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문제 정의
- 제주의 토종견으로 제주견의 조상과 기원에 대하여 많은 관심을 보이고 있으나 과학적으로 비교분석한 결과는 찾아보기 어렵다. 이에 본 연구는 모계조상 추적과 품종들간에 유전적인 유연관계에 대한 연구에 흔히 이용되고 있는 mtDNA D-loop의 염기서열을 이용하여 제주견과 다른 품종들과의 관계를 추정하고자 한다.
제안 방법
- PCR 반응산물의 클로닝과 염기서열 분석은 Bresa-Clean DNA purification kit (GeneWorks Pty LTD, Adelade, South Australia)와 TOPO TA Cloning kit(Invitrogen, San Diego, CA, USA)를 이용하였으며, 염기서열은 ABI PRISMTM Dye Terminater Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Cetus, Emeryville, CA, USA)로 분석하였다.
- PCR 반응은 500 ng 주형 DNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 0.5 mM MgCl2, 각각의 시발체 0.2 μM, 각 dNTP 100 μM, Taq polymerase 1 단위를 첨가하여 총 50 μl를 반응액으로 하여 94℃에서 4분간 변성(denaturation) 처리 후, 결합(annealing)－확장(extension)－변성의 과정을 54℃－72℃－92℃에서 각각 1분－2분－1분으로 하여 30회 반복으로 반응시킨 후 최종 72℃에서 10분간 확장 처리 후 반응을 종료하였다.
- mtDNA D-loop 970 bp의 염기서열을 이용하여 제주견과 우리나라의 토종견인 진도견, 풍산견, 삽살견과의 관계와 외국 품종들과의 유연관계를 분석하였다. 또한 초가변영역인 598 bp의 D-loop 부위가 보고된 염기서열들은 추가로 GenBank에서 수집하여 전체 30개의 품종으로부터 214종의 단상형들을 이용하여 AMOVA 분석을 하였다.
- 또한 제주견이 집단으로써 균일도와 타품종들과의 집단유전학적 관계는 GenBank에 보고된 D-loop 가운데 D-loop 가운데 초가변 영역의 598 bp(U96639의 D-loop 15,458-16,055 부위)를 만족하는 염기서열을 추가하여 분석에 이용하였다. 본 연구에서 얻어진 염기서열 26종(개의 단상형 24개, wolf 2개, coyote 2개)을 포함하여 총 30종의 품종에서 214개의 단상형을 기본자료로 Arlequin 3.
- 수집한 혈액에서 Miller 등(1988)의 방법을 변형하여 DNA를 추출하였으며, D-loop의 염기서열에 대한 PCR(PTC-100TM , MJ Research Inc, Watertown, MA, USA)은 시발체를 제작하고 이용하였다. 제작된 L-strand의 시발체는 5'-GAA GAA GCT CTT GCT CCA CC-3'(시발체 부착위치, 유전자은행 등록번호 U96639의 개 mtDNA 염기서열 위치 15,397-15,416) 이었고, H-strand 는, 5'-GTC GTG CGA CTC ATC TTG GC-3'(시발체 부착위치, 40-59)이었다.
- 염기서열의 확인은 Applied Biosystems 377 DNA sequencer와 SeqEd software(Perkin-Elmer, Applied Biosystems)를 이용하여 클론에 삽입된 D-loop 부위를 양방향으로 두 개의 범용 벡터 시발체와 2개의 내부시발체(L2-5'-ACT GTG GTG TCA TGC ATC TG-3’, 시발체 부착위치 15895-15914; H2-5'-GTT AGA GTT AGT GCC GTT GC-3’, 시발체 부착위치 15964-15983, 유전자은행 염기등록 번호 U96639)를 이용하여 정－역방향의 염기서열이 중첩되도록 하여 염기서열을 확인하였다.
대상 데이터
- 국내 재래집단으로는 전남대학교 수의과대학 연구실로부터 진도견(15두), 경북대학교 유전공학연구실로부터 삽사리(10두), 사육농가로부터 풍산견(5두)에 대한 혈액과 DNA 시료를 수집했으며, 또한 국내에 사육되고 있는 외래품종인 이스트라이카 종(3두)과 웨스트라이카(5두)종의 혈액을 수집하여 이용되었다. 개의 조상으로 알려진 북아메리카 회색늑대(Canis lupus)와 외집단(outgroup)의 분류군으로 코요테(Canis latrans)에 대한 DNA를 추가로 확보하여 분석에 이용하였다.
