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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 CYP 유도제로 알려진 여러 약물 중에서 포유동물의 CYP 2B, 2C 및 3A를 유도하는 강력한 약물로 알려진 I phenobarbital(PB), 그리고 CYP 1A와 2A를 유발시킨다고 알려진 ^-naphthoflavone (BNF) 및 3-methylcholanthrene (MC) (Harada and Omura, 1981)를 패류인 명주조개 (Coelomactra : antiquata)의 중장선 미크로좀과 in vitroS. 반응시켜 미크로좀 약 물대사 효소계의 이들 유도제에 대한 반응 및 유도제 간의 유도 효과를 비교하여 살펴보고자 하였다.
- 본 실험에서는 명주조개 (C. antiquata)가 BNF, PB 및 MC와 같은 CYP 유도제에 의해 어떻게 반응하는지를 CYP와 EROD 활성을 지표로 삼아 in vitro에서 조사하였다. 그 결과, BNF% PB, MC는 모두 미크로좀의 CYP 함량과 EROD 활성을 유도하였다.
제안 방법
- 강원 북부 연안에 많은 명주조개 （Coelomactra antiguata）의 중장선으로 미크로좀을 만들고, cytochrome P450（CYP）의 유도 제로 알려진 phenobarbital（PB）, 3-methylcholanthrene（MC）및 份naphthoflavone（BNF）을 DMSO에 녹여 함께 3此의 수조 상 에서 in 讨fro로 배양하면서 약물대사효소계의 CYP 함량과 7- ethoxyresorufin-O-deethylase（EROD）활성의 변화를 경시적으로 조사하였다. 그리고 비교를 위한 sham구는 미크로좀에 DMSO만 을 첨가하여 같은 조건으로 배양하였다.
- CYP 유도제로는 MC (3-methylcholanthrene, 98%, Aldrich),BNF (j?-naphthoflavone, 90~95%, Sigma), PB (phenobarbitalNa, Sigma)를 사용하였다. 그리고 MC와 BNF를 용해하고 희석 하는데는 DMSO (dimethylsulfoxide, Sigma)를, PB를 녹이는데는 생리식염수를 각각 사용하였다. 이 밖에 미크로좀 제조와 효소 측정에 사용한 시약은 모두 Sigma사의 특급시약 (AR)을 사용하였다.
- antiquata)는 강릉시 주문진의 패 류시장에서 2001년 8월에 구입하였으며, 살아있는 것을 연구실로 옮겨 여과해수가 담긴 수조에서 충분히 통기하면서 1일간 안정화 시켰다. 그리고는 명주조개의 내장낭 부위를 적출한 다음 불필요한 조직을 가위로 충분히 떼어내고 중장선 (digestive gland) 조직 의 일부를 사용하여 미크로좀을 만들었다. 즉, 중장선을 모아 인 산완충액(0.
- 따라서 본 연구에서는 CYP 유도제로 알려진 여러 약물 중에서 포유동물의 CYP 2B, 2C 및 3A를 유도하는 강력한 약물로 알려진 I phenobarbital(PB), 그리고 CYP 1A와 2A를 유발시킨다고 알려진 ^-naphthoflavone (BNF) 및 3-methylcholanthrene (MC) (Harada and Omura, 1981)를 패류인 명주조개 (Coelomactra : antiquata)의 중장선 미크로좀과 in vitroS. 반응시켜 미크로좀 약 물대사 효소계의 이들 유도제에 대한 반응 및 유도제 간의 유도 효과를 비교하여 살펴보고자 하였다.
- 물배양구와 비교하기 위하여 미크로좀에 DMSO 또는 생리식 염수를 첨가한 sham구를 설정하였으며, 약물배양구는 미크로좀에 MC, BNF 또는 PB를 각각 0.1~1.0mM의 농도가 되도록 첨가하여 30℃의 수조에서 1~7시간을 배양하면서 '4)약물대사효소의 측정'에 기술된 방법에 따라 CYP 함량과 7-ethoxyresorufin-Odeethylase(EROD)활성을 측정하였으며, 각 실험별로 3반복 실시하였다.
