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문제 정의
- 인간 배아에서 분절화는 초기 난할 시기부터 주로 나타나는 현상이고 배아의 세포자연사를 규명하려는 연구는 대부분 동물실험을 통해 이루어졌고 인간 배아에서 분절화와 관련된 유전자 발현에 관한 연구는 많이 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구는 과배란 유도와 체외수정을 통해서 얻어진 인간 배아에서 분절화가 없는 배아와 분절화가 심한 배아를 대상으로 배아의 분절화와 세포자연사의 상관관계를annexin 염색법을 통하여 살펴보고자 한다. 또한 세포자연사와 관련된 Fas, FasL, Bax, Bcl-2 유전자 산물의 발현 양상을 형광면역염색법과 Western Blotting 방법을 통하여 살펴보고자 하였다.
- 따라서 본 연구는 과배란 유도와 체외수정을 통해서 얻어진 인간 배아에서 분절화가 없는 배아와 분절화가 심한 배아를 대상으로 배아의 분절화와 세포자연사의 상관관계를annexin 염색법을 통하여 살펴보고자 한다. 또한 세포자연사와 관련된 Fas, FasL, Bax, Bcl-2 유전자 산물의 발현 양상을 형광면역염색법과 Western Blotting 방법을 통하여 살펴보고자 하였다.
- 본 실험은 과배란 유도와 체외수정 시술시 인간 배아의 세포질 분절화에 관련된 세포자연사와 단백질 발현을 알아보고자 실시하였다. 배아의 운명은 배아 시기에서만 국한된 것이 아니라 이미 이전부터 많은 영향을 받는 것으로 알려졌다.
가설 설정
- FasL was not detected in both group (b, d). (a, b) The upper pannel shows pictures were taken with confocal microscope and (c, d) lower pannel shows picture taken in bright field. (e, f) Negative control.
제안 방법
- 과배란 유도제는 FSH 단독 또는 FSH와 hMG를 병합하여 사용하였고 혈중 estradiol (E2) 농도와 질식초음파를 사용하여 난포 성장을 관찰하였다. 18 mm 이상의 우성난포가 3개 이상일 때 10,000 IU의 human chorionic gonadotropin (hCG, Profasi, Serono)을 근육주사하여 배란을 유도하였다. hCG를 주사한지 36시간 후에 질식초음파를 사용하여 난자 채취용 바늘 (Single Lumen Ovum Pick-Up Needle Set, COOK)로 난자를 채취하였다.
- 배아의 할구 크기가 균일하고 세포질의 분절화가 없는 것을 Grade 1 (G1), 할구의 크기가 불균일하지만 세포질의 분절화가 없는 것을 G2, 할구의 크기가 불균일하고 20% 미만의 세포질의 분절이 있는 것을 G3, 할구의 크기도 불균일하고 50% 정도의 세포질의 분절이 있는 것을 G4, 정상적인 할구가 거의 보이지 않으며 전체적으로 세포질의 분절화가 나타난 것을 G5로 하였다.29 배아이식은 G1~G3의 등급을 받은 3~5개의 배아만을 환자의 자궁 안으로 이식하였고, 잉여 배아 중 세포질의 분절화가 50% 이상인 G4와 G5 grade의 배아를 실험군으로, 그리고 다정자 침입으로 수정된 배아 중 세포질의 분절화가 없고 정상적인 난할을 보이는 G1과 G2 grade의 배아들은 대조군으로 사용하였다.
- 1% Tween-20)에서 1시간 동안 반응시킨 후 TBS-T로 여러 번 세척하였다. Fas, FasL, Bax, Bcl-2에 대한 일차항체 (BD PharMingen)로 1시간 동안 반응시킨 후 TBS-T로 여러 번 세척하고, HRP (horseradish peroxidase)로 표지된 이차항체와 1시간 동안 반응시켰다. TBS-T로 여러 번 세척한 후 ECL (enhanced chemi-luminescence) 시약 (Amersham pharmacia biotech)으로 1분간 반응시킨 후 X-ray 필름(Hyperfilm, Amersham pharmacia biotech)에 노출시켰다.
- 18 mm 이상의 우성난포가 3개 이상일 때 10,000 IU의 human chorionic gonadotropin (hCG, Profasi, Serono)을 근육주사하여 배란을 유도하였다. hCG를 주사한지 36시간 후에 질식초음파를 사용하여 난자 채취용 바늘 (Single Lumen Ovum Pick-Up Needle Set, COOK)로 난자를 채취하였다.
