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문제 정의
- 본 연구는 유전자 변형 감자의 screening에 이용할 수 있는 internal control로서 감자 특이 적 인 control DNA를 탐색 하고, 이를 이용한 새로운 이중 PCR 방법을 개발하기 위해 수행되었다.
- 본연구에서는 유전자변형 감자를 검정하기 위한 새로운 기술로서 감자특이 internal control과 CaMV 35S 프로모터 혹은 NOS 터미네이터에 특이적인 프라이머를 이용한 경쟁적 이중 PCR 방법을 개발하였다. 감자 유전자의 RAPD 결과 이용한 모든 품종에서 약 530 bp인 homozygous DNA 밴드를 증폭하는 특이 primer (rAGU4A)를 찾아 감자특이 internal control증폭용으로 이용하였다.
제안 방법
- PCR 반응은 최종부피 20//L로 맞춘 반응액에 1.0 unit Tag polymerase, 1.5 mM MgCl2, 0.25 mM dNTPs, 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 40 mM KC1, 100 pinole primer 및 200 ng 의 감자DNA가 포함된 반응액으로 수행하였다 증폭반응은 PerkinElmer Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer, US A) 를 이용하였다.감자특이 DNA 밴드를 증폭할 수 있는 primer를 고안하기 위한 random primers는 URP primer를 이용하였다 (Korean Patent No.
- NOS 터미네이터 증폭용 primer는 Spoth와 Strauss (1999)가 이용한 것으로 sense, 5'-GAAT CCTGTTGCCGGTCTTG-3'; anti-sense, 5'-TTATCCTAG TTTGCGCGCTA-3'을 이용하였다. PCR 반응의 internal control 밴드 증폭을 위 한 primer는 arbitrary primed (AP)-PCR 을 이용해서 고안하였다. AP-PCR용 primer를 합성하기 위한기본 primer는 SRILS UniPrimer Kit I (Seoulin Scientific, Korea)에 포함된 URP primer들을 이용하였다.
- Table 1. Potato varieties and vectors for transformation used in this study.
- 감자 특이적 DNA band를 이용하였다. URP primer (Kang eml.2002)를 이용해 감자의 품종구분을 위한 AP-PCR 산물 중 URP4 (5'-AGGACTCGATAACAGGCTCC-3')를 이용한PCR 산물의 전기영동 결과 재료로 이용한 12품종 모두에서 homozygous한 여러 DNA 밴드를 확인하였다 (Figure 1). 이 밴드들 중에 약 530bp 크기의 target DNA 밴드를 특이적으로 증폭할 수 있는 primer.
- 본연구에서는 유전자변형 감자를 검정하기 위한 새로운 기술로서 감자특이 internal control과 CaMV 35S 프로모터 혹은 NOS 터미네이터에 특이적인 프라이머를 이용한 경쟁적 이중 PCR 방법을 개발하였다. 감자 유전자의 RAPD 결과 이용한 모든 품종에서 약 530 bp인 homozygous DNA 밴드를 증폭하는 특이 primer (rAGU4A)를 찾아 감자특이 internal control증폭용으로 이용하였다. 이 프라이머에 의해 증폭되는 DNA 는 TC 염기의 반복 빈도가 높은 repetitive 혹은 microsatellite DNA (AF541972)로 판단되었다.
- 감자의 DNA 에 특이 적 인 PCR control 증폭용 primer를 탐색하기 위해 AP-PCR을 이용한 RAPD 분석과정에서 증폭되는 감자 특이적 DNA band를 이용하였다. URP primer (Kang eml.
- AP-PCR용 primer를 합성하기 위한기본 primer는 SRILS UniPrimer Kit I (Seoulin Scientific, Korea)에 포함된 URP primer들을 이용하였다. 감자의 품종 구분용으로 이용할 수 있는 UI^P primer를 선발하는 과정에서 실험에 사용한 모든 품종의 감자에서 동일한 크기의 증폭 산물을 생성하는 primer를 확인하여 3'쪽에 특이적 염기서열을 부가하는 방법으로 합성하였다. 또한 유전자 변형 감자의 PCR 판별에 이용할 수 있는 특이 primer들과 Tm 값을 맞추고 primer들 간의 중합체 형성 및 hairpin 구조를 이룰 수 있는 가능성을 줄이기 위해 특이성에 영향을 주지 않는 범위에서 5'쪽 염기를 제거하는 방법으로 primer를 합성하였다.
