[국내논문]Particle Bombardment에 의해 전처리 된 참나리(Lilium lancifolium Thunb.) 캘러스의 Agrobacterium tumefaciens을 통한 형질전환 Agrobacterium Mediated Transformation from Callus Pretreated with Particle Bombardment in Lilium lancifolium Thunb.원문보기
형질전환 효율을 높이기 위하여, NPTII와 GUS유전자를 포함하고 있는 pIG121Hm을 미세 입자에 코팅하여 particle bombardment를 수행한 후 pIG121Hm가 도입된 Agrobacterium tumefaciens EHA101와 3일간 공동 배양하였다. 그 후 캘러스를 1mg/L 2,4-D, 0.1mg/L BAP, 100mg/L kanamycin, 그리고 200mg/L carbenicillin이 포함된 MS배지로 옮겨 4주간 성장시킨 후 kanamycin저항성 캘러스를 선발하여 GUS 발현을 관찰하였고, PCR 분석을 통하여 700 bp의 NPT II 유전자가 도입된 것을 확인하였다. Particle bombardment 후 Agrobacterium과 공동배양 한 처리구가 Agrobacterium과 공동배양만 한 처리구보다 GUS발현 분석에 의한 형질전환 효율이 3배정도 더 높았다 형질전환 된 재분화 식물체를 얻기위해 다시 선발된 kanamycin저항성 캘러스는 1mg/L NAA와 1mg/L BAP가 포함된 재분화 배지에 옮겨져 4주 후 형질전환 된 소인경을 형성하였다.
형질전환 효율을 높이기 위하여, NPTII와 GUS유전자를 포함하고 있는 pIG121Hm을 미세 입자에 코팅하여 particle bombardment를 수행한 후 pIG121Hm가 도입된 Agrobacterium tumefaciens EHA101와 3일간 공동 배양하였다. 그 후 캘러스를 1mg/L 2,4-D, 0.1mg/L BAP, 100mg/L kanamycin, 그리고 200mg/L carbenicillin이 포함된 MS배지로 옮겨 4주간 성장시킨 후 kanamycin저항성 캘러스를 선발하여 GUS 발현을 관찰하였고, PCR 분석을 통하여 700 bp의 NPT II 유전자가 도입된 것을 확인하였다. Particle bombardment 후 Agrobacterium과 공동배양 한 처리구가 Agrobacterium과 공동배양만 한 처리구보다 GUS발현 분석에 의한 형질전환 효율이 3배정도 더 높았다 형질전환 된 재분화 식물체를 얻기위해 다시 선발된 kanamycin저항성 캘러스는 1mg/L NAA와 1mg/L BAP가 포함된 재분화 배지에 옮겨져 4주 후 형질전환 된 소인경을 형성하였다.
To improve transformation efficiency, the callus of Lilium lancifolium Thunb. were bombarded by particles coated with pIG 121 Hm which include NPT II and GUS genes, and then cocultivated with Agrobacterium tumefaciens EHA101 which contain pIG121Hm binary vector, carrying neomycin phosphotransferase ...
To improve transformation efficiency, the callus of Lilium lancifolium Thunb. were bombarded by particles coated with pIG 121 Hm which include NPT II and GUS genes, and then cocultivated with Agrobacterium tumefaciens EHA101 which contain pIG121Hm binary vector, carrying neomycin phosphotransferase (NPT II) and $\beta$-Glucuronidase (GUS) genes. Three days after cocultivation with Agrobacterium tumefaciens and particle bombardment, the callus clusters were transferred to MS medium containing 1mg/L 2,4-D, 0.1mg/L BAP, 100mg/L kanamycin and 200mg/L carbenicillin. Four weeks after transfer to the selection medium, GUS expression was detected and PCR analysis revealed the presence of NPT II fragment of the expected size (700 bp) in the transformed callus. The GUS expression from Agrobacterium-mediated transformants after particle bombardment increased to over 3-folds compared with that of callus cocultivated with Agrobacterium tumefaciens without particle bombardment. The callus clusters containing kanamycin resistant gene were transferred to MS medium containing 1mg/L NAA and 1mg/L BAP. Somatic embryos were developed in four weeks and microbulbs expressing GUS were formed.
