도축돈의 폐병변에서 Streptococcus suis 1 (+14)형, 2 (+1/2)형, 7형 그리고 9형의 Multiplex PCR을 통한 검출 The detection of Streptococcus suis serotype 1 (+14), 2 (+1/2), 7 and 9 from pneumonic lungs in slaughtered pigs by a multiplex PCR원문보기
Streptococcus suis is an important swine pathogen in nearly all countries with an extensive pig industry. It is associated with meningitis, arthritis, endocarditis, septicaemia, bronchopneumonia and sudden death. Attempts to control the disease are still hampered the lack of effective vaccines and s...
Streptococcus suis is an important swine pathogen in nearly all countries with an extensive pig industry. It is associated with meningitis, arthritis, endocarditis, septicaemia, bronchopneumonia and sudden death. Attempts to control the disease are still hampered the lack of effective vaccines and sensitive diagnostic tools. A PCR method which can be used for the detection of virulent strains of serotype 2, which is most prevalent serotype, and serotype 1 was developed. However, serotype 1, 2, 7 and 9 strains are frequently isolated from diseased pigs. In European countries, S suis serotype 2 is the most prevalent type isolated from diseased pigs, followed by serotype 9 and 1. In Japan, capsular serotype 2 was also the most prevalent serotype, followed by capsular serotype 7. Most of S suis isolated from diseased pigs belong to a limited number of capsular serotype, often those between 1 and 9. We investigated the distribution of S suis serotype 1, 2, 7 and 9 from 740 pig lungs at abattoir in Jeolla and Chungcheong by rapid multiplex PCR assay. Fifty of 740 lung samples, 6.8%, were S suis postitive and identified S suis were divided by 38% (19/50) in serotype 2, 2% (1/50) in serotype 7 and 4% (2/50) in serotype 9. The distribution of S suis serotype in Korea was similar to other countries. Moreover, the multiplex PCR assay may be an useful diagnostic tool for the detection of pigs carrying serotype 1, 2, 7, 1/2, 9 and 14 strains in epidemiological and transmission studies and facilitate control and eradication programs.
Streptococcus suis is an important swine pathogen in nearly all countries with an extensive pig industry. It is associated with meningitis, arthritis, endocarditis, septicaemia, bronchopneumonia and sudden death. Attempts to control the disease are still hampered the lack of effective vaccines and sensitive diagnostic tools. A PCR method which can be used for the detection of virulent strains of serotype 2, which is most prevalent serotype, and serotype 1 was developed. However, serotype 1, 2, 7 and 9 strains are frequently isolated from diseased pigs. In European countries, S suis serotype 2 is the most prevalent type isolated from diseased pigs, followed by serotype 9 and 1. In Japan, capsular serotype 2 was also the most prevalent serotype, followed by capsular serotype 7. Most of S suis isolated from diseased pigs belong to a limited number of capsular serotype, often those between 1 and 9. We investigated the distribution of S suis serotype 1, 2, 7 and 9 from 740 pig lungs at abattoir in Jeolla and Chungcheong by rapid multiplex PCR assay. Fifty of 740 lung samples, 6.8%, were S suis postitive and identified S suis were divided by 38% (19/50) in serotype 2, 2% (1/50) in serotype 7 and 4% (2/50) in serotype 9. The distribution of S suis serotype in Korea was similar to other countries. Moreover, the multiplex PCR assay may be an useful diagnostic tool for the detection of pigs carrying serotype 1, 2, 7, 1/2, 9 and 14 strains in epidemiological and transmission studies and facilitate control and eradication programs.