- 감자잎으로부터 total DNA 분리는 Teresa 등 (1995)이 이용한 방법을 다소 변형하여 수행하였다. 어린 감자 잎으로부터0.
- 2001). 따라서 합성된 primer에서 특이성에 영향을 적게 주면서 hairpin 구조나 중합체 형성 가능성을 줄이기 위해 5' 말단의 염기 adenine과 guanine을 제거한 primer (rAGU4A)를 (5'-GACTCGATAACAGGC TCCA-3') 합성하였다. 이 후 유전자 변형 감자 DNA를 이용한 경쟁적 이중 PCR을 수행한 결과 CaMV 35S 프로모터 혹은 NOS 터미네이터에 특이적인 primer들과 서로 독립적으로 목표 DNA가 증폭되는 것을 확인하였다 (Figure 3).
- 감자의 품종 구분용으로 이용할 수 있는 UI^P primer를 선발하는 과정에서 실험에 사용한 모든 품종의 감자에서 동일한 크기의 증폭 산물을 생성하는 primer를 확인하여 3'쪽에 특이적 염기서열을 부가하는 방법으로 합성하였다. 또한 유전자 변형 감자의 PCR 판별에 이용할 수 있는 특이 primer들과 Tm 값을 맞추고 primer들 간의 중합체 형성 및 hairpin 구조를 이룰 수 있는 가능성을 줄이기 위해 특이성에 영향을 주지 않는 범위에서 5'쪽 염기를 제거하는 방법으로 primer를 합성하였다.
- 이들 품종에서의 internal control DNA 의 증폭 여부를 확인하기 위해 각각의 품종에서 분리한 DNA를 이용하여 PCR을 수행해 본 결과 동일한 크기 의 DNA 밴드를 확인할 수 있었는데 (Figure 4), 동일한 양의 DNA를 이용한 PCR 결과에서 유전자 전환 여부와 상관없이 거의 같은 량의 DNA가 증폭된다는 사실은 해당 밴드가 internal control로 이용하기 충분한 것임을 의미한다. 또한 이중 PCR을 이용한 기존의 GMO 콩과 옥수수 검정기술(Hiibner et al. 1999; Wurz et al. 1999)에는 GMO 특이 DNA 증폭용 primer 한 쌍과 해 당 작물의 internal control DNA 증폭을 위한 한 쌍의 primer 등 4개의 primer를 이용했던 반면, 본 연구에서는 한 쌍의 GMO 특이 primer와 한 종의 감자특이 primer를 이용하였다. Internal control용 primer로 한 종의 primer만을 사용할 경우 비특이적인 DNA 밴드가 증폭될 가능성이 줄어들 뿐만 아니라 실험에 소요되는 비용을 줄일 수 있는 장점도 있다.
- 이 밴드들 중에 약 530bp 크기의 target DNA 밴드를 특이적으로 증폭할 수 있는 primer.를 합성하기 위해 최초 이용한 primer의 3' 말단에 adenine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine(T) 이 각각 첨가된 primer들을 합성하여 다양한 품종의 감자 DNA를 이용해 AP-PCR을 수행하였다 (Figure 2). 이 중 adenine (Figure 2B)과 cytosine (Figure 2D) 이 첨가된 primer를 이용했을 경우 크기가 서로 다른 특이적 DNA 밴드가 증폭되었으나 이 후 유전자 전환된 감자들을 이용한 PCR 결과 cytosine이 부가된 경우 일정범위의 annealing 온도구배 (53~58℃)에서 PCR 산물의 재현성이 낮아지는 것을 확인하였다.
