후 외형적으로 정상이고 종자의 채종이 가능한 6개 통의 식물로부터 종자를 각각 수확하였다. 채종된 각 계통의 종자로부터 종피를 벗기고 표면 살균한 뒤 hygromycine 50 mg/L포함된 1/2 MS 배지에 파종하여 배양 14일 후에 저항성과 감수성 식물체의 분리비를 X2 검정에 의해서 추정하였다.
- GUS 유전자로 검토한 동진벼의 형질전환 적정조건을 이용하여 GPAT 유전자를 벼에 형질전환 시켰다. 그 결과 2번의 실험에서 hygromycin 저항성 식물체로 판단된 형질전환식물체가 각각 54%와 32%로 관찰되었다 (Table 4).
- Hygromycin 저항성 식물체로 분화된 T1세대의 형질전환 식물체 7계통을 임의적으로 골라서 1개의 대조구 식물과 함께 염색체 DNA를 추출하고, copy수의 관찰이 가능한 제 한효소 Bam HL으로 처리한 후 GPAT probe를 이용하여 southern 분석을 실시하였다. 그 결과 모든 형질전환 식물체는 2.
- Hybridization은 Southern (1975) 방법에 따라 행하여졌다. Probe DNA는 pBluescript에 삽입된 GPAT의 cDNA(1.4kb)를 제한효소 처리에 의해 단리하였고 0-32P] dCTP로 표지한 후 X- rayfilm에 10시간 동안 노출하였다.
- T1 세대에서 외형적으로 정상이고 종자의 채종이 가능한 6 계통의 형질전환 식물체로부터 T1세대의 종자를 채종하여 hygromycin을 포함한 배지에 치상하고 각 종자의 저항성 검증을 시도하였다. 그 결과 5계통에서는 저항성과 감수성의 비율이 멘델의 이론적 분리비에 적합한 3 : 1로 분리되었다.
- 벼 캘러스에 대한 GPAT 유전자의 형질전환 방법은 전술한 pIG121Hm 유전자를 이용한 실험에서 GUS 발현이 가장 효율 높게 나타난 조건을 사용하였다. 간단히 소개하면 2, 4-D 2 mg/L 포함된 N6배지에서 3주간 유도된 캘러스를 채취하여 3일간 전배양한 후 Agrobacterium에 5분간 감염시켰다. 이 러 한 캘 러 스는 50 mg/L CaCL, 30 mg/L acetosyringone, 2 mg/L 2, 4-D, 120 mg/L betaine을 포함한 공동배지에 치 상한 후 10일간 28'C에서 암배양하였다.
- 공동배양기간에 따른 Agrobacterium 감염의 영향을 조사하기 위해서 3일간 전배양이 끝난 캘러스를 상기의 Agro bacterium EHAI01 균현탁액에 5분간 침적시킨 후 여분의 수분을 제거하였다. 공동배양배지 위에 멸균된 여과지를 1장 깔고 균 접종된 캘러스를 치상한 후 28℃.
- 15일간 각각 공동배양하였다. 공동배양이 끝난 각각의 처리 구의 캘러스는 상기와 동일하게 제균 및 배양한 후 GUS 염색을 하였다.
- 3000 lux의 명조건에서 배양하였다. 그 후 50mg/Lhygro mycin과 250 mg/L carbenicillin을 포함한 MS (Murasige and Skoog 1962)재분화 배지 (Table 1)에 이식한 후 녹색의 신초가 분화가 관찰되었을 때 생장조절물질이 첨가되지 않은 뿌리 유도 배지 (Table 1)에 이식하여 외형적으로 정상적인 식물체만을 선발하였다. 배양기에서 순화가 끝난 식물체는 pot 에 옮겨서 온실의 자연광 조건에서 재배하였다.
- GUS유전자의 발현을 통해서 조사하였다. 그리고 그 연구 결과에서 검토된 최적의 형질전환방법을 사용하여 농업적으로 이용가치가 높은 GPAT 유전자 (phosphatidyl glycerol의 지방산 불포화도를 변화시킴으로써 내한성을 갖게 하는 유전자)를 동진벼에 도입하고. 재분화된 식물체로부터 형질전환체의 빈도를 조사하는 것이 본 연구의 최종 목적이다.
- 가지 형질전환 조건을 조사하였다. 그리고 조사된 최적의 형질전환 방법을 이용하여 내한성에 관련된 GPAT 유전자를 식물에 도입하였다. 형질전환 조건은 GUS 발현을 통하여 조사되었다.
- 연속광조건에서 배 양하였다. 배 양된 캘러스로부터 GUS 유전자의 발현분석을 실시하였다.