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제안 방법
다시 12,000 xg로, 10 분 동안 원심 후 상층액을 제거한후 540 ㎕의 phenol/chloroforrn/isoaniyalcohol (25:24:1, Sigma, USA)을 혼합하여 12,000 xg( 20분 원심시켜 새로운 튜브에 상 층액 과 isopropanol (Merck, Germany) 500 ㎕를 혼합하여 12,000 xg로, 10분 원심하고 상층액을 제거하였다. 70% ethanol (Merck, Germany)로 DNA pellet을 부유시킨 다음 7,500 xg, 10분간 원심수세를 2회 실시한 후 공기 건 조시켰다. TE buffer 30 ㎕에 추출된 DNA를 부유시킨 후 55℃ 의 항온수조에서 10분간 정치시킨 후 PCR에 이 용시까지 -20℃ 에 보관하였다
PCR 은 thermocycler (MWG Biotech AG Primus 96, Germany) 를 사용하였으며 10 x PCR buffer (Bio Basic Ins, Canada) 5 ㎕, 2.0 mM MgCb (Bio Basic Ins, Canada), 0.25 mM deoxynucleotide triphosftetes (dNTP; Bio Basic Ins, Canada), 각각의 K) pmol forward와 reverse primeis, 100 ng의 template DNA, 2.5 unit의 laq DNA polymerase (Bio Basic Ins, Canada)를 첨가하고 최종량이 50 ㎕가 되도록 멸균 증류수를 넣었다. Predenatumltion은 95 ℃ 에서 10 분, denatmtion은 95 ℃ 에서 1 분, annealing 은 56 ℃ 에서 1 분, extention은 72 ℃ 에서 1 분으로 하여 30 회 반복하였다.
Predenaturation은 95 ℃ 에서 3 분, denaturation은 95 ℃ 에서 30 초, annealing은 64 ℃ 에서 1 분, extention은 72 ℃ 에서 1 분으로 하여 30 회 반복하였으며 최종 extention은 72℃ 에서 5 분간 실시하였다. PCR 증폭산물은 ethidium bromide (0.05 fil/mt; Sigma, USA)를 포함한 1% agarose gel에 전기영동한 후 자외선 조사기로 특이적인 mrp 유전자 증폭산물을 확인하고 사진촬영을 하였다.
Predenatumltion은 95 ℃ 에서 10 분, denatmtion은 95 ℃ 에서 1 분, annealing 은 56 ℃ 에서 1 분, extention은 72 ℃ 에서 1 분으로 하여 30 회 반복하였다. PCR 증폭산물을 ethidium bromide (0.05 ㎕/㎖; Sigma, USA)를 포함한 1% agarose gel에 전기영동한 후자 외선 조사기로 cps 유전자 증폭산물을 확인하였다.
특이 primer (Genotech Ins, Ksea)는 정 등'이 보고한 염기서열에 기초하여 mrp 유전자에 대한 primer# Table 1과 같이 제작하여 사용하였다. PCR은 thermocycler (MWG Biotech AG Primus 96, Germany)에서 10 X PCR buffer (Bio Basic Ins, Canada) 5 ㎕ 2.0 mM MgCb (Bio Basic Ins, Canada), 0.25 mM deoxynucleotide triphosphates (dNTP; Bio Basic Ins, Canada), 10 pmoL의 forward와 reverse primer, 100 ng의 template DNA, 2.5 unit의 Taq DNA polymerase (Bio Basic Ins, Canada)를 첨가하고 최 종량이 50 ㎕가 되도록 멸균 증류수를 넣었다. Predenaturation은 95 ℃ 에서 3 분, denaturation은 95 ℃ 에서 30 초, annealing은 64 ℃ 에서 1 분, extention은 72 ℃ 에서 1 분으로 하여 30 회 반복하였으며 최종 extention은 72℃ 에서 5 분간 실시하였다.
도축된 돼지의 폐에서 육안적으로 폐렴병변이 보이는 부분을 무균적으로 채취하여 실험실로 옮긴 다음 폐 표면을 알콜램프로 가열한 압설자로 소락 멸균하였다. 멸균된 부위를 외과도로 깊이 자른 후 멸균된 백금이를 이용하여 채취한 후 이 재료를 5% 면양혈액이 첨가된 혈액 배지 및 Carter 방법48을 변형하여 제조한 ISOVitalex™ (BBL™, USA) 첨가배지에 접종하였다.