- 본 연구에는 이용된 제주견 집단은 제주도 축산진흥원에서 관리되고 있는 집단에서 모계가 서로 다른 개체 6두, 제주견협회에서 관리되고 있는 집단에서 서로 다른 모계의 18두로부터 채혈을 한 후 이용되었다. 국내 재래집단으로는 전남대학교 수의과대학 연구실로부터 진도견(15두), 경북대학교 유전공학연구실로부터 삽사리(10두), 사육농가로부터 풍산견(5두)에 대한 혈액과 DNA 시료를 수집했으며, 또한 국내에 사육되고 있는 외래품종인 이스트라이카 종(3두)과 웨스트라이카(5두)종의 혈액을 수집하여 이용되었다. 개의 조상으로 알려진 북아메리카 회색늑대(Canis lupus)와 외집단(outgroup)의 분류군으로 코요테(Canis latrans)에 대한 DNA를 추가로 확보하여 분석에 이용하였다.
- 본 연구에는 이용된 제주견 집단은 제주도 축산진흥원에서 관리되고 있는 집단에서 모계가 서로 다른 개체 6두, 제주견협회에서 관리되고 있는 집단에서 서로 다른 모계의 18두로부터 채혈을 한 후 이용되었다. 국내 재래집단으로는 전남대학교 수의과대학 연구실로부터 진도견(15두), 경북대학교 유전공학연구실로부터 삽사리(10두), 사육농가로부터 풍산견(5두)에 대한 혈액과 DNA 시료를 수집했으며, 또한 국내에 사육되고 있는 외래품종인 이스트라이카 종(3두)과 웨스트라이카(5두)종의 혈액을 수집하여 이용되었다.
- 제작된 L-strand의 시발체는 5'-GAA GAA GCT CTT GCT CCA CC-3'(시발체 부착위치, 유전자은행 등록번호 U96639의 개 mtDNA 염기서열 위치 15,397-15,416) 이었고, H-strand 는, 5'-GTC GTG CGA CTC ATC TTG GC-3'(시발체 부착위치, 40-59)이었다.
데이터처리
- mtDNA D-loop 970 bp의 염기서열을 이용하여 제주견과 우리나라의 토종견인 진도견, 풍산견, 삽살견과의 관계와 외국 품종들과의 유연관계를 분석하였다. 또한 초가변영역인 598 bp의 D-loop 부위가 보고된 염기서열들은 추가로 GenBank에서 수집하여 전체 30개의 품종으로부터 214종의 단상형들을 이용하여 AMOVA 분석을 하였다.
- 또한 제주견이 집단으로써 균일도와 타품종들과의 집단유전학적 관계는 GenBank에 보고된 D-loop 가운데 D-loop 가운데 초가변 영역의 598 bp(U96639의 D-loop 15,458-16,055 부위)를 만족하는 염기서열을 추가하여 분석에 이용하였다. 본 연구에서 얻어진 염기서열 26종(개의 단상형 24개, wolf 2개, coyote 2개)을 포함하여 총 30종의 품종에서 214개의 단상형을 기본자료로 Arlequin 3.11 (Excoffier 등, 2005) 소프트웨어를 이용하여 집단간 Analysis of Molecular Variance (AMOVA) 분석으로 이질성, 유전적 거리, 유연관계를 분석하였다. 자료의 내용은 Table 1-1, 1-2, 1-3과 같다.
이론/모형
- , 2001)를 이용하였고, 코요테를 외집단으로 하여 neighbor-joining method(Saitou와 Nei, 1987)와 Tamura-Nei distance (Tamura 와 Nei, 1993)로 계통수 분석을 하였다. 계통수에서 각 교점의 통계적 신뢰도는 1,000 random bootstrap resampling 방법으로 추정하였다.
- D-loop 970 bp (이질적인 반복염기서열부위 제외, ‘TAC ACG TA (or G)CG’)의 염기서열을 확인한 결과 제주견에서 5종류, 진도견 4종류, 삽사리 4종류, 풍산견 5종류, 이스트라이카와 웨스트라이카(Canis familiaris) 각각 2종류, 회색늑대(Canis lupus) 2종류, 코요테(Canis latrans) 2종류의 단상형(haplotype)을 얻었다. 이들 염기서열은 GenBank에 보고된 개의 D-loop 38종류의 단상형들과 함께 GeneDoc version2.6 (Nicholas 등, 1997)을 이용하여 염기서열을 비교하였다. 새롭게 얻어진 mtDNA D-loop 단상형(haplotye)의 염기서열들은 NCBI GenBank (유전자은행 등록번호, AY172674-81, AY177644-61, AY172676-77) 에 수록하였다.
- 품종들간에 유연관계 분석은 MEGA 4(Kumar 등., 2001)를 이용하였고, 코요테를 외집단으로 하여 neighbor-joining method(Saitou와 Nei, 1987)와 Tamura-Nei distance (Tamura 와 Nei, 1993)로 계통수 분석을 하였다. 계통수에서 각 교점의 통계적 신뢰도는 1,000 random bootstrap resampling 방법으로 추정하였다.