- PCR 증폭을 위 한 조건은 94℃로 5분간 전변성을 시킨 후 94C로 20초 (denaturation), 54"C로 40초 (annealing), 72℃로 1분 (extension)의 조건으로 45회 증폭시켰다. 최종 증폭 후 72℃ 로 7분간 반응하여 증폭을 종료하고 1.5% (w/v) 아가로스 겔 상에서 5.0V/cm로 40분간 전기영동하여 EtBr 염색 후 UV trans-illuminator로 관찰하고 촬영하였다
- 또한 분석된 염기서열은 TC 염기서열의 빈도가 높은 repetitive sequence를 포함하는 intron 혹은 microsatellite 부위에 해당하는 것으로 판단되었다. 합성한 primer가 감자 DNA에 특이적인 밴드를 생성하는지를 확인하기 위해 감자 이외에 옥수수, 콩, 배추, 고추, 벼, 담배, 토마토 등 국내에서 형질전환 연구재료로 사용 빈도가 높은 작물들과 우리나라의 밭 잡초 중 감자와 동일속(屬)인 까마중 (Sokmum nigrum)에서 추출한 DNA를 이용하여 AP-PCR을 수행하여 사용한 primer의 감자특이성 여부를 확인하였다. 이용한 모든 종의 DNA에서 서로 다른 크기로 증폭되는 amplicon을 확인할 수 있었으며, 특히 배추와 벼의 경우 감자의 경우와 유사한 약 530 bp 크기의 minor band 를 확인할 수 있었다 (Figure 3).
대상 데이터
- PCR 반응의 internal control 밴드 증폭을 위 한 primer는 arbitrary primed (AP)-PCR 을 이용해서 고안하였다. AP-PCR용 primer를 합성하기 위한기본 primer는 SRILS UniPrimer Kit I (Seoulin Scientific, Korea)에 포함된 URP primer들을 이용하였다. 감자의 품종 구분용으로 이용할 수 있는 UI^P primer를 선발하는 과정에서 실험에 사용한 모든 품종의 감자에서 동일한 크기의 증폭 산물을 생성하는 primer를 확인하여 3'쪽에 특이적 염기서열을 부가하는 방법으로 합성하였다.
- 3), 40 mM KC1, 100 pinole primer 및 200 ng 의 감자DNA가 포함된 반응액으로 수행하였다 증폭반응은 PerkinElmer Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer, US A) 를 이용하였다.감자특이 DNA 밴드를 증폭할 수 있는 primer를 고안하기 위한 random primers는 URP primer를 이용하였다 (Korean Patent No. 97-016981, Seolin, Seoul, Korea). PCR 증폭을 위 한 조건은 94℃로 5분간 전변성을 시킨 후 94C로 20초 (denaturation), 54"C로 40초 (annealing), 72℃로 1분 (extension)의 조건으로 45회 증폭시켰다.
- 4계통의 감자를 이용하였다 (Table 1). 또한 유전자 전환되지 않은 감자 품종들은 농촌진흥청 고령지농업시험장에서 유전자원으로 유지중인 품종들을 이용하였다. 모든 재료는 온실 내에서 생육중인 감자의 어린잎을 재료로 이용하였다.
- 또한 유전자 전환되지 않은 감자 품종들은 농촌진흥청 고령지농업시험장에서 유전자원으로 유지중인 품종들을 이용하였다. 모든 재료는 온실 내에서 생육중인 감자의 어린잎을 재료로 이용하였다.
- 분석을 위해 이용한 유전자 전환 감자는 서로 다른 유전자를 이용해 농촌진흥청 고령지농업시험장에서 개발되어 있는 3품종 4계통의 감자를 이용하였다 (Table 1). 또한 유전자 전환되지 않은 감자 품종들은 농촌진흥청 고령지농업시험장에서 유전자원으로 유지중인 품종들을 이용하였다.
이론/모형
- 이용했다. NOS 터미네이터 증폭용 primer는 Spoth와 Strauss (1999)가 이용한 것으로 sense, 5'-GAAT CCTGTTGCCGGTCTTG-3'; anti-sense, 5'-TTATCCTAG TTTGCGCGCTA-3'을 이용하였다. PCR 반응의 internal control 밴드 증폭을 위 한 primer는 arbitrary primed (AP)-PCR 을 이용해서 고안하였다.