- 1~3과 같다. 이때 비교를 위한 sham구로는 미크로 좀에 2% 농도의 DMSO (MC, BNF 배양구의 경우)나 생리식염 수(PB 배양구의 경우)만을 첨가하여 배양하였고, 모든 배양구는 유도제나 용매를 첨가하기 전의 CYP 농도를 100%로 하고 유도 제로 배양한 후의 CYP 함량을 상대비로 나타내었다.
- CYP 농도의 측정은 Omura and Sato (1964)의 방법을 따랐으며, EROD 활성의 측정은 Burke and Mayer (1974)의 방법을 따랐다. 즉, CYP 농도는 미크로좀에 환원제로 sodium dithionite를 소량 첨가한 다음에 CO 가스를 약 30초간 통기하고 나서 UV/VIS 분 광광도계 (Shimadzu 1601-PC, Japan)를 사용하여 450과 490 nm 의 차이스펙트럼 (difference spectrum)을 측정하였으며, 분자홉광 계수는 91cmTmMT으로 정량하였다. 한편, EROD 활성의 측정 은 미크로좀에 NADPH 재생계 용액(0.
- 그리고는 명주조개의 내장낭 부위를 적출한 다음 불필요한 조직을 가위로 충분히 떼어내고 중장선 (digestive gland) 조직 의 일부를 사용하여 미크로좀을 만들었다. 즉, 중장선을 모아 인 산완충액(0.1 M KH2PO4/K2HPO4-20% glycerol, pH 7.4)으로 균질화 한 다음에 원심분리(8,000Xg, 20minutes, 4℃)를 하고 상 등액을 모아 초원심분리 (lOQOOOXg, 120minutes, 4℃)하여 원심 관 하부에 가라앉은 pellet을 상기한 인산완충액 (pH 7.4)으로 재 현탁하였다. 이렇게 만든 미크로좀을 합쳐 균일하게 하고는 여러 개의 microtube에 소량씩 분주하여 -150℃의 초저온냉동고에 보 관하여 두고 실험에 사용하였다.
- 즉, CYP 농도는 미크로좀에 환원제로 sodium dithionite를 소량 첨가한 다음에 CO 가스를 약 30초간 통기하고 나서 UV/VIS 분 광광도계 (Shimadzu 1601-PC, Japan)를 사용하여 450과 490 nm 의 차이스펙트럼 (difference spectrum)을 측정하였으며, 분자홉광 계수는 91cmTmMT으로 정량하였다. 한편, EROD 활성의 측정 은 미크로좀에 NADPH 재생계 용액(0.1 M 인산염완충액/glucose-6-인산염/glucose-6-인산염 탈수소효소/NADP+)을 첨가한 다 음에 기질인 7-ethoxyresorufin을 넣고 일정시간 반응시켜 생성되는 resorufin의 농도를 형광분광계 (Shimadzu RF-5301PC, Japan)로 측정 (Ex. 550nm, Em. 585 nm)하여 정량하였다. 그리고 미크로좀의 단백질 농도는 Lowry et al.
대상 데이터
- CYP 유도제로는 MC (3-methylcholanthrene, 98%, Aldrich),BNF (j?-naphthoflavone, 90~95%, Sigma), PB (phenobarbitalNa, Sigma)를 사용하였다. 그리고 MC와 BNF를 용해하고 희석 하는데는 DMSO (dimethylsulfoxide, Sigma)를, PB를 녹이는데는 생리식염수를 각각 사용하였다.
- 실험에 사용한 명주조개 (C. antiquata)는 강릉시 주문진의 패 류시장에서 2001년 8월에 구입하였으며, 살아있는 것을 연구실로 옮겨 여과해수가 담긴 수조에서 충분히 통기하면서 1일간 안정화 시켰다. 그리고는 명주조개의 내장낭 부위를 적출한 다음 불필요한 조직을 가위로 충분히 떼어내고 중장선 (digestive gland) 조직 의 일부를 사용하여 미크로좀을 만들었다.