성능/효과
- D-loop 970 bp (이질적인 반복염기서열부위 제외, ‘TAC ACG TA (or G)CG’)의 염기서열을 확인한 결과 제주견에서 5종류, 진도견 4종류, 삽사리 4종류, 풍산견 5종류, 이스트라이카와 웨스트라이카(Canis familiaris) 각각 2종류, 회색늑대(Canis lupus) 2종류, 코요테(Canis latrans) 2종류의 단상형(haplotype)을 얻었다.
- D-loop 염기서열 가운데 초가변영역의 598 bp를 이용한 AMOVA 분석에 의하면 우리나라 토종견인 제주견, 진도견, 삽살견, 풍산견의 4품종의 전체의 염기서열의 변이 가운데 84.1%가 품종내의 변이였고, 15.9%가 품종간의 변이로 분석되었으며, 품종내 분산성분에 대한 유의성은 없었으나, 제주견, 진도견, 삽살견, 풍산견 품종간 분산성분에 대한 유의성(p<0.05)이 인정되고 있었다.
- 1. Nucleotide substitutions and gaps in mtDNA D-loop of five Cheju, four Jindo, four Sapsaree, five Pungsan, two of each East and West Laika dogs (Canis familiaris), two gray wolves (Canis lupus) and two coyotes (Canis latrans). Dots ( .
- mtDNA D-loop 970 bp의 염기서열 분석결과 제주견, 진도견, 삽사리, 풍산견, 라이카견종, 회색늑대, 코요테의 집합에서 총 96개(9.9%)의 다형성 부위가 관찰되었고, 코요테를 제외하면 5.9%의 다형성을 보이고 있었다(Fig. 1).
- 01)를 차지하고 있었다(Table 6). 개와 늑대 집단간 분산성분은 5.3으로 동일집단내의 품종간 분산성분 2.1보다도 2배 이상으로 뚜렷한 차이를 보이고 있었다.
- 개의 조상으로 받아들이고 있는 늑대집단과 가축화 된 개의 집단으로 구분한 분석에서는 전체변이 가운데 두 집단간 분산성분이 47.1%(p<0.01)로 높게 나타났고, 집단내 품종들 사이의 분산성분은 18.7%(p<0.01), 그리고 동일품종 내에 개체들간의 분산성분이 34.1%(p<0.01)를 차지하고 있었다(Table 6).
- 개의 조상으로 여기는 늑대와 오늘날 개의 집단과의 염기서열 분산성분 분석에서 개(1.63%)와 늑대(3.64%)의 집단내 변이보다는 개와 늑대 사이의 진단간 변이(4.51%)가 높게 나타난 것으로 나타났으며, 이 값을 근거로 하면 개와 늑대사이에 유전적 분기시기는 약 1~2백 만년 전인 것으로 추정되었다.
- 개의 집단과 늑대의 집단간 AMOVA 분석에서 집단간 변이(47.2%)가 집단내의 변이보다 크게 나타나고 있어서 공통조상으로부터 분리된 현재의 개와 늑대 사이에는 많은 진화의 과정이 있었음을 추측할 수 있겠으며, 개와 늑대의 두 종(Interspecies)간 사이에 변이성이 종내(Intraspecies)의 변이성(18.7%)의 2배 이상으로 나타난 것으로 볼 때 개와 늑대의 교류는 가능하지만 서로 독특한 각각의 집단으로 생물학적인 격리 상태가 유지되고 있는 것으로 생각되었다(Table 5).
- 결론적으로 제주견의 집단은 진도견, 풍산견, 삽살견과 마찬가지로 품종의 고유 염기서열의 특성을 구성하고 있지 못하며, 집단의 축소과정에서 자연적 또는 인위적인 선발에 의해 지금의 제주견의 체형과 외모가 보존되어 있는 것으로 사료되었다. 또한 제주견 염기서열의 유연관계에 의하면 단일계통의 분기점을 형성하지는 못했으나, 5 종류의 단상형(haplotype)에서 한 개는 진도견과 가까운 유연관계를 보였고, 한 개는 풍산견과, 그리고 3개는 삽살견과 가까운 유연관계를 보임으로 제주견의 집단의 모계조상도 우리나라 토종들의 모계조상과 교류도 있었던 것으로 사료되었다.