- 각 군마다 5개씩의 배아에서 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences)를 이용하여 세포자연사를 확인하였다. 우선 배아를 phosphate buffered saline (PBS, Gibco)로 세척한 다음 annexin VFITC로 20분간 반응시킨 후 PBS로 세척하여 propidium iodide (PI)로 염색하였다.
- 배아를 10% NBF (neutral buffered formalin, Sigma)에서 약 10분간 고정한 후 PBS로 세척하고 일차항체의 비특이적 결합을 억제하기 위해서 2% BSA가 첨가된 PBS에서 10분간 반응시켰다. 각 배아는 Fas, FasL, Bax, Bcl-2에 대한 일차항체 (Table 1, BD PharMingen)와 상온에서 1시간 동안 반응시키고, PBS로 세척한 다음 FITC로 표지된 이차항체로 상온에서 암반응의 조건으로 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 배아는 PBS로 세척하여 슬라이드에 mounting medium(Sigma)으로 봉입하여 형광현미경으로 관찰하였다.
- 과배란전주기 제 21일에 GnRHa의 피하주사를 시행하였고 월경주기 제 3일에 과배란 유도를 시작하였다. 과배란 유도제는 FSH 단독 또는 FSH와 hMG를 병합하여 사용하였고 혈중 estradiol (E2) 농도와 질식초음파를 사용하여 난포 성장을 관찰하였다. 18 mm 이상의 우성난포가 3개 이상일 때 10,000 IU의 human chorionic gonadotropin (hCG, Profasi, Serono)을 근육주사하여 배란을 유도하였다.
- 성숙도에 따라 성숙란 (metaphase II, MII)은 난자채취 3~4시간, 중간성숙란 (metaphase I, MI)은 난자채취 8~10시간, 미성숙란(immature, GV)은 20~48시간 동안 CO2 배양기에서 배양 후 체외수정을 시행하였다. 그리고 각 배양접시에는 3~5개 미만의 난자가 배양되도록 조절하였다.
- 난자 채취를 위한 과배란 유도는 gonadotropin releasing hormone agonist (GnRHa, Lucrine subQ, ABBOT)와 follicle stimulating hormone (FSH, Metrodin, Serono)와human menopausal gonadotropin (hMG, Pergonal, Serono)을 병용하는 GnRHa 장기 투여법 (GnRHa long protocol)을 실시하여 유도하였다. 과배란전주기 제 21일에 GnRHa의 피하주사를 시행하였고 월경주기 제 3일에 과배란 유도를 시작하였다.
- 로 조절되는 배양기 내에서 해부현미경 (SZH10, Olympus)을 이용하여 난자와 난구세포 복합체 (oocytes cumulus complex, OCC)의 존재 유무를 확인하였고 OCC가 발견되면 배율을 높여서 난자의 형태와 성숙도를 판정하였다. 난자의 성숙도는 세포질 내의 핵 (germinal vesicle, GV)의 유 · 무, 제 1극체의 출현 유 · 무, 그리고 난구세포의 분포 특징에 따라 확인하였다. 성숙 정도에 따라 각난자를 10% synthetic serum substrate (SSS, Irvine)이 첨가된 P 1 (Preimplantation 1) 배양액으로 옮겼다.
- 물리적으로 손상을 입지 않은 수정란 중 웅성전핵(male pronuclear)과 자성전핵(female pronuclear)이 형성되고 핵 내부에 핵소체를 함유하고 있고, 두 개의 극체 (polor body)가 출현된 것을 정상적인 수정으로 확인하였다. 만일 2개의 극체와 1개의 전핵만이 관찰된 경우에는 4~5시간 뒤에 전핵의 상태가 어떻게 변하는지를 관찰하였다. 수정이 되지 않은 난자는 신선정자를 이용하여 재수정을 유도하였다.
- 005 g/l Phenol red)을 사용하였고, 배양액 제조에 사용한 시약은 Sigma 제품을 사용하였다. 모든 배양액은 95% 이상의 습도, 37℃ 및 5% CO2를 유지하는 배양기(CO2 incubator, Heraeus)에서 10시간 이상 평형시킨 다음 사용하였다.
- 수정 후 약 18~22시간 뒤 수정 (fertilization) 여부를 조사하였다. 물리적으로 손상을 입지 않은 수정란 중 웅성전핵(male pronuclear)과 자성전핵(female pronuclear)이 형성되고 핵 내부에 핵소체를 함유하고 있고, 두 개의 극체 (polor body)가 출현된 것을 정상적인 수정으로 확인하였다. 만일 2개의 극체와 1개의 전핵만이 관찰된 경우에는 4~5시간 뒤에 전핵의 상태가 어떻게 변하는지를 관찰하였다.