- 경쟁적 이중 PCR을 통한 유전자변형 감자의 검정에 이용한 PCR primer로 CaMV 35S 프로모터 특이밴드 증폭용으로는 Lipp 등 (1999)이 제안한 sequence 인 sense, 5'-GCTCCT ACAAATGCCATCA-3'; anti-sense, 5'-GATAGTGGGATTG TGCGTCA-3'를 이용했다. NOS 터미네이터 증폭용 primer는 Spoth와 Strauss (1999)가 이용한 것으로 sense, 5'-GAAT CCTGTTGCCGGTCTTG-3'; anti-sense, 5'-TTATCCTAG TTTGCGCGCTA-3'을 이용하였다.
- 고유의 유전자에 특이적 primer를 찾기 곤란할 경우 효율적인 방법으로 이용할 수 있을 것으로 판단된다. 본 연구에서는 벼의 repetitive DNA 부위에서 고안되어 다양한 생물체의 유전적 다형성 확인에 이용하는 URP primer (Kang et al. 2002)를 최초 arbitrary primer (AP)로 이용하였다. 이들 primer 는 AP-PCR을 통한 작물 고유의 DNA sequence를 찾는 데보다 유리할 것으로 판단되는데, 이는 20 mer 길이의 URP primer가 갖는 높은 annealing 온도와 결과의 재현성이 일반적 RAPD용 primer들 보다 높기 때문이다.
성능/효과
- Internal control DNA 증폭을 위해 제작된 single primer를 이용하여 증폭된 DNA 밴드의 염기서열 (KS108446, AF541972)은 BLAST를 이용한 검색결과 유사성이 높은 sequence를 가진 유전자가 검색되지 않았다. 또한 분석된 염기서열은 TC 염기서열의 빈도가 높은 repetitive sequence를 포함하는 intron 혹은 microsatellite 부위에 해당하는 것으로 판단되었다.
- 이 중 adenine (Figure 2B)과 cytosine (Figure 2D) 이 첨가된 primer를 이용했을 경우 크기가 서로 다른 특이적 DNA 밴드가 증폭되었으나 이 후 유전자 전환된 감자들을 이용한 PCR 결과 cytosine이 부가된 경우 일정범위의 annealing 온도구배 (53~58℃)에서 PCR 산물의 재현성이 낮아지는 것을 확인하였다. 그러나 adenine이 부가된 primer의 경우 동일한 annealing 온도구배에서 수행한 PCR 결과가 비교적 높은 재현성을 갖는 것을 확인하였다. 이 primer를 이용할 경우 한 종의 primer만을 이용해도 감자 특이적인 DNA를 증폭할 수 있었는데, 이러한 점은 여러 종류의 primer들을 이용해야 하는 경쟁적 PCR 수행과정에 primer 들간의 중합체 형성이나 비특이적 증폭산물의 생성 가능성을 낮줄 수 있을 것으로 판단되었다.
- 가진 유전자가 검색되지 않았다. 또한 분석된 염기서열은 TC 염기서열의 빈도가 높은 repetitive sequence를 포함하는 intron 혹은 microsatellite 부위에 해당하는 것으로 판단되었다. 합성한 primer가 감자 DNA에 특이적인 밴드를 생성하는지를 확인하기 위해 감자 이외에 옥수수, 콩, 배추, 고추, 벼, 담배, 토마토 등 국내에서 형질전환 연구재료로 사용 빈도가 높은 작물들과 우리나라의 밭 잡초 중 감자와 동일속(屬)인 까마중 (Sokmum nigrum)에서 추출한 DNA를 이용하여 AP-PCR을 수행하여 사용한 primer의 감자특이성 여부를 확인하였다.
- 이 primer를 이용할 경우 한 종의 primer만을 이용해도 감자 특이적인 DNA를 증폭할 수 있었는데, 이러한 점은 여러 종류의 primer들을 이용해야 하는 경쟁적 PCR 수행과정에 primer 들간의 중합체 형성이나 비특이적 증폭산물의 생성 가능성을 낮줄 수 있을 것으로 판단되었다. 이 primer가 현재 상품화된 대부분의 형질전환 감자 품종들에 포함된 유전인자인 CaMV 35S promoter와 NOS 터미네이터를 증폭하기 위한 primer들과 동일한 조건에서 독립적으로 해당 DNA 산물을 증폭하는지를 확인하기 위해 이중 PCR을 수행해 보았으나 primer들 간의 상호 간섭 효과로 의심되는 결과를 얻었다 (결과 미제시). 이러한 현상은 합성된 primer의 hairpin 구조형성이나 중합체 형성을 통해 나타나는 것으로 판단되었다.
