[논문]흰쥐에서 nitrone계 항산화제인 <tex>$\\alpha$</tex>-phenyl-n-tert-butyl nitrone(PBN)의 뇌 투과성 및 체내동태

이나영; 강영숙

[국내논문] 흰쥐에서 nitrone계 항산화제인 $\\alpha$-phenyl-n-tert-butyl nitrone(PBN)의 뇌 투과성 및 체내동태
The Blood-Brain Barrier Permeability and Pharmacokinetics of Nitrone Based Spin Trapping Agent, $\\alpha$-Phenyl-n-tert-Butyl Nitrone (PBN) in Rats 원문보기

약학회지 = Yakhak hoeji, v.46 no.2, 2002년, pp.124 - 128

Abstract ▼ AI-Helper

The nitrone-based free radical trapping reagent, $\alpha$-phenyl-n-tert-butyl nitrone (PBN) has been proposed as therapeutic agent for stroke. We used this for model drug of development of new drug for neuroprotection. The purpose of this study was to evaluate the blood-brain barrier (BBB) permeability of PBN in Sprague-Dawly (SD) rats. The BBB transport of PBN was investigated in SD rats using internal carotid artery perfusion (ICAP) method at a rate of 4 mι/min for 15 second. We also obtained pharmacokinetic parameters of PBN using single intravenous injection technique. When we estimated BBB permeability of PBN with ICAP method, the brain volume of distribution of PBN was 60.0 $\pm$ 12.0 $\mu\textrm{g}$/ι. The brain uptake of PBN after IV injection at 120 min was 0.15 $\pm$ 0.01%ID/g. The PBN was transported to the brain through the BBB well in rats, because PBN is small molecule (MW 177) and lipid-soluble (log P 1.23) compound.

