Hepatitis B viral infection which affect about 10% of Korean population manifests asymptomatic carrier, chronic hepatitis and liver cirrhosis and even associates with hepatocellular carcinoma. Clinical manifestations induced by hepatitis B virus vary depending on the degree of immune response by cyt...
Hepatitis B viral infection which affect about 10% of Korean population manifests asymptomatic carrier, chronic hepatitis and liver cirrhosis and even associates with hepatocellular carcinoma. Clinical manifestations induced by hepatitis B virus vary depending on the degree of immune response by cytotoxic T cells against viral epitope-presenting liver cells. Since hepatitis B virus presents high rate of mutaton that might change the presented epitope and eventually alter immune response, viral mutations, especially in promoters and enhancers, have an important implication in hepatic inflammation and viral replication. To identify mutations related to the hepatic inflammation, we investigated sequence variations of hepatitis B viral promotor regions in the presence or absence of symptoms in hepatitis B carriers. For this, sera from persistently hepatitis B virus-infected mother-child pairs were collected. After PCR amplifiation of all hepatitis B viral promoters (C promoter, S1 promoter, S2/S promoter, X promoter) using serum DNA from each pair, viral promotors were sequenced by automatic sequencer and then sequence data were analyzed by ClustalW. In most cases, the dominant type of maternal virus was transmitted to the child. However, in some children, some new host specific viral variants could be observed in Cp, S1p and S2/Sp. The mutations in C promoter did not seem to be vertically transmitted but arose in new host independently after the wild type had been transmitted. Enhancer I containing X promoter revealed high host specific variations as has been reported before. Two S promoters, S1p and S2/Sp, have shown some point mutations in children, but no deletion mutations were detected as in chronic hepatitis patients in whom deletion mutations are frequently found. In conclusion, the children with the vertically transmitted hepatitis B virus mostly retain the dominant type virus that had been transmitted. However, host specific variants tended to accumulate over time, possibly as clinical symptoms develop.
Hepatitis B viral infection which affect about 10% of Korean population manifests asymptomatic carrier, chronic hepatitis and liver cirrhosis and even associates with hepatocellular carcinoma. Clinical manifestations induced by hepatitis B virus vary depending on the degree of immune response by cytotoxic T cells against viral epitope-presenting liver cells. Since hepatitis B virus presents high rate of mutaton that might change the presented epitope and eventually alter immune response, viral mutations, especially in promoters and enhancers, have an important implication in hepatic inflammation and viral replication. To identify mutations related to the hepatic inflammation, we investigated sequence variations of hepatitis B viral promotor regions in the presence or absence of symptoms in hepatitis B carriers. For this, sera from persistently hepatitis B virus-infected mother-child pairs were collected. After PCR amplifiation of all hepatitis B viral promoters (C promoter, S1 promoter, S2/S promoter, X promoter) using serum DNA from each pair, viral promotors were sequenced by automatic sequencer and then sequence data were analyzed by ClustalW. In most cases, the dominant type of maternal virus was transmitted to the child. However, in some children, some new host specific viral variants could be observed in Cp, S1p and S2/Sp. The mutations in C promoter did not seem to be vertically transmitted but arose in new host independently after the wild type had been transmitted. Enhancer I containing X promoter revealed high host specific variations as has been reported before. Two S promoters, S1p and S2/Sp, have shown some point mutations in children, but no deletion mutations were detected as in chronic hepatitis patients in whom deletion mutations are frequently found. In conclusion, the children with the vertically transmitted hepatitis B virus mostly retain the dominant type virus that had been transmitted. However, host specific variants tended to accumulate over time, possibly as clinical symptoms develop.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
Table 2에서 어머니와는 다른 변이된 특정 염기가 4개의 클론 중 몇 개나 존재하는지를 조사하여 특정 변이가 소아의 개체내 상대적인 우세를 획득하는 정도를 알아보고자 하였다. 어머니의 혈청내 바이러스 또한 다양한 변이형이 존재하므로(data not shown) 어머니의 우월형이 주로 소아들에게 감염되었다는 가정하에(또한 위의 조사에서 간접적으로 시사된 바 있다) 이를 기준으로 소아들에서 일어나는 변이의 정도를 비교하였다.
따라서 HBeAg 양성의 수직 감염쌍에서 증상의 유무에 따른 각 promoter의 유전자 변이를 비교 분석한다면 pre-C와 Cp의 유전자 변이에 더하여 바이러스의 지속이나 염증성 반응에 영향을 줄 수 있는 다른 의의있는 유전자 변이를 발굴할 수도 있을 것이다. 이에 본 연구에서는 바이러스 변이에 의한 감염과 감염의 지속 정도에 영향을 주는 유전자 변이를 알아보기 위하여 수직 감염된 어머니와 아이의 쌍에서 만성 간염이 있는 경우와 보균자의 경우를 분류하여 혈청내 B형 간염 바이러스의 4개 모든 promoter 유전자의 변이를 증상과 연관지어 분석하였다.