이론/모형
- CYP 농도의 측정은 Omura and Sato (1964)의 방법을 따랐으며, EROD 활성의 측정은 Burke and Mayer (1974)의 방법을 따랐다. 즉, CYP 농도는 미크로좀에 환원제로 sodium dithionite를 소량 첨가한 다음에 CO 가스를 약 30초간 통기하고 나서 UV/VIS 분 광광도계 (Shimadzu 1601-PC, Japan)를 사용하여 450과 490 nm 의 차이스펙트럼 (difference spectrum)을 측정하였으며, 분자홉광 계수는 91cmTmMT으로 정량하였다.
- 585 nm)하여 정량하였다. 그리고 미크로좀의 단백질 농도는 Lowry et al. (1951)의 방법으로 정량 하였다.
성능/효과
- 그 결과, BNF% PB, MC는 모두 미크로좀의 CYP 함량과 EROD 활성을 유도하였다. CYP 함량과 EROD 활성을 기준으로 유도제의 효과를 비교해 보면 MC가 가장 강하였고 BNF, PB의 순이었다.
- 1 mM과 l.OmM 배양구는 배양 3시간 후에 최대로 되어 각각 121% 및 136%로 증가하였으며, MC와의 배양에서는 0.1 mM과 0.4 mM 및 0.8 mM 배양구는 배양 5시간 후에 최대값이 되어 각각 204%, 198% 및 191%로 증가하였다.
- 0 mM BNF 배 양구는 배 양 4~6시간 후에 최대 값이 되 었는데 각각 처음 보다 116%, 114%, 126% 및 132%로 되었다. PB와의 배양에서는 0.1 mM과 0.4 mM 및 1.0 mM 배양구는 배 양 4~6시간 후에 최대 값이 되었고 각각 처음의 112%, 114% 및 114%로 되었으며, MC와의 배양에서도 QlmM과 0.4mM 및 1.0mM 배양구는 배양 4시간 후에 최대값이 되어 각각 116%, 130% 및 132%로 증가하였다.
- ■그 결과, sham구의 CYP 함량은 배양 6시간이 지나서는 처음 수준의 91 % 로 줄었으며, 0.1 mM과 0.2 mM, 0.4 mM 및 1.0 mM BNF 배 양구는 배 양 4~6시간 후에 최대 값이 되 었는데 각각 처음 보다 116%, 114%, 126% 및 132%로 되었다. PB와의 배양에서는 0.
- antiquata)가 BNF, PB 및 MC와 같은 CYP 유도제에 의해 어떻게 반응하는지를 CYP와 EROD 활성을 지표로 삼아 in vitro에서 조사하였다. 그 결과, BNF% PB, MC는 모두 미크로좀의 CYP 함량과 EROD 활성을 유도하였다. CYP 함량과 EROD 활성을 기준으로 유도제의 효과를 비교해 보면 MC가 가장 강하였고 BNF, PB의 순이었다.
- 1 mM의 농도로 배양하면 처음에는 배양시간과 더불어 CYP 함량은 점차 증가하여 4시간 후에는 최고 116%까지 증가하였지만 6시간 후에는 줄어들어 108% 수준이 되었다. 그리고 0.4 mM로 배양한 경우에는 초기부터 급증하여 배양 4시간 후에 최고로 되어 126%나 되었으며 이후 6시간째에는 다소 감소하였으며, 1.0 mM 배양구는 초기에 급증하였으며 4시간 후에는 최고 132%로 증가하였다가 다시 줄어드는 경향을 보였다. 이처럼 모든 BNF 농도구의 CYP 함량은 sham구에 비해 높았으므로 본 약물은 패류 미크로좀의 CYP 함량을 증가시키는 유도제로 작용한다는 것을 확인할 수 있었다.