- 이 유전자는 binary vector T-DNA 내부에 hygromycin phosphotransferase와 kanamycin 저항성 유전자가 함께 삽입된 유전자 (pBI101-Ub) 로서 Agrohacterium EHA101 균주에 형질전환되어 있다 (Figure 1B). 벼 캘러스에 대한 GPAT 유전자의 형질전환 방법은 전술한 pIG121Hm 유전자를 이용한 실험에서 GUS 발현이 가장 효율 높게 나타난 조건을 사용하였다. 간단히 소개하면 2, 4-D 2 mg/L 포함된 N6배지에서 3주간 유도된 캘러스를 채취하여 3일간 전배양한 후 Agrobacterium에 5분간 감염시켰다.
- 벼의 종피를 제거하고 70% 에탄올에서 1분간 교반한 후 4% sodium hypochloride 용액 (200/vL의 Tween 20 첨가)에 15분 간 교반하면서 표면 살균하였다. 살균된 종자를 멸균수에 3회 이 상 세 척 하고 2, 4-D 2 mg/L, 포함된 N6 (Chu et al. 1975) 캘 러스 유도배지 (Table 1)에 종자를 치상하였다. 25C ±1, 3000 lux의 연속광 조건에서 20일간 배양하여 callus를 유도하였다.
- 공동배양이 끝난 캘러스는 500 mg/L carbenicillin 첨가된 멸균수에서 3회 세척하고 250 mg/L의 carbenicillin 포함된 캘러스 증식 배지에 25℃. 7일간, 연속광 조건에서 배양하였다. 배양된 캘러스로부터 GUS 유전자의 발현분석은 Jefferson 등(1987)의 방법에 따라 조사하였다.
- 식물로부터 종자를 각각 수확하였다. 채종된 각 계통의 종자로부터 종피를 벗기고 표면 살균한 뒤 hygromycine 50 mg/L포함된 1/2 MS 배지에 파종하여 배양 14일 후에 저항성과 감수성 식물체의 분리비를 X2 검정에 의해서 추정하였다.
- 형 질전환 식물체 와 wild type 벼 의 엽육조직 500 mg을 채 취하여 액체질소로 분쇄시킨 후 Shure 등 (1983)의 DNA 추출 방법을 변형시켜 genomic DNA를 추출하였다. 먼저 2X추출고정 액 (0.
- 그리고 조사된 최적의 형질전환 방법을 이용하여 내한성에 관련된 GPAT 유전자를 식물에 도입하였다. 형질전환 조건은 GUS 발현을 통하여 조사되었다. 본 실험에서는 벼 (Oryza saliva L.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 벼 (0<vwL.)는 남부지방에서 많이 재배되고 있는 동진 품종의 완숙 종자를 이용하였다. 벼의 종피를 제거하고 70% 에탄올에서 1분간 교반한 후 4% sodium hypochloride 용액 (200/vL의 Tween 20 첨가)에 15분 간 교반하면서 표면 살균하였다.
- 형질전환 조건은 GUS 발현을 통하여 조사되었다. 본 실험에서는 벼 (Oryza saliva L. cv. Dongjin) 의성숙 종자 유래 캘러스를 3일간 전배양한 후 Agmhacterium 을 접종하였다. 접종이 끝난 캘러스는 50 mg/LCaCL, 30 mg/L acetosyringone, 2 mg/L 2, 4-D, 120 mg/L betaine이 첨 가된 공동배양 배지 위에서 암조건으로 10일간 공동배양하여 높은 GUS 발현을 관찰할 수 있었다.
- 25C ±1, 3000 lux의 연속광 조건에서 20일간 배양하여 callus를 유도하였다. 완숙종자의 배유와 자엽부분을 핀셋으로 제거하고 캘러스 부분만을 채취하여 이 중 갈변되었거나 점성물질이 붙어 있는 캘러스를 제거한 후에 실험재료로 이용하였다.
이론/모형
- 8% agrose gel에 분획한 후 nylone membrane에 전사시켰다. Hybridization은 Southern (1975) 방법에 따라 행하여졌다. Probe DNA는 pBluescript에 삽입된 GPAT의 cDNA(1.
- A). pIG121Hm 증식은 E. coli JM109를 숙주로 이용하였고, plasmid DNA의 추출은 Bimboim과 Doli(1979)의 방법을 이용하였다. 추출된 pIG121Hm은 freezing-thawing 방법을 이용하여 Agrobacterium turnefaciens EHA101 에 형 질전환시켰다.
- 7일간, 연속광 조건에서 배양하였다. 배양된 캘러스로부터 GUS 유전자의 발현분석은 Jefferson 등(1987)의 방법에 따라 조사하였다.