B형 간염 바이러스에 의한 만성 간염의 발병과 지속적 감염은 면역학적인 문제와 바이러스 자체의 변이에 의해 크게 좌우되는데 B형 간염 바이러스의 경우 변이 발생률이 높으며 체내에 오래 존재하면서 변이가 누적되는 것으로 알려져 있다. 특히 수직 감염은 국내에서 B형 간염 바이러스에 의한 만성 간염의 원인이며 치유가 매우 어려운데 본 연구에서는 바이러스 변이에 의한 감염과 감염의 지속여부를 알아보기 위하여 수직 감염시 모태에서 자손으로 감염되는 바이러스의 변이형을 분석하였다.
제안 방법
출산 당시 어머니들과 아이들은 모두 HBeAg 양성이었고 #6 어머니는 최근 치료에 의해 HBeAg 음성으로 전환된 경우이다(Table 1). B형 간염 바이러스는 4개의 promoter가 바이러스 단백질과 바이러스의 복제 정도를 관장하므로 각각의 대상 혈청에서 B형 간염 바이러스의 DNA를 추출한 후 바이러스의 4개 promoter를 모두 PCR로 증폭하였고 이들에서 각각 4개씩 클론하여 분석하였다.
PCR 증폭된 B형 간염 바이러스 DNA를 polyacrylamide gel 전기영동하여 분리하였다. 각 환자에서 증폭된 다양한 크기의 viral DNA들을 모두 gel에서 잘라내어 TE (10 mM Tris, pH 7.
PCR 증폭된 B형 간염 바이러스 DNA를 polyacrylamide gel 전기영동하여 분리하였다. 각 환자에서 증폭된 다양한 크기의 viral DNA들을 모두 gel에서 잘라내어 TE (10 mM Tris, pH 7.0, 1 mM EDTA)로 녹여낸 후 pGEM-T plasmid vector (Promega, USA)에 클로닝하였다. 각각의 promotor에서 4개씩의 clone을 골라낸 후 BigDye terminator cyclic sequencing reaction kit을 사용하여 ABI PRISMTM 자동 염기서열 분석기에서 염기서열을 결정하고 ClustalW를 사용하여 염기서열을 분석하였다.
0, 1 mM EDTA)로 녹여낸 후 pGEM-T plasmid vector (Promega, USA)에 클로닝하였다. 각각의 promotor에서 4개씩의 clone을 골라낸 후 BigDye terminator cyclic sequencing reaction kit을 사용하여 ABI PRISMTM 자동 염기서열 분석기에서 염기서열을 결정하고 ClustalW를 사용하여 염기서열을 분석하였다.
간기능에 따라 정상군과 만성 간염군으로 나눈 각 쌍으로부터 혈청을 채취하여 바이러스 DNA를 분리하였다. 분리 방법은 0.
본 연구 대상으로 수직 감염으로 추정되는 어머니와 아이의 쌍 중에서 aspartate aminotransferase (AST)/alanine aminotransferase (ALT) 값에 따라 정상군과 만성 간염군으로 나누어 각 3쌍씩 6쌍을 선택하였다. 출산 당시 어머니들과 아이들은 모두 HBeAg 양성이었고 #6 어머니는 최근 치료에 의해 HBeAg 음성으로 전환된 경우이다(Table 1).
Table 2에서 어머니와는 다른 변이된 특정 염기가 4개의 클론 중 몇 개나 존재하는지를 조사하여 특정 변이가 소아의 개체내 상대적인 우세를 획득하는 정도를 알아보고자 하였다. 어머니의 혈청내 바이러스 또한 다양한 변이형이 존재하므로(data not shown) 어머니의 우월형이 주로 소아들에게 감염되었다는 가정하에(또한 위의 조사에서 간접적으로 시사된 바 있다) 이를 기준으로 소아들에서 일어나는 변이의 정도를 비교하였다. #5과 #6의 쌍에서는 어머니의 Xp와 S2/Sp가 증폭되지 못하여 소아 자신의 우월형을 비교 대상으로 하였다.
성능/효과
결론적으로 높은 AST/ALT를 보이는 아이에서 많은 바이러스 유전자 변이가 발견되기는 하나 발병의 원인을 바이러스의 변이에만 한정하여 설명할 수는 없었으며 어머니의 바이러스가 정착한 후 아이 특이 변이형 바이러스가 새로이 발생하고 이들이 우위적으로 증폭되면서 질병의 발병이 연관되는 것 같다.