따라서 본 연구에서는 우리나라 양돈산업에서 돼지 폐렴의 주요 병인체인 S. 의 감염상태를 파악하고, 전세계적으로 널리 분포되어 있으며 환돈으로부터 많이 분리되는 S. suis 1(뉘4)형, 2(+1/2)형, 7형 그리고 9형을 동시에 진단할 수 있는 multiplex PCR을 실시하였다.
멸균된 부위를 외과도로 깊이 자른 후 멸균된 백금이를 이용하여 채취한 후 이 재료를 5% 면양혈액이 첨가된 혈액 배지 및 Carter 방법48을 변형하여 제조한 ISOVitalex™ (BBL™, USA) 첨가배지에 접종하였다.
를 분리하였고, 이를 PCR을 통해 확인하였다. 분리된 S. Ms는 multiplex PCR을 통해 혈청형 2 (+1/2), 7 과 9로 분류하였으며 이들 분리주에 대한 생화학적 성상를 실시하여 다음과 같은 결론를 얻었다.
1983년부터 1995년 사이에 Perch et al20과 Ifiggms et al21에 의해 32 종의 새로운 혈청형이 분류되어 지금까지 혈청형 1~34 그리고 1/2을 합하여 총 35종의 혈청형이 알려졌다. 주요 혈청형은 de Moor의 T군과 Qiftrai-Hardley et al과 Gottschalk et aZ23^ 의해서 편도, 질 그리고 포피에서 분리된 연쇄상구균을 15형으로 분류하였다. 14형은 사람으로부터 분리되었고, 17형, 18형, 19형 그리고 21형은 임상적으로 건강한 돼지로부터 분리되었으며, 20형과 30형은 송아지로부터 그리고 33형은 양으로부터 분리되었다.
대상 데이터
1999년 9월부터 10월까지 2개월 동안 전라도와 충청도 지역의 74개 농장으로부터 출하된 740두의 돼지 폐를 실험 재료로 사용하였다.
1999년 9월부터 1999년 10월까지 2개월 동안 전라도와 충청도 지역의 74개 농가로부터 채취한 740개의 폐에서 Gram 염색상, catalase 시험, oxidase 시험, lactose 분해 시험, VP 시험 등을 거쳐 110주의 Streptococcus spp 를 분리하였다,
전라도와 충청도 지역의 74개 농가에서 출하된 740두의 폐를 실험 재료로 사용하여 S. 를 분리하였고, 이를 PCR을 통해 확인하였다. 분리된 S.
이론/모형
8 g을 넣어 녹였고 다른 플라스크에 증류수 400 ml당 8 g의 dried bovine hemoglobin (BBL™, USA)을 녹인 후 121 ℃, 1 기압에서 15분간 멸균한 후 8 ml의 ISOVitalex™ (BBL™, USA)를멸균된 GC medium base에 첨가한 다음 멸균된 dried bovine hemoglobin을 혼합하여 사용했다’ 채취한 실험재료를 접종한 배지는 5% CCh의, 37℃에서 18~24시간 동안 호기 배양한 뒤 유사 집락을 취하여 초대배양에 사용된 배지와 동일한 배지에 계대하여 동일한 조건에서 18~24시간 배양하였다. 배양된 세균은 S. suis 동정을 위해 catalase 시험, oxidase 시험, VP 시험, sodium hippurate 가수분해능 시 험, bile esculin 가수분해능 시 험, amylase 생성시험, -galactosidase 생성시험, alkaline phosphatase 반응시험, 0.65% NaCl broth의 발육능 시험과 같은 생화학 성상시험과 그 외 12종의 당분해 시험을 MacFaddin의 방법52에 준하여 실시하였다
분리된 균으로부터 PCR을 위한 genomic DNA 추출은 Murray와 Thompson의 방법'°에 준하여 실시하였다. 1 8~24시간 동안의 세균배양액을 12,000 Xg로, 30분 동안 원심분리하여 싱층액을 제거한 후 TE buffer (10 mM Tris-Q, 1 mM EDTA, pH 8.