To improve transformation efficiency, the callus of Lilium lancifolium Thunb. were bombarded by particles coated with pIG 121 Hm which include NPT II and GUS genes, and then cocultivated with Agrobacterium tumefaciens EHA101 which contain pIG121Hm binary vector, carrying neomycin phosphotransferase (NPT II) and $\beta$-Glucuronidase (GUS) genes. Three days after cocultivation with Agrobacterium tumefaciens and particle bombardment, the callus clusters were transferred to MS medium containing 1mg/L 2,4-D, 0.1mg/L BAP, 100mg/L kanamycin and 200mg/L carbenicillin. Four weeks after transfer to the selection medium, GUS expression was detected and PCR analysis revealed the presence of NPT II fragment of the expected size (700 bp) in the transformed callus. The GUS expression from Agrobacterium-mediated transformants after particle bombardment increased to over 3-folds compared with that of callus cocultivated with Agrobacterium tumefaciens without particle bombardment. The callus clusters containing kanamycin resistant gene were transferred to MS medium containing 1mg/L NAA and 1mg/L BAP. Somatic embryos were developed in four weeks and microbulbs expressing GUS were formed.
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문제 정의
본 연구에서는 위의 두 가지 형질전환 방법을 변형하여 병행함으로써 형질전환 효율을 향상시키고자 하였다. 즉, DNA 를 코팅하여 particle bombardment를 실행한 참나리소인편을 Agrobacterium으로 감염시킨 처리구와 전처리 없이 Agrobacterium만 감염시킨 처리구로 나누어서 GI/S발현과 FCR분석을 통한 형질전환 효율을 비교 확인함으로써 보다 효율이 높은 형질전환방법을 개발하기 위하여 실시되었다.
본 연구에서는 위의 두 가지 형질전환 방법을 변형하여 병행함으로써 형질전환 효율을 향상시키고자 하였다. 즉, DNA 를 코팅하여 particle bombardment를 실행한 참나리소인편을 Agrobacterium으로 감염시킨 처리구와 전처리 없이 Agrobacterium만 감염시킨 처리구로 나누어서 GI/S발현과 FCR분석을 통한 형질전환 효율을 비교 확인함으로써 보다 효율이 높은 형질전환방법을 개발하기 위하여 실시되었다.
제안 방법
Kanamycin저항성 캘러스로부터 소인경으로의 재생율을 조사하기 위하여 particle bombardment 후 Agrobacterium 을 감염시킨 처리구와 Agrobacterium 만 감염시킨 처리구를 각각 선발 배지에서 4주간 성장시켜 kanamycin저항성 캘러스를 선발 한 후 재분화 배지에서 4주간 성장시킨 결과 particle bombardment 후 Agrobacteris을 감염시킨 처리구 200개 중에서 3개 (1.5%)의 소인경이 캘러스로부터 소인경이 형성되는 재분화 과정이 진행되 었고, Agrobacterium만 감염시킨 실험구에서는 재분화가 일어나지 않았다. 재분화된 소인경은 GUS 가 발현되는 것을 확인하였다(Figure 2).
선발 배지로부터 증식된 캘러스를 대상으로 GUS활성의 조직화학적 분석을 Jefferson 등(1987)의 방법에 따라 실시하였다. Particle bombardment 처리와 Agrobacterium 공동배양 후 선발배지에서 증식된 캘러스와 Agrobacterium 공동배양만을 거친 후 선발 배지에서 증식된 캘러스를 GUS 염색액(2mM5-bromo-4-chloro-3-indolyl-glucuronide in 50mM NaPO4, pH7.0)에 침적 후 37℃에서 24시간 반응시켜서 GUS유전자의 발현 여부를 확인하였다.
25 μL, template DNA 5를 넣고 전체 용액을 25 μL로 하여 반응시켰다. Primer는 5'-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3, 와 5'- ATCGGGAGCGGCGAT ACCGTA-3, 을 사용하였고, PCR Thermo Cycler를 이용한 첫 DNA변성은 94℃ 에서 1분간, 그 후의 변성은 94℃ 에서 1분간, annealinge 60℃ 에서 1분간, 그리고 DNA 합성은 72℃ 에서 1분간 35 cycle로 실행하였으며, 최종 DNA합성은 72℃ 에서 10분간 하였다. 반응시킨 용액은 1% agarose gel에 전개시켜 확인하였다.