- 그리고 MC와 배양하였을 경우 (Fig. 6), 0.1 mM 농도구는 배양 시간이 늘어나면서 5시간까지는 계속 증가하여 195%까지 증가하였 다가 이후에 감소하는 경향을 보였고, 이와 같은 경향은 0.4mM 농도구도 마찬가지로 5시간 후에 최고 198%까지 증가하였다가 감소하였으며, 0.8 mM에서는 노출 5시간째에 191%까지 증가하였 으나 이후에 감소하였다.
- 그리고 MC와 배양할 경우 (Fig. 3), 0.1 mM 농도구는 배양 4 시간 후에 116%까지 증가하였으며, 0.4mM에서는 130%, 1.0mM 에서는 132%까지 CYP 함량이 증가하였다가 이후에는 감소하여 처음 수준으로 회복되었다.
- PB에 의한 유도는 우선 간장에서 CYP2B에 대응하는 리보소움 mRNA의 농도가 증가하고 이에 대응한 cDNA가 합성되어 2~3 시간이 지나면서 CYP2B1의 mRNA가 증가하여 나타나며, PAHs 의 일종인 MC와 BNF에 의한 유도는 세포질의 aryl hydrocarbon receptor (AhR)와 결합한 유도제~수용체의 복합체가 핵으로 이 동하여 그곳에서 유도에 특이적인 mRNA가 DNA로부터 전사되어 이루어지므로 (Waxman and Azaroff, 1992), 반응시간의 지연 은 이런 과정을 거치는 시간을 반영한 결과로 사료된다. 그리고 동일한 유도제를 동일한 농도로 하여 배양한 조개 미크로좀에서 함량과 EROD 활성의 증가 수준을 비교하면 EROD 활성이 함량의 증가보다 약간 컸으며, 특히 MC 배양구에서 그 차이가 컸고 약 2배나 되었다. 그렇지만 어류인 무지개송어에게 MC (20mg kg*1) 주사 시 EROD 활성이 대조구보다 약 24~30배나 증가하였다는 것 (Lemaire et al.
- 이처럼 BNF나 PB, MC는 모두 노출 4시간째에 미크로좀의 CYP 함량이 최고 수준으로 되었다가 이후 감소하였다. 이들 유 도제 중에서 특히 PB는 MC와 BNF에 비해 CYP 유도 효과가 강하지 않아 유도 효과는 MC>BNF>PB의 순이었으며, 대체로 노출 농도가 높을수록 유도 효과 또한 컸다.
- 이상의 결과를 정리하면, 패류의 중장선 미크로좀에 MC, BNF, PB 등의 CYP 유도제를 처리하였더니 미크로좀의 CYP 함량과 EROD 활성이 세 종류의 약물에서 모두 증가하였기에 이들 유도 제는 패류에서도 마찬가지로 유도 작용이 있음을 확인할 수 있었다. 그리고 유도 정도는 유도제의 종류에 따라 차이를 보여, rat등의 포유동물에서 유도효과가 큰 것으로 알려진 PB보다는 MC와 BNF가 패류에서는 오히려 강했으며, 효소간의 비교에서는 EROD 활성이 CYP 농도의 변화보다 증가경향이 컸으므로 좋은 생물지 표로 활용될 수 있으리라 여겨진다.
- 이처럼 BNF나 PB, MC는 명주조개에서도 미크로좀의 CYP 함 량과 EROD 활성을 증가시키는 유도효과를 나타내었으며, 특히 MC에 의한 유도효과가 가장 강했고 BNF, PB의 순이었고, 대체로 약물의 농도가 높을수록 유도 효과도 큰 경향을 보였다.
- 이처럼 BNF나 PB, MC와 배양하였을 경우에 미크로좀의 EROD 활성은 sham구와 비교하여 높았기 때문에 이들 약물은 패류 미크로좀의 EROD 활성도 유도한다는 것을 확인할 수 있었다. 특히 MC에 의한 EROD 활성의 유도효과는 BNF나 PB에 비해 강하였고, 효과를 비교하면 MC>BNF>PB의 순이었으며 대체 로 약물의 농도가 높을수록 유도 효과도 큰 경향을 보였다.