- 결론적으로 제주견의 집단은 진도견, 풍산견, 삽살견과 마찬가지로 품종의 고유 염기서열의 특성을 구성하고 있지 못하며, 집단의 축소과정에서 자연적 또는 인위적인 선발에 의해 지금의 제주견의 체형과 외모가 보존되어 있는 것으로 사료되었다. 또한 제주견 염기서열의 유연관계에 의하면 단일계통의 분기점을 형성하지는 못했으나, 5 종류의 단상형(haplotype)에서 한 개는 진도견과 가까운 유연관계를 보였고, 한 개는 풍산견과, 그리고 3개는 삽살견과 가까운 유연관계를 보임으로 제주견의 집단의 모계조상도 우리나라 토종들의 모계조상과 교류도 있었던 것으로 사료되었다.
- 본 연구에 의하면 우리나라의 토종 재래견인 제주견, 진도견, 삽살견, 풍산견의 mtDNA D-loop의 염기서열을 이용한 유연관계 분석에서는 어떠한 품종에서도 품종을 구분 할 수 있는 고유의 계통 분기를 형성하는 집단은 없는 것으로 나타나고 있다(Fig. 1). 집단 구성의 특성을 짐작케 하는 AMOVA 분석에서도 품종내의 염기서열의 변이(84.
- 염기서열 분석결과 제주견에서 5종류, 진도견 4종류, 삽사리 4종류, 풍산견 5종류, 이스트라이카와 웨스트라이카(Canis familiaris) 각 2종류, 회색늑대(Canis lupus) 2종류, 코요테(Canis latrans) 2종류의 단상형을 얻었다.
- 염기서열의 유연관계에 의하면 제주견은 삽살이와 상당이 가까운 개체들도 있으나, 풍산견이나 진도견과 유연관계를 보여주는 개체도 확인할 수 있었는데(Fig. 1), 이는 현존하는 제주견의 모계조상도 국내 재래종들의 모계조상과 상호 가까운 공통조상들에 기원을 두고 있다는 것을 의미한다.
- 우리나라 재래견집단(제주견, 진도견, 풍산견, 삽살이)과 이웃하고 있는 일본견집단(아끼다견, 호까이도견, 류꾸견), 중국－티벳견(쵸우쵸우견, 시츄견, 라자압소견) 집단, 북방－러시아견(하스키견, 라이카견, 에스키모견) 집단의 AMOVA 분석에서는 전체 분산성분 가운데 지리적 집단간 분산성분이 4.1%(p>0.05), 지리적 집단내에 품종간 분산성분이 13.4%(p<0.01), 품종내에 개체간 분산성분이 82.4%(p<0.01)에 달하고 있었다.
- 제주견에서는 삽살이, 진도견, 풍산견의 염기서열과 가까운 유연 관계를 보이는 단상형들이 산포되어 있는 것으로 확인되어 제주견 집단이 우리나라 재래종들과의 모계조상에 있어서 구분은 어려운 것으로 확인되었다.
- 그중 단일염기의 삽입/결실 변이가 15개 부위였으며, 82개 부위는 염기치환이 있었는데 그 중 6개는 교차형 염기전이 변이를 보이고 있었다. 제주견의 mtDNA D-loop 염기서열의 다형성에는 5종류의 단상형이 관찰되어 현존하는 제주견의 모계조상은 적어도 5종류 이상인 것으로 나타났다.
- 반면에 계통분기 B에는 일본견 12개, 진도견 2개, 웨스트라이카 2개, 시베리안 허스키, 도베르만, 2종류의 회색늑대가 소속되었다. 진도견의 2개의 단상형만 제외한다면 우리나라의 제주견, 진도견, 삽살견, 풍산견의 단상형들은 모두 계통분기 A에 소속되고 있음을 보여주었다. 제주견은 단상형 5개 가운데 1개(Cheju_3)는 진도견의 단상형(Jindo_J4)과 가까운 유연관계를 보여주고 있었고, 나머지 4개 가운데 1개(Cheju_1)은 풍산견(Pungsan_Pr4)과, 3개의 단상형(Cheju_2, Cheju_4, Cheju_5)은 삽살견(U96639)과 가까운 유연 관계를 보이고 있었다(Fig.
- 현존하는 개의 조상으로 알려진 늑대집단(인도늑대, 이란늑대, 히말라얀늑대, 몽고늑대, 북미 회색늑대)을 포함하여 pairwise distances를 이용한 아시안 품종들과의 유연관계에서 제주견은 회색늑대와 분리되면서 아래의 계통교점에는 일본의 규수견과 중국의 시츄견을 하위 계통교점을 지니고 있으며, 진도견은 인도늑대와 분리되면서 하위에 삽살견과 티벳으로부터 기원된 라자압소견 계통교점과 유연관계를 보이고 있다. 풍산견은 몽고늑대로부터 분리되면서 하위의 계통분기에서 일본의 호까이도견과 유연관계를 보여주고 있었다(Fig.
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