YEP액체배지 (Table 1)에서 28℃, 암배양한 A. tumefaciens EHA101 을 식물재료와 함께 con-tube에 넣은 후, Chai와 Kim (2000)의 방법을 변형하여 bath sonication에서 5분간, vacuum 하에서 20분간 침적시킨 후 co-cultme배지에서 3일간 26℃ 암상태에서 공동배양 하였다.
형질전환 효율을 높이기 위하여, NFT 와 GUS 유전자를 포함하고 있는 pIG121Hm을 미세입자에 코팅하여 particle bombardment를 수행한 후 pIG121Hm가 도입된 Agrobacterium tumefaciens EHA 101 3일간 공동배양하였다. 그 후 캘러스를 1 mg/L 2, 4-D, 0.1 mg/L BAP, 100 mg/L kanamycin, 그리고 200 mg/L carbenicillin이 포함된 MS배지로 옮겨 4주 간 성장*시킨 후 kanamycin 저항성 캘러스를 선발하여 GUS 발현을 관찰하였고, PCR 분석을 통하여 700 bp의 NPTH유전 자가 도입된 것을 확인하였다. Particle bombardment 후 Agrobacteriume- 공동배양한 처리구가 Agrobacterium2\ 공동배양만한 처리구보다 GUS 발현 분석에 의한 형질전환 효율이 3배 정도 더 높았다 형질전환된 재분화 식물체를 얻기 위해 다시 선발된 kanamycin 저항성 캘러스는 1 mg/L NAA 와 1mg/LBAP가 포함된 재분화 배지에 옮겨져 4주 후 형질전환 된 소인경을 형성하였다.
도입된 외래유전자를 확인하기 위하여 캘러스 세포 괴로부터 분리한 염색체 DNA로 PCR을 실시하였다. 21-mer의 oligomer로 된 NPT Ⅱ 유전자의 염기서열 양쪽 말단 특이 primer를 사용하여 PCR> 수행한 결과 700 bp크기의 DNA밴 드가 얻어졌다(Figure 3).
선발 배지에서 4주간 증식된 캘러스를 재분화 배지에 치상하여 25℃, 16시간 광(2000 lux)조건에서 캘러스로부터 소인경의 발생을 유도하였다. 캘러스로부터 재분화된 소인경의 형질 전환 유무를 확인하기 위하여 GUS유전자 발현 분석을 실시하였다.
선발 배지에서 4주간 증식된 캘러스를 재분화 배지에 치상하여 25℃, 16시간 광(2000 lux)조건에서 캘러스로부터 소인경의 발생을 유도하였다. 캘러스로부터 재분화된 소인경의 형질 전환 유무를 확인하기 위하여 GUS유전자 발현 분석을 실시하였다.
형질전환 효율을 높이기 위하여, NFT 와 GUS 유전자를 포함하고 있는 pIG121Hm을 미세입자에 코팅하여 particle bombardment를 수행한 후 pIG121Hm가 도입된 Agrobacterium tumefaciens EHA 101 3일간 공동배양하였다. 그 후 캘러스를 1 mg/L 2, 4-D, 0.
대상 데이터
식물재료는 참나리종자를 사용하였으며 종자를 흐르는 수돗물에 깨끗이 씻은 후 증류수로 3회 세척하고 무균상 내에서 70% ethanol로 3분간 소독한 다음 멸균수로 세척한 후 Tween20이 첨가된 1% sodium hypochlorite 용액에 종자를 교반하면서 10분간 소독하고 멸균수로 3회 세척 하였다 소독된 종자를 MS기본배지(Murashige and Skoog 1962)에 치상하여 26±2℃에서 일장 16시간 광(2,000 Lux)과 8시간 암 주기로 70일정도 배양하여 기내 소식물체의 소인편(microscales)을 실험 재료로 사용하였다. 기내 배양한 소인편을 캘러스유도배지 (Table 1)에 치상한 후, 26℃에서 8주간 암배양하여 캘러스를 유도하였으며, 유기된 캘러스는 직경 0.5 cm의 크기로 잘라 실험 재료로 사용하였다.