- 그러나 adenine이 부가된 primer의 경우 동일한 annealing 온도구배에서 수행한 PCR 결과가 비교적 높은 재현성을 갖는 것을 확인하였다. 이 primer를 이용할 경우 한 종의 primer만을 이용해도 감자 특이적인 DNA를 증폭할 수 있었는데, 이러한 점은 여러 종류의 primer들을 이용해야 하는 경쟁적 PCR 수행과정에 primer 들간의 중합체 형성이나 비특이적 증폭산물의 생성 가능성을 낮줄 수 있을 것으로 판단되었다. 이 primer가 현재 상품화된 대부분의 형질전환 감자 품종들에 포함된 유전인자인 CaMV 35S promoter와 NOS 터미네이터를 증폭하기 위한 primer들과 동일한 조건에서 독립적으로 해당 DNA 산물을 증폭하는지를 확인하기 위해 이중 PCR을 수행해 보았으나 primer들 간의 상호 간섭 효과로 의심되는 결과를 얻었다 (결과 미제시).
- 를 합성하기 위해 최초 이용한 primer의 3' 말단에 adenine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine(T) 이 각각 첨가된 primer들을 합성하여 다양한 품종의 감자 DNA를 이용해 AP-PCR을 수행하였다 (Figure 2). 이 중 adenine (Figure 2B)과 cytosine (Figure 2D) 이 첨가된 primer를 이용했을 경우 크기가 서로 다른 특이적 DNA 밴드가 증폭되었으나 이 후 유전자 전환된 감자들을 이용한 PCR 결과 cytosine이 부가된 경우 일정범위의 annealing 온도구배 (53~58℃)에서 PCR 산물의 재현성이 낮아지는 것을 확인하였다. 그러나 adenine이 부가된 primer의 경우 동일한 annealing 온도구배에서 수행한 PCR 결과가 비교적 높은 재현성을 갖는 것을 확인하였다.
- 따라서 합성된 primer에서 특이성에 영향을 적게 주면서 hairpin 구조나 중합체 형성 가능성을 줄이기 위해 5' 말단의 염기 adenine과 guanine을 제거한 primer (rAGU4A)를 (5'-GACTCGATAACAGGC TCCA-3') 합성하였다. 이 후 유전자 변형 감자 DNA를 이용한 경쟁적 이중 PCR을 수행한 결과 CaMV 35S 프로모터 혹은 NOS 터미네이터에 특이적인 primer들과 서로 독립적으로 목표 DNA가 증폭되는 것을 확인하였다 (Figure 3).
- 현재 상품화되어 있는 NewLeaf 품종들은 Superior' 'Atlantic', Shepody' 및 RussetBurbank' 등의 품종을 이용한 것이다. 이들 품종에서의 internal control DNA 의 증폭 여부를 확인하기 위해 각각의 품종에서 분리한 DNA를 이용하여 PCR을 수행해 본 결과 동일한 크기 의 DNA 밴드를 확인할 수 있었는데 (Figure 4), 동일한 양의 DNA를 이용한 PCR 결과에서 유전자 전환 여부와 상관없이 거의 같은 량의 DNA가 증폭된다는 사실은 해당 밴드가 internal control로 이용하기 충분한 것임을 의미한다. 또한 이중 PCR을 이용한 기존의 GMO 콩과 옥수수 검정기술(Hiibner et al.