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제안 방법

흰쥐를 희생하고 뇌를 꺼내어 실客게 사용하였다. 혈장 100 B에 PBN이 각각 1, 2, 5, 10 μg이 도도록 넣고 사iloroform 0.5 m屋 5분간 추출하였다. 추출액을 에서 800 g, 10분간 원심분리하여 유기층만을 취하고 freeze dryer에 적용하여 용매를 완전히 날린 후 acetonitrile 100 议에 녹여 그중 50 以를 HPLC에 적용하였다.
추출액을 에서 800 g, 10분간 원심분리하여 유기층만을 취하고 freeze dryer에 적용하여 용매를 완전히 날린 후 acetonitrile 100 议에 녹여 그중 50 以를 HPLC에 적용하였다. 뇌를 약 1 产) 되도로 취하고 생리 완충액 (PB, 10 mM HEPES, 141 mM NaCl, 4 iriM KC₁, 2.8 mM CaCl2, 1 mM MgSO₄, 1 mM NaH2PO4, 10 nM D-glucose, pH 7.4) 500 μ/를 넣고 균질화한 후 PBN°1 각각 1, 2, 5, 10, 20, 50 曲이 되도록 homogenate에 3넣고 chlcroform 3 mZ로 5분간 추출하였다. 4龙에서 800 g, 10분간원심분리하여 유기충 만을 취하고 freeze dryer에 적용하여 용매를 완전히 날린 후 acetonitrile 200 世에 녹여 pore size가 0.
4) 500 μ/를 넣고 균질화한 후 PBN°1 각각 1, 2, 5, 10, 20, 50 曲이 되도록 homogenate에 3넣고 chlcroform 3 mZ로 5분간 추출하였다. 4龙에서 800 g, 10분간원심분리하여 유기충 만을 취하고 freeze dryer에 적용하여 용매를 완전히 날린 후 acetonitrile 200 世에 녹여 pore size가 0.2 μsyringe filter (National Scientific Co.)를 사용하여 여과하고 二 중 100 B를 HPLC에 적용하였다.
25( t—300 g의 웅성 흰쥐에 ketamine (100 ㎎/㎏)과 xylazine (2 rry/kg)을 근육 주사하여 마취시키고 이미 보고된 논문의 방법다드 목부위를 절개하여 혈관들을 전기결찰하였다H 오른쪽 외경동댁이 PE-10관 (Natsume Co.)을 삽입하여 infusion pump에연결하였다. 수술하는 동안에는 thermal blanket을 이용하여 흰쥐으 체온을 37℃로 유지하였다.
수술하는 동안에는 thermal blanket을 이용하여 흰쥐으 체온을 37℃로 유지하였다. PBN 100 I丄g을 1% DMSO에녹。고 Kreb's-Henseleit buffer (KHB, pH 7.4:119 mM NaCL 4.7 mM KC₁, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM MgSQ, 1.2 mM KH2FO4, 25 mM NaHCO₃, 10 mM D-glucose, 10 以dl BSA) 를 갈 혼합하여 4 으로 주입함과 동시에 총경동맥을 결찰하였다. 주입후 정확히 1注가 되었을 때 즉시 단두하여 뇌를 적출중그 무게를 측정한 후 PB 500 p/를 넣고 균질화한 후 chloroform으로 5분간 추출하였다.
주입후 정확히 1注가 되었을 때 즉시 단두하여 뇌를 적출중그 무게를 측정한 후 PB 500 p/를 넣고 균질화한 후 chloroform으로 5분간 추출하였다. 추출액을 4℃에서 800 g, 10 분간 원심분리하여 유기층만을 취하고 freeze 询仪에 적용하여용매를 완전히 날린 후 acetonitrile 200 山에 녹여 pore size가 0.2 |im인 syringe filter(National Scientific Co.)를 사용하여 여과한 후 그중 100 B를 HPLC에 적용하였다.
PBN의 pharmacokinetic profile을 측정하기 위하여, 이미 보고된 논문의 방법 9)과 마찬가지로 ketamineb (100 m以kg)과 xylazine (2 ㎎/㎏)을 근육 주사하여 마취시킨 250~300 g 흰쥐의 대퇴동맥과 대퇴정맥에 PE-50관 (Natsume Co.)을 삽입하였다. PBN 0.
PBN 0.5 mg을 2% DMS。로 용해시키고 20% Polyethylene glycol 200과 Ringes Herpes buffer (RHB, 10 mM HEPES, 141 mM NaCl, 4 mM KC₁, pH 7.4)로 잘 혼합하여 1 mZ가 되도록 만들고 대퇴정맥을 통해 정확히 500 B가 되도록 투여하였다. 약액을 투여한 후 대퇴동맥에서 0.
4)로 잘 혼합하여 1 mZ가 되도록 만들고 대퇴정맥을 통해 정확히 500 B가 되도록 투여하였다. 약액을 투여한 후 대퇴동맥에서 0.25, 1, 2, 5, 15, 30, 60, 120분에 혈액을 취하고 120분에 단두하였다. 채취한 혈액을 원심분리하여 얻은 혈장을 chloroform으로 5분간 추출하고 4, C에서 800 g, 10분간 원심분리하여 유기층만을 취하고 freeze dryer 에 적용하여 용매를 완전히 날린 후 acetonitrile 100에 녹여 그 중 50 B를 HPLC에 적용하였다.
HPLC 분석은 Shimadzu LC-10AS gradient liquid chromatographic system을 사용하여 UV detects로 280 nm에서 즉정하였 匸}. Columne C₁₈ reverse phase column (CLC-ODS 5 |im, 4 mm 250 mm)을 사용하였다.
14) 실험 결과 PBNe morphine에 비해서는 2배가량 많은 양이, BBB에 수용체가 존재하는 NLA-OX26 와 유사한 정도로 뇌로 이행되는 것을 알 수 있었다. PBN을 정맥 투여하고 120분에서의 brain chromatogram 을 살펴보면(Fig. 2) 약 6분에서 대사체의 peak를 볼 수 있으며 본 실험에서는 intact 한 PBN peak인 4.3분대의 것만을 계산에 사용하였다.