- 각 배아는 Fas, FasL, Bax, Bcl-2에 대한 일차항체 (Table 1, BD PharMingen)와 상온에서 1시간 동안 반응시키고, PBS로 세척한 다음 FITC로 표지된 이차항체로 상온에서 암반응의 조건으로 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 배아는 PBS로 세척하여 슬라이드에 mounting medium(Sigma)으로 봉입하여 형광현미경으로 관찰하였다.
- 5)을 이용하여 투명대를 얇게 하고 또 투명대에 붙어 있는 정자나 과립세포를 제거하였다. 배아를 10% NBF (neutral buffered formalin, Sigma)에서 약 10분간 고정한 후 PBS로 세척하고 일차항체의 비특이적 결합을 억제하기 위해서 2% BSA가 첨가된 PBS에서 10분간 반응시켰다. 각 배아는 Fas, FasL, Bax, Bcl-2에 대한 일차항체 (Table 1, BD PharMingen)와 상온에서 1시간 동안 반응시키고, PBS로 세척한 다음 FITC로 표지된 이차항체로 상온에서 암반응의 조건으로 1시간 동안 반응시켰다.
- 성숙 정도에 따라 각난자를 10% synthetic serum substrate (SSS, Irvine)이 첨가된 P 1 (Preimplantation 1) 배양액으로 옮겼다. 성숙도에 따라 성숙란 (metaphase II, MII)은 난자채취 3~4시간, 중간성숙란 (metaphase I, MI)은 난자채취 8~10시간, 미성숙란(immature, GV)은 20~48시간 동안 CO2 배양기에서 배양 후 체외수정을 시행하였다. 그리고 각 배양접시에는 3~5개 미만의 난자가 배양되도록 조절하였다.
- 수정 후 약 18~22시간 뒤 수정 (fertilization) 여부를 조사하였다. 물리적으로 손상을 입지 않은 수정란 중 웅성전핵(male pronuclear)과 자성전핵(female pronuclear)이 형성되고 핵 내부에 핵소체를 함유하고 있고, 두 개의 극체 (polor body)가 출현된 것을 정상적인 수정으로 확인하였다.
- 우선 배아를 phosphate buffered saline (PBS, Gibco)로 세척한 다음 annexin VFITC로 20분간 반응시킨 후 PBS로 세척하여 propidium iodide (PI)로 염색하였다. 염색된 배아는 UV를 광원으로 하고 DAPI/FITC/Rhodamine triple filters가 장착된 형광현미경(E600, Nikon)하에서 관찰하였다.
- 정상적인 수정이 이루어진 배아는 수정 후 37℃와 5% CO2로 조절되는 배양기에서 10% SSS가 첨가된 P 1 배양액으로 약 72시간 동안 배양 후 형태학적 등급을 판정하였다. 배아의 할구 크기가 균일하고 세포질의 분절화가 없는 것을 Grade 1 (G1), 할구의 크기가 불균일하지만 세포질의 분절화가 없는 것을 G2, 할구의 크기가 불균일하고 20% 미만의 세포질의 분절이 있는 것을 G3, 할구의 크기도 불균일하고 50% 정도의 세포질의 분절이 있는 것을 G4, 정상적인 할구가 거의 보이지 않으며 전체적으로 세포질의 분절화가 나타난 것을 G5로 하였다.
- 채취한 난자는 37℃와 5% CO2로 조절되는 배양기 내에서 해부현미경 (SZH10, Olympus)을 이용하여 난자와 난구세포 복합체 (oocytes cumulus complex, OCC)의 존재 유무를 확인하였고 OCC가 발견되면 배율을 높여서 난자의 형태와 성숙도를 판정하였다. 난자의 성숙도는 세포질 내의 핵 (germinal vesicle, GV)의 유 · 무, 제 1극체의 출현 유 · 무, 그리고 난구세포의 분포 특징에 따라 확인하였다.
대상 데이터
- 본 연구는 2001년 9월부터 2002년 5월까지 서울 여성병원불임클리닉을 내원한 총 37명의 불임환자 중 체외수정 및 배아이식 시술 결과 정상적인 수정 후 분절화 현상이 심해 폐기 처분할 배아를 실험군(n=46, Figure 1a)으로, 다정자 침입으로 인한 배아 중 정상적인 난할 과정과 분절화 현상이 나타나지 않은 배아를 대조군 (n=46, Figure 1b)으로 하였다. 그리고 실험군은 연구 목적으로 환자에게서 기증받은 배아만을 대상으로 하였다.