- 합성한 primer가 감자 DNA에 특이적인 밴드를 생성하는지를 확인하기 위해 감자 이외에 옥수수, 콩, 배추, 고추, 벼, 담배, 토마토 등 국내에서 형질전환 연구재료로 사용 빈도가 높은 작물들과 우리나라의 밭 잡초 중 감자와 동일속(屬)인 까마중 (Sokmum nigrum)에서 추출한 DNA를 이용하여 AP-PCR을 수행하여 사용한 primer의 감자특이성 여부를 확인하였다. 이용한 모든 종의 DNA에서 서로 다른 크기로 증폭되는 amplicon을 확인할 수 있었으며, 특히 배추와 벼의 경우 감자의 경우와 유사한 약 530 bp 크기의 minor band 를 확인할 수 있었다 (Figure 3). 그러나 이러한 DNA 증폭 산물을 해당 작물에 특이적인 주요 band로 구분하기는 곤란한 것으로 판단되었다.
- 형질전환된 감자와 형질전환에 이용한 것과 같은 품종의 감자 잎에서 분리한 DNA를 주형으로 합성된 primer와 CaMV 35S 프로모터 혹은 NOS 터미네이터 특이 primer를 이용해 경쟁적 이중 PCR을 수행한 결과 GMO 특이 DNA와 internal control DNA가 각각 독립적으로 증폭되었음을 확인할 수 있었다 (Figure 4). CaMV 35S 프로모터와 NOS 터미네이터는 New Leaf 품종의 개발에 이용된 형질전환용 운반체들에 공통적으로 포함된 genetic factor들이므로 본 실험과 동일한 방법으로 New Leaf 품종 등의 GMO 여부 판별에 적용이 가능할 것으로 판단된다.
후속연구
- 수 있었다 (Figure 4). CaMV 35S 프로모터와 NOS 터미네이터는 New Leaf 품종의 개발에 이용된 형질전환용 운반체들에 공통적으로 포함된 genetic factor들이므로 본 실험과 동일한 방법으로 New Leaf 품종 등의 GMO 여부 판별에 적용이 가능할 것으로 판단된다. 현재 상품화되어 있는 NewLeaf 품종들은 Superior' 'Atlantic', Shepody' 및 RussetBurbank' 등의 품종을 이용한 것이다.
- Internal control용 primer로 한 종의 primer만을 사용할 경우 비특이적인 DNA 밴드가 증폭될 가능성이 줄어들 뿐만 아니라 실험에 소요되는 비용을 줄일 수 있는 장점도 있다. 따라서 이 기술은 감자의 GMO 여부 판별에 보다 경제적이고 효율적인 방법으로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 최근 유전자 변형 농산물의 유해성 여부와는 별도로 유통과정에 유전자 변형 여부를 상품에 표기하고 소비자로 하여금 구매 여부를 판단하게 하는 단계에 이르게 되었다. 또한 2000 년 생명공학안전성의정서 (Biosafety Protocol)7)- 채택되어 조만간 발효될 것으로 전망되고 있어 유전자 변형 감자의 검정기술은 향후 농산물 교역과정에도 필요한 기술로 개발될 필요가 있다. 특히 EU, 일본, 호주 등의 경우 GM0 여부 표시를 의무화하고 있으며 (Grunst and Kephart 2001), 2002년도부터우리나라에서도 감자를 포함한 주요작물들의 유전자 변형 농산물 표시제를 시행하고 있다.
- 본 연구 결과는 특정 작물의 GM0 여부 판별을 위해 수행되는 경쟁적 이중 PCR에 필요한 internal control DNA로 작물 고유의 유전자에 특이적 primer를 찾기 곤란할 경우 효율적인 방법으로 이용할 수 있을 것으로 판단된다. 본 연구에서는 벼의 repetitive DNA 부위에서 고안되어 다양한 생물체의 유전적 다형성 확인에 이용하는 URP primer (Kang et al.
- 이와 같은 단일 프라이머 internal control 증폭용으로 이용한 경쟁적 이중 PCR은 비특이적 PCR 산물을 줄일 수 있고, 기존 방법들에 비해 경제적이다. 현재 상품화되어 있는 유전자 변형 감자품종인 'New Leaf 의 경우도 형질전환에 이용한 유전인자로 CaMV 35S 프로모터와 NOS터미네이터가 모두 이용되었으므로 이 기술을 이용할 경우 현재까지 상품화된 유전자 변형감자들의 효율적인 검정 기술로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
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