또한 B형 간염 바이러스의 promoter는 promoter일 뿐 아니라 다른 단백질의 코딩부위이므로 promoter의 염기 변이는 promoter 기능의 변화 뿐 아니라 아미노산의 변이에 의한 바이러스의 기능의 변화나 면역반응을 도피하는 바이러스 변이일 수도 있다. 본 연구에서 각 promoter 염기의 변이는 대부분의 경우에서 아미노산 역시 변이시키는 것을 볼 수 있었는데 이는 바이러스의 변이가 promoter의 기능 변화 뿐 아니라 단백질 변화와 이로 인한 면역작용으로부터의 도피 현상을 초래할 수 있음을 시사한다.
B형 간염 바이러스에 의한 만성 간염의 발병과 지속적 감염은 면역학적인 문제와 바이러스 자체의 변이에 의해 크게 좌우되는데 B형 간염 바이러스의 경우 변이 발생률이 높으며 체내에 오래 존재하면서 변이가 누적되는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 바이러스 변이에 의한 감염과 감염의 지속 정도에 영향을 주는 유전자 변이를 알아보기 위하여 수직 감염된 어머니와 아이의 쌍에서 만성 간염이 있는 경우와 보균자의 경우를 분류하여 혈청내 B형 간염 바이러스의 4개 모든 promoter 유전자의 변이를 증상과 연관지어 분석함으로써 바이러스 유전자 변이를 분석한 결과, 수직 감염시 모태의 주된 바이러스형이 소아에게 감염되는 것으로 보였으며 이 때 Cp의 개체 내 변이형의 정착은 병리현상과의 연관을 제시하지만 Cp 내의 변이와 결손변이를 보이는 만성형 바이러스는 수직 감염과는 연관이 적은 것으로 보였고 S1p 및 S2/Sp의 결손변이를 보이는 만성형 바이러스는 수직 감염과 연관이 적은 것으로 보였다.
후속연구
Promoter의 유전자 변이가 간염의 지속 여부에 중요할 것으로 생각되나 과거 많은 연구는 주로 특정 promoter에 국한됨으로써 promoter 간의 다양한 유전자 변이가 비교되지 못한 점이 있다. 따라서 HBeAg 양성의 수직 감염쌍에서 증상의 유무에 따른 각 promoter의 유전자 변이를 비교 분석한다면 pre-C와 Cp의 유전자 변이에 더하여 바이러스의 지속이나 염증성 반응에 영향을 줄 수 있는 다른 의의있는 유전자 변이를 발굴할 수도 있을 것이다. 이에 본 연구에서는 바이러스 변이에 의한 감염과 감염의 지속 정도에 영향을 주는 유전자 변이를 알아보기 위하여 수직 감염된 어머니와 아이의 쌍에서 만성 간염이 있는 경우와 보균자의 경우를 분류하여 혈청내 B형 간염 바이러스의 4개 모든 promoter 유전자의 변이를 증상과 연관지어 분석하였다.
그러나 결손변이와 Cp내의 1762/64 변이는 만성 간염과 깊은 연관이 있고 상대적으로 AST/ALT 값이 높은 소아에서도 많이 발견되고 있으므로 질병의 진행과 연관하여 참조할 필요가 있겠다. 본 연구의 결과로서 바이러스 변이형의 발생과 B형 간염질환과의 연관성을 정확하게 추정할 수는 없으나 전사인자 결합부위의 빈번한 변이와 수직 감염 후 새로운 숙주에서의 개체 특이성 변이 발생, 그리고 이들이 우월형으로 정착되는 등의 반응은 바이러스 단백질의 발현 정도와 숙주의 HLA 등의 환경에 따른 병리의 연관성을 시사하고 있으며 앞으로 이에 대한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 사료된다.
. 현재 이 부위의 변이가 만성 간염의 발병이나 유지에 관여하는지의 여부는 알려진 바 없으므로 이 부위의 변이를 수직 감염으로 획득하였을 경우 질병의 발병과 지속이 연관되는지를 살펴볼 필요가 있는데 본 연구에서는 HNF4 결합부위 변이형의 존재와 발병이 항상 일치하고 있지는 않았다. Table 3에서 #3 아이는 정상 AST/ALT 값을 가지고 있었으나 75%에서 결손변이를 가지고 있고 #5 아이는 높은 AST/ALT 값을 가지고 있으나 HNF4 결합부위의 변이가 전혀 발견되지 않았다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.