대상 데이터

에서 구입하여 사용하였다. 생리식염수와 헤파린은 중외제약 제품을, 마취제로 사용한 염산 ketaminee 유한양행 제품을, 근이완제인 xylazinee Sigma에서 각각 구입하여 사용하였다.
Acetonitrilee HPLC용으로 덕산이화학(주)에서 구입하였다. 기타 시약은 일급 이상의 제품을 덕산이화학(주)에서 구입하여 사용하 였다.
기타 시약은 일급 이상의 제품을 덕산이화학(주)에서 구입하여 사용하 였다. 실험에 사용한 기기는 원심분리기 (한일 과학 산업 (주), Uninn 55R, Micro 17TR), Infusion/withdrawl pump(KD Scientific, model 210), thermal blanket (temperature control uni:, Letica, HB10 1/2), bipolar coagulator (Union Medical Co.
기타 시약은 일급 이상의 제품을 덕산이화학(주)에서 구입하여 사용하 였다. 실험에 사용한 기기는 원심분리기 (한일 과학 산업 (주), Uninn 55R, Micro 17TR), Infusion/withdrawl pump(KD Scientific, model 210), thermal blanket (temperature control uni:, Letica, HB10 1/2), bipolar coagulator (Union Medical Co., Suieitor UM 880-A), 단 두기 (대종 기기), pH meter (Mettler; deltx 340), balance (Sartorius, AC₂₁15), freeze dryer system (LABCONCO 7522900), 수술 기구 등이다. 한편 Sprague-Dawiey (SD) 계 웅성 흰쥐는 셈 타코에서 구입하여 일주일간 동물실게서 사육하여 사용하였다.
, Suieitor UM 880-A), 단 두기 (대종 기기), pH meter (Mettler; deltx 340), balance (Sartorius, AC₂₁15), freeze dryer system (LABCONCO 7522900), 수술 기구 등이다. 한편 Sprague-Dawiey (SD) 계 웅성 흰쥐는 셈 타코에서 구입하여 일주일간 동물실게서 사육하여 사용하였다.

이론/모형

그래서 본 연구에서는 뇌 신경 손상을 보호하는 물질의 개발을 위하여 우선 PBN을 모델 물질로 사용하여 PBN의 뇌 투과성을 내경동맥 관류법 (internal carotid artery perfusion method, ICAP 법)과 정맥투여법(汤 vivo intravenous injection technique)을 이용하여 실험하고 혈액 중의 약물량과 뇌 투과량을 high performance liquid chromatography(HPLC)법으로 정량하여 검토하였다.
Pharmacokinetic parametei는 각 peak 넓이를 농도로 환산하여 UCLA Health Science Computing Facilities 에서 개발한 derivative-free nonlinear regression analysis (PARBMDR Biomedical Compute P Series)를 이용하여 biexponential equation에 적용하여 계산하였다.
정맥 투여 120분 후 PBN의 뇌의 분포용적 (Vd, m//g)은 투여 후 120분에서의 뇌의 약물농도를 뇌의 무게로 나눈 값을 같은 시간의 종말 혈장 중의 약물농도를 혈장 용적으로 나누어서 얻어진 값이다. 전신 혈장 중 클리어런스 (CL》steady-state 분포용적 (乂菖, 혈장중 농도시간 곡선하면적 (area under the plasma concentrationtime curve, AUC)과 평균 체류 시간(mean residence time, MRT) 은 Gibaldi와 Perrier의 정의에 따라 Av A2( k1( 1切로부터 구하였다.*))

성능/효과

2 %ID/g을 나타내었다.14) 실험 결과 PBNe morphine에 비해서는 2배가량 많은 양이, BBB에 수용체가 존재하는 NLA-OX26 와 유사한 정도로 뇌로 이행되는 것을 알 수 있었다. PBN을 정맥 투여하고 120분에서의 brain chromatogram 을 살펴보면(Fig.
이상의 결과에서 a-phenyl-M-tezf-butyl nitrone (PBN) 의 뇌 이행량을 정맥투여법과 내경동맥 관류법 (ICAP)의 두 가지 방법으로 살펴본 결과 유의한 뇌 이행량을 나타내었다. 그러므로 PBN 은 뇌로 이행하여 free radical에 의해 유도된 여러 뇌신경 질환에 효과를 나타내며, 이를 모델 물질로 사용하여 새로운 치료제의 개발이 가능하리라 사료된다.

후속연구

살펴본 결과 유의한 뇌 이행량을 나타내었다. 그러므로 PBN 은 뇌로 이행하여 free radical에 의해 유도된 여러 뇌신경 질환에 효과를 나타내며, 이를 모델 물질로 사용하여 새로운 치료제의 개발이 가능하리라 사료된다.

참고문헌 (14)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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