- 난자의 수정 및 배양에는 직접 제조한 P 1 배양액 (2.04 mM CaCl2 · 2H2O, 101.6 mM NaCl, 4.69 mM KCl, 0.2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3, 0.33 mM Na-pyruvate, 21.4 mM Na-lactate, 0.05 mM Taurine, 0.15 mg/l Na-citrate, 10 ? g/l Gentamicin, 0.005 g/l Phenol red)을 사용하였고, 배양액 제조에 사용한 시약은 Sigma 제품을 사용하였다. 모든 배양액은 95% 이상의 습도, 37℃ 및 5% CO2를 유지하는 배양기(CO2 incubator, Heraeus)에서 10시간 이상 평형시킨 다음 사용하였다.
- 난포액은 난자 채취 시술 중 성숙난자를 가지고 있는 난포에서 회수한 난포액에 혈액이 섞여 있지 않은 것만 이용하였다. 회수된 난포액은 3500 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상층액만 회수한 후 56℃로 조절된 항온수조에서 35분간 불활성화 (heat inactivation)시키고 나서 0.
- 본 실험에서 PS가 막 표면으로 이동하는것을 검출하기 위해 annexin V가, 세포막의 상태를 관찰하기 위해서 propidium iodide (PI)가 각각 이용되었다. 세포자연사가 진행되는 세포에서 막 내부의 PS는 막 표면으로 이동하게 되고 여기에 FITC로 표지된 annexin V가 결합함으로써 쉽게 막의 변화를 관찰할 수 있었다.
- 본 연구는 2001년 9월부터 2002년 5월까지 서울 여성병원불임클리닉을 내원한 총 37명의 불임환자 중 체외수정 및 배아이식 시술 결과 정상적인 수정 후 분절화 현상이 심해 폐기 처분할 배아를 실험군(n=46, Figure 1a)으로, 다정자 침입으로 인한 배아 중 정상적인 난할 과정과 분절화 현상이 나타나지 않은 배아를 대조군 (n=46, Figure 1b)으로 하였다. 그리고 실험군은 연구 목적으로 환자에게서 기증받은 배아만을 대상으로 하였다.
- 분절이 없는 배아와 분절이 심한 배아 각각 21개씩 총 42개의 배아를 형광면역염색법에 사용하였다. 세포자연사와 관련된 각 유전자 산물의 형광면역염색 결과는 Table 2와 같다.
이론/모형
- 각 단백질의 발현 양상은 형광면역염색법과 Western blot 분석을 통해 알 수 있었다. 먼저 Bcl-2와 Bax는 실험군과 대조군 모두에서 발현되었지만 발현 양적 차이를 보였다 (Figure 3).
- 난자 채취 후 수음 (masturbation)으로 받은 정액을 37℃에서 20~30분간 방치하여 액화를 유도한 다음 정자의 농도와 운동성을 세계보건기구 (WHO)28의 기준에 따라 측정하였다. 액화된 정액은 10% 난포액이 첨가된 Ham's F-10 배양액으로 2회 세척한 후 pellet을 제외한 상층액은 제거하고 그 위에 1 ml의 Ham's F-10 배양액을 조심스럽게 분주하고 5% CO2로 조절된 배양기에서 30분동안 정자를 부유(swim up)시켜 수정 (insemination)에 이용하였다.
성능/효과
- 21 특히 Bcl-2와 Bax는 유사한 구조를 보이지만 상반되는 기능을 수행하며 이 두 단백질은 서로 결합하여 각각의 단백질이 발현되는 비율에 의해서 세포자연사를 조절하는 것으로 알려져 있다.22 배란 후 난포의 퇴화 과정이 세포자연사에 의한 것이며 여기에 Bcl-2와 Bax가 관여한다는 연구 결과가 발표되었고,23 특히 난소의 과립세포에서 발현되는 Bax 유전자가 난포의 퇴화에 직접적인 영향을 주며 이때 Bcl-2 유전자는 세포자연사를 억제하는 작용을 하는 것으로 밝혀졌다.19,24 또한 성장이 정지된 인간의 미성숙란에서 Bax와 Fas 유전자가 발현된 것도 보고되었다.