- coli JM109를 숙주로 이용하였고, plasmid DNA의 추출은 Bimboim과 Doli(1979)의 방법을 이용하였다. 추출된 pIG121Hm은 freezing-thawing 방법을 이용하여 Agrobacterium turnefaciens EHA101 에 형 질전환시켰다. 형질전환된 균주는 hygromycin 50 mg/L, kanamycin 100 mg/L 첨가된 YEP 액체배지 (Table 1)에서 28℃, 24〜36시간 배양한 후 그 이상 계대배양하지 않고 glycerol 60% 용액과 1:1 로 혼합하여 에 보관하였다 Glycerol에 저장된 Agrobacterium 용액으로부터 10〃L을 채취하여 상기와 동일한 농도의 항생물질이 포함된 YEP 액체배지 5mL에 넣고 28℃, 24시간 배양하고, 800rpm에서 1분간 원심한 후 침전된 pellet을 acetosyringone 을 함유한 AA액체배지에서 재현탁 (l07 cell/mL)하였다.
성능/효과
- Agmbacterium 감염 후 공동배양에 사용되는 배지의 성분 중에 일부 첨가제의 종류 및 농도에 따라 GUS 발현율에 많은 차이를 보여 주었다. 먼저 CaCL농도에 따른 GUS 유전자의 발현빈도는 150 mg/L 이 상의 고농도보다 50 mg/L의 저농도에서 가장 많은 spot수가 관찰되었다 (Figure 3A).
- GUS 유전자의 발현빈도는 Agrobacterium 공동배양 기간에 따라 많은 차이를 보여주었다 (Table 3). GUS 의 spot수는 공동배양 6일부터 급격히 증가하기 시작하여 10일째 84.
- 많은 차이를 보여주었다 (Table 3). GUS 의 spot수는 공동배양 6일부터 급격히 증가하기 시작하여 10일째 84.3개로 가장 많이 관찰되었으며, 기존의 실험에서 많이 적용하고 있는 3일간의 공동배양 처리구에 비해서는 약 2.3배의 증가를보여주었다. 또한 공동배양기간을 15일간 하였을 경우에는 오히려 GUS spot 수는 감소하였다 (Figure 2).
- 공동배양배지의 betaine 농도에 따른 GUS 유전자의 형질 전환율은 betaine 무처리구에 비해서 첨가된 처리구에서 GUS 유전자의 blue spot수가 증가하였으며 특히 120 mg/L의 농도에서 가장 많이 관찰되었다 (Figure 3D). 지금까지 공동 배양 배지 내에 betaine을 첨가하여 벼의 형질전환연구를 시도한 예 (Lee at al.
- GPAT 유전자를 벼에 형질전환 시켰다. 그 결과 2번의 실험에서 hygromycin 저항성 식물체로 판단된 형질전환식물체가 각각 54%와 32%로 관찰되었다 (Table 4). 본 연구의 형질 전환율은 Agrobacterium을 감염시킨 캘러스로부터 형질전환 식물체가 분화된 수를 조사한 것이기 때문에 중간에 hygromycine 저항성 캘러스만을 골라서 식물 재분화 배지에 치상 하였을 경우에는 형질전환율은 위의 조사결과보다 훨씬 높은 수치로 관찰될 수 있었다.
- 시도하였다. 그 결과 5계통에서는 저항성과 감수성의 비율이 멘델의 이론적 분리비에 적합한 3 : 1로 분리되었다. 그러나 1계통은 저항성과 감수성의 비율이 1 : 15로 관찰되었다 (Table 5).
- 실시하였다. 그 결과 모든 형질전환 식물체는 2.0 kb 이상의 위치에서 밴드가 관찰되었으나 대조구 식물체는 어떠한 밴드도 관찰되지 않았다. 또한 형질전환 식물체는 계통에 따라서 밴드수도 1 〜4개까지 다양하게 나타났다 (Figure 4).
- 차이를 보여 주었다. 먼저 CaCL농도에 따른 GUS 유전자의 발현빈도는 150 mg/L 이 상의 고농도보다 50 mg/L의 저농도에서 가장 많은 spot수가 관찰되었다 (Figure 3A). 일반적으로 사용되는 MS배지의 CaCL 농도는 440 mg/L 이기 때문에 이러한 조성의 배지를 공동배양배지로 그대로 사용할 경우 벼에 있어서는 형질전환 효율을 감소시킬 수 있다.
- 그 결과 2번의 실험에서 hygromycin 저항성 식물체로 판단된 형질전환식물체가 각각 54%와 32%로 관찰되었다 (Table 4). 본 연구의 형질 전환율은 Agrobacterium을 감염시킨 캘러스로부터 형질전환 식물체가 분화된 수를 조사한 것이기 때문에 중간에 hygromycine 저항성 캘러스만을 골라서 식물 재분화 배지에 치상 하였을 경우에는 형질전환율은 위의 조사결과보다 훨씬 높은 수치로 관찰될 수 있었다. 지금까지 Agrobacterium을 이용한 벼의 형질전환연구는 다양한 유전자를 이용하여 자포니카형 (Hiei et al.