- 4 mM의 경우와 비슷한 수준으로 증가하여 4시간 후에 114%까 지 증가하였다가 이후 줄어들어 6시간 후에는 낮아져서 처음 수 준이 되었다. 이처럼 PB와 배양한 경우에도 CYP 함량은 배양 4 시간까지는 증가하다가 이후에는 감소하는 경향을 보였고, 각 배 양구의 CYP 함량이 sham구 보다 높았기에 이 약물도 CYP 유도 제로 작용하였음을 확인할 수 있었다.
- 0 mM 배양구는 초기에 급증하였으며 4시간 후에는 최고 132%로 증가하였다가 다시 줄어드는 경향을 보였다. 이처럼 모든 BNF 농도구의 CYP 함량은 sham구에 비해 높았으므로 본 약물은 패류 미크로좀의 CYP 함량을 증가시키는 유도제로 작용한다는 것을 확인할 수 있었다.
- 이처럼 BNF나 PB, MC와 배양하였을 경우에 미크로좀의 EROD 활성은 sham구와 비교하여 높았기 때문에 이들 약물은 패류 미크로좀의 EROD 활성도 유도한다는 것을 확인할 수 있었다. 특히 MC에 의한 EROD 활성의 유도효과는 BNF나 PB에 비해 강하였고, 효과를 비교하면 MC>BNF>PB의 순이었으며 대체 로 약물의 농도가 높을수록 유도 효과도 큰 경향을 보였다.
후속연구
- 이상의 결과를 정리하면, 패류의 중장선 미크로좀에 MC, BNF, PB 등의 CYP 유도제를 처리하였더니 미크로좀의 CYP 함량과 EROD 활성이 세 종류의 약물에서 모두 증가하였기에 이들 유도 제는 패류에서도 마찬가지로 유도 작용이 있음을 확인할 수 있었다. 그리고 유도 정도는 유도제의 종류에 따라 차이를 보여, rat등의 포유동물에서 유도효과가 큰 것으로 알려진 PB보다는 MC와 BNF가 패류에서는 오히려 강했으며, 효소간의 비교에서는 EROD 활성이 CYP 농도의 변화보다 증가경향이 컸으므로 좋은 생물지 표로 활용될 수 있으리라 여겨진다. 그리고 유도제의 유도효과가 포유동물의 경우와 달랐는데, 이것은 이들 약제로 유도되는 CYP 이소자임의 분포나 유도기작이 포유동물과 차이가 있을 수 있음을 시사하는 것이어서 향후 자세한 연구가 필요할 것이다.
- 그리고 유도 정도는 유도제의 종류에 따라 차이를 보여, rat등의 포유동물에서 유도효과가 큰 것으로 알려진 PB보다는 MC와 BNF가 패류에서는 오히려 강했으며, 효소간의 비교에서는 EROD 활성이 CYP 농도의 변화보다 증가경향이 컸으므로 좋은 생물지 표로 활용될 수 있으리라 여겨진다. 그리고 유도제의 유도효과가 포유동물의 경우와 달랐는데, 이것은 이들 약제로 유도되는 CYP 이소자임의 분포나 유도기작이 포유동물과 차이가 있을 수 있음을 시사하는 것이어서 향후 자세한 연구가 필요할 것이다. 또한 본 실험은 in vitro에서 유도제의 효과를 조사한 것이므로 이와 같은 결과가 반드시 in vivo의 상태에서도 같은지를 조사하는 것도 바 람직할 것이며, 현재 관련 연구를 진행 중에 있다.
- 그리고 유도제의 유도효과가 포유동물의 경우와 달랐는데, 이것은 이들 약제로 유도되는 CYP 이소자임의 분포나 유도기작이 포유동물과 차이가 있을 수 있음을 시사하는 것이어서 향후 자세한 연구가 필요할 것이다. 또한 본 실험은 in vitro에서 유도제의 효과를 조사한 것이므로 이와 같은 결과가 반드시 in vivo의 상태에서도 같은지를 조사하는 것도 바 람직할 것이며, 현재 관련 연구를 진행 중에 있다.
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