- 세포자연사와 관련된 각 유전자 산물의 형광면역염색 결과는 Table 2와 같다. Bcl-2와 Bax는 두 군에서 모두 염색되는 특징을 보였지만 양적 차이를 보여, Bcl-2는 분절이 없는 군에서 더 많이 염색되었고 Bax는 분절이 심한 군에서 더 많이 염색되었다. 특히 Bcl-2는 분절이 심한 배아 내에서도 정상적인 모습을 보이는 할구에서는 강하게 염색되는 특징을 보였다 (Figure 3).
- 이것은 Fas가 세포를 사멸로 이끄는 작용을 하지만 그 기능을 수행하기 위해 FasL에 의해 조절되는 것을 의미하는 것이었다. 또한 본 실험을 통해서 FasL는 거의 발현되지 않는 결과를 얻었고 FasL는 배아 자체에서 발현되기 보다는 외부로부터 유래한 것으로 사료된다.
- 특히 분절화가 심한 부분보다 아직 분절화가 진행되지 않은 부분에서 더 진하게 염색되는 특징을 보였고 이는 세포가 현재 정상적인 모습을 보이고 있지만 이미 세포자연사 과정이 진행 중이며 앞으로 세포질의 분절화가 진행될 것을 의미하는 것이었다 (Figure 2d). 또한 분절화가 있는 배아에서 PI로는 염색되지 않은 결과를 얻었고 이 결과 역시 실험에 사용된 분절화된 배아가 모두 세포자연사 초기라는 사실을 나타내는 것이었다.
- 이상과 같은 연구 결과로 보아, 배아에서 세포질의 분절화 발생 및 진행 과정에서 Bax 유전자와 Fas 유전자의 발현이 가장 큰 영향을 미치고 있으며 두 유전자의 발현으로 세포질의 분절화와 세포의 사멸을 이끄는 것을 알 수 있었다. 그리고 세포 자연사를 유발하는 신호 및 유전자의 발현, 그리고 각 유전자의 상호작용에 관한 생화학적 기작은 앞으로 많은 연구가 진행되어야 할 부분으로 사료된다.
- Western blot 분석에서도 형광면역염색법과 일치하는 결론을 얻었다. 정상인 배아에서는 Bcl-2 단백질이 더 많이 발현되었고 분절이 있는 배아에서는 Bax 단백질과 Fas 단백질이 더 많이 발현되었으며, 특히 Fas는 형광면역염색법으로 그 양적인 차이를 구별할 수 없었지만 정상배아보다 분절화가 있는 배아에서 더 많이 발현되는 차이를 보여주었다. 그리고 FasL는 발현되지 않는 특징을 보였다 (Figure 5).
- 을 제외하면 체내와는 다른 환경에서 배아를 배양함으로서 나타나는 경우가 대부분을 차지하고있다. 체외배양시 배아발달에 필요한 성장인자 (growth factor)나 활성물질과 같은 생존인자 (survival factors)의 결핍으로 세포의 성장이 멈추거나 세포질의 분절이일어나고, 세포사멸이 진행되는 것으로 밝혀졌다.9 또한 산소유리기 (reactive oxygen species, ROS)가 배아의 분절화를 유발한다는 연구가 보고되었다.
후속연구
- 면역세포 외에 인간과 생쥐의 난소와 난자와 같이 면역계와 직접적인 관련이 없는 세포에서 퇴화 과정의 조절에 Fas과 FasL이 관여한다는 연구가 보고되었다.45 따라서 인간 배아에서의 FasL의 유래는 난자가 생성되는 시기의 난포내 또는 이와 관련된 세포, 그리고 면역체계와 관련된 세포에서 유래하는 것으로 생각되어지며 여기에는 많은 연구가 따라야 할 것으로 생각된다.
- 이상과 같은 연구 결과로 보아, 배아에서 세포질의 분절화 발생 및 진행 과정에서 Bax 유전자와 Fas 유전자의 발현이 가장 큰 영향을 미치고 있으며 두 유전자의 발현으로 세포질의 분절화와 세포의 사멸을 이끄는 것을 알 수 있었다. 그리고 세포 자연사를 유발하는 신호 및 유전자의 발현, 그리고 각 유전자의 상호작용에 관한 생화학적 기작은 앞으로 많은 연구가 진행되어야 할 부분으로 사료된다.
- 이러한 결과들은 세포자연사를 유발하는 유전자가 각각 독립적으로 작용하기 보다는 서로 긴밀한 관계를 가지고 세포자연사의 각 단계를 조절하는 것을 보여주는 것으로 생각된다. 본 실험에서도 Fas로 진행되는 세포자연사에 다른 유전자가 미치는 영향은 조사하지 않았지만 이 부분은 앞으로 연구되어야 할 대상으로 생각된다.
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