- 이상의 연구결과를 종합해 보면 본 연구에서 검토된 벼의 형질전환 체계는 GPAT 유전자를 이용하여 형질전환을 시행한 결과에서도 알 수 있듯이 고효율의 형질전환 식물체를 만드는 데 매우 적합하다고 생각되며, 또한 도입된 유전자도 후대에 안정적으로 유전된다는 것을 알 수 있었다. 그리고 이와같이 고빈도의 형질전환율은 쌍자엽 식물의 담배, 애기장대와 같이 단자엽식물의 형질전환에 있어서 모델식물로 사용할 수 있으리라 기대된다.
- 접종이 끝난 캘러스는 50 mg/LCaCL, 30 mg/L acetosyringone, 2 mg/L 2, 4-D, 120 mg/L betaine이 첨 가된 공동배양 배지 위에서 암조건으로 10일간 공동배양하여 높은 GUS 발현을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 방법으로 GPAT 유전자를 식물에 도입한 결과 54%의 높은 형질전환율을 나타내었다. 형질전환 식물체를 southern 분석한 결과 wild type 식물체에서는 GPAT 유전자가 검출되지 않았으나.
- Dongjin) 의성숙 종자 유래 캘러스를 3일간 전배양한 후 Agmhacterium 을 접종하였다. 접종이 끝난 캘러스는 50 mg/LCaCL, 30 mg/L acetosyringone, 2 mg/L 2, 4-D, 120 mg/L betaine이 첨 가된 공동배양 배지 위에서 암조건으로 10일간 공동배양하여 높은 GUS 발현을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 방법으로 GPAT 유전자를 식물에 도입한 결과 54%의 높은 형질전환율을 나타내었다.
- 관찰하였다. 특히 전배양을 하지 않은 처리구에 비해서는 약 2배의 증가를 보여주었다 이러한 결과는 오옥신이 첨가된 새로운 배지에 일정기간 캘러스를 치상함으로써 기존의 캘러스로부터 세포분열이 활발한 새로운 세포군을 다량 확보할 수 있기 때문이고, 동시에 그러한 캘러스 집단은 Agrobac terium 감염에 대해서 대단히 용이할 것으로 생각된다. 또한 본 연구와 유사한 연구결과가 애기장대 식물의 형질전환 연구에서도 보고된 바가 있다 (Sangwan et aL 1992).
후속연구
- 이 경우 공동배 양배지에 CaCL을 전혀 첨가하지 않았을 경우 가장 효과가 있는 것으로 보고하였다. 그러나 본연구결과에서는 배양배지 내에 CaCL가 장기간 결핍될 경우 식물세포 생장에 영향을 주기 때문에 위에서 언급한 바와 같이 공동배양기간에만 적용하는 것이 좋다고 생각한다.
- 안정적으로 유전된다는 것을 알 수 있었다. 그리고 이와같이 고빈도의 형질전환율은 쌍자엽 식물의 담배, 애기장대와 같이 단자엽식물의 형질전환에 있어서 모델식물로 사용할 수 있으리라 기대된다.
- 또한 GPAT 유전자로 형질전환된 5계통의 T1 세대에서 hygromycin에 대한 저항성과 감수성의 유전비율이 3 : 1로 분리되었다. 따라서 본 실험의 결과에서 검토된 고빈도의 형질전환 시스템은 단자엽식물의 형질전환에 있어서 모델계로 이용될 수 있으리라 기대된다.
- 이 러한 단자엽 식물인 벼는 Agrobacterium 균주에 대해서 비숙주 식물이기 때문에 기존의 담배 등과 같은 쌍자엽 식물과는 다른 형질전환 방법이 여러 측면에서 검토되어야 한다. 또한 쌍자엽 식물과 비교해서 형질전환 효율이 낮은 것과 벼 품종간에 식물체 재분화 능력 (Kwon et al. 2000) 및 형질전환의 효율 (Henry et al. 1994; Hiei et al. 1994; Lee et al. 1998; Oh et al. 2000)에 큰 차이점을 보이는 것도 앞으로 개선되어야 할 과제이다. 따라서 Agrobacteriuni을 이용한 형질전환 방법을 캘러스에 적용하여 형질전환 효율을 증가시키기 위해서는 Agrobac terium 내의 T-DNA가 식물세포 안으로 잘 도입될 수 있는 조건을 확립하는 것과 유전자가 도입된 세포가 정상적으로 세포 분열하여 식물체의 재분화가 효율적으로 이루어지는 배양계의 확립이 중요하다.
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