식물재료는 참나리종자를 사용하였으며 종자를 흐르는 수돗물에 깨끗이 씻은 후 증류수로 3회 세척하고 무균상 내에서 70% ethanol로 3분간 소독한 다음 멸균수로 세척한 후 Tween20이 첨가된 1% sodium hypochlorite 용액에 종자를 교반하면서 10분간 소독하고 멸균수로 3회 세척 하였다 소독된 종자를 MS기본배지(Murashige and Skoog 1962)에 치상하여 26±2℃에서 일장 16시간 광(2,000 Lux)과 8시간 암 주기로 70일정도 배양하여 기내 소식물체의 소인편(microscales)을 실험 재료로 사용하였다. 기내 배양한 소인편을 캘러스유도배지 (Table 1)에 치상한 후, 26℃에서 8주간 암배양하여 캘러스를 유도하였으며, 유기된 캘러스는 직경 0.
이론/모형
Bimboim과 Doli (1979)의 방법을 이용하여 Agrobacterium 으로부터 plasmid DNA< 추출하여 1 μg/μL의 농도로 -20℃ 에서 보관하며 사용하였다. Sanford등 (1993)의 방법에 따라 pIG121Hm을 코팅하기 위하여 tungsten (1.
선발 배지로부터 증식된 캘러스를 대상으로 GUS활성의 조직화학적 분석을 Jefferson 등(1987)의 방법에 따라 실시하였다. Particle bombardment 처리와 Agrobacterium 공동배양 후 선발배지에서 증식된 캘러스와 Agrobacterium 공동배양만을 거친 후 선발 배지에서 증식된 캘러스를 GUS 염색액(2mM5-bromo-4-chloro-3-indolyl-glucuronide in 50mM NaPO4, pH7.
유전자의 삽입 여부를 확인하기 위하여 Fulton 등(1995)의 방법을 이용하여 primer를 이용한 PCR 분석을 수행하였다. PCR 반응 용액은 lOxbuffer 2.
성능/효과
Kanamycin 에 저항성을 나타내는 캘러스를 선발한 결과 particle bombardment Agrobacterium-^: 감염시킨 처리구에 서는 33%의 kanamycin 저항성 캘러스 발생율을 보였으며 Agrobacterium감염만 처리한 실험구에서는 26.5%의 kana- mycin저항성 캘러스 발생율을 나타내었다.
선발 배지에서 선발된 캘러스 세포괴를 각각 GL/S 발현 분석해본 결과, particle bombardment 후 Agmbacferium을 감염시킨 처리구는 16%, Agrobacteriume 감염시킨 실험구는 5.5%의 캘러스 세포 괴에서 GUS 유전자의 발현이 확인되었다.
Agrobacterium 과 공동배양시 적정량의 Acetosyringone 의 첨가는 Bolton 등(1986)과 Lee 등(1998)의 결과에서처럼 단자엽 식물인 참나리의 형질전환율에도 크게 영향을 미쳤다. 예비실험에서 가장 적절한 Acetosyringone의 농도는 40 mg/L 인 것으로 나타났으며, 특히 Acetosyringone을 전혀 첨가하지 않았을 경우에는 형질전환이 전혀 일어나지 않았다. 또한, Agrobacterium과 공동배양하지 않은 캘러스의 경우 kana- mycin70mg/L이 포함된 배지에서 서서히 갈변되며 죽었다.
이상의 결과를 통해 참나리캘러스를 이용한 형질전환 시particle bombardment 처리 후 Agrobacterhmi을 감염시키는 방법이 Agrobacterium만 감염시키는 방법보다 형질전환 효율 이 더 높은 것으로 나타났다(Table 2).
참고문헌 (14)
Birnboim HC, Doli J (1979) A rapid alk aline procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nudeic Acids Res 7:1513-1523
Fulton TM, Chunwongse J, Tanksley SD (1995) Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous plants. PlantMol Biol Rep 13: 207-209
Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro (1994) Effcient transformation of rice (Oryza satiua L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J 6: 271 -282
Jefferson RA, Kavanaugh TA, Bevan MW (1987) GUS fusions: $\beta$ - glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker for higher plants. EMBO J 6: 3901-3907
Lee HY, Lee CH, Kim HI, Han WD, Choi JE, Kim JH, Lim YP (1998) Development of bialaphos-resistant transgenic rice using Agrobacterium tumefaciens. Korean J Plant Tiss Cult 25: 283-288
Lucas O, Kallerhoff J, Alibert G (2000) Production of stable transgenic sunflowers (HeIianthus annuus L.) from wounded immature embryos by particle bombardment and co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens. Mol Breeding 6:479-487
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