특이 primer (Genotech Ins, Korea)는 Smith et a /50이 이보고 한 염기서열을 기초로 하여 cps 유전자에 대한 primer룰 사용하였고 Table 2에 나타난 바와 같다. PCR 은 thermocycler (MWG Biotech AG Primus 96, Germany) 를 사용하였으며 10 x PCR buffer (Bio Basic Ins, Canada) 5 ㎕, 2.
성능/효과
65% NaCl troth의 발육능 시험에서 다른 연구자들의 보고5와 마찬가지로 모두 음성을 나타내었으며 bile esculin의 가수분해능은 소 등, 이 보고한 바와 같이 모두 양성을 나타냈으나 amylase의 생 성능은 소 등'은 모두 양성이라 하였으나 본 실험에서는 85%의 양성만을 보였다. 또한 당분해능 실험에서 소 등' 과 윤 등''이 보고한 것과 같이 ribose와 arabinose에서 모두 음성을 나타내었lactose는 모두 양성을 나타내었으며 trehalose, inulin 그리고 glucose는 매우 높은 양성률을 나타냈다. 그러나 소 등, 이 salicin에 대해 S.
1. 전체 740개 폐 장기에서 PCR을 적용한 결과 50 (6.8%)주의 S. suis7\ 분리되었다.
2. 분리된 50주의 S. wis의 생화학적 특성은 catalase 시험, oxidase 시험, VP 시험, sodium hippurate 가수 분해능 시험, 0.65% NaCl broth 발육능 시험에서 모두 음성을 나타내었으나, bile esculin 가수 분해능시험, amylase 생성시험, -galactosidase 생성시험, alkaline phosphatase 반응시험에서는 100%, 82.4%, 100%, 100%의 높은 양성을 나타냈다. 당분해능은 ribose, arabmose, mannitol, sorbitol에 대해서는 모든 균주가 음성을 나타낸 반면, lactose에 대해서는 모두 양성이었다.
3. 740개 폐조직에서 분리된 50주 S. wis에 대한 multiplex PCR을 이용한 혈청형 분류 결과 S. suis 2 (니/2)형이 19 (38%)주 분리되어 가장 많은 분포를보였고, 7형이 1 (2%)주 분리되었으며, 9형이 2(4%) 주 분리되었으나 1 (+14)형은 분리되지 않았다.
의 병원성 인자로는 균체벽에 부착된 136 kDa 의 muramidase released protein (MRP) 과 균체밖으로 유리되는 110 kDa의 extracellular factor (EF), hemolysin (suilysin), capsule, finWae, hemagglutinin 등이 알려져 있다. 35~s 특히 Vecht et al은 S. suis 2형 중에서 MRP와 EF를 산생하는 균주 (MRP+, EF+)는 환돈에서 많이 분리되며 대식세포와 단핵구의 탐식에 저항하여 병원성 도강한 반면, MRP와 EF를 산생하지 않는 균주 (MRP-, EF-)는 건강돈에서 많이 분리되며 병원성도 약하여 좋은 병원성 지표라고 주장하였다. 한편 병원성 균주와 비병원성 균주를 구분하기 위하여 DNA fingerprinting, 41 ribotyping, 42 multilocus enzyme electrophoresis43 등도 이용되고 있다.
PCR을 통하여 확인된 S. suis 50주를 대상으로 multiplex PCR을 적용한 결과 fig. 2에 나타난 바와 같이 2 (H/2)형, 7형 그리고 9형에 대하여 특이적인 675, 250, 390 bp 의 PCR 증폭산물을 확인할 수가 있었다. multiplex PCR을 적용한 결과는 Table 3과 같이 2형이 19 (38%)주로 가장 많은 분포를 보였고 7형과 9형은 각각 1 (2%)주와 2 (4%)주 확인되었다.
suis 50주에 대한 생화학적 성상실험에서 sodium hippurate 가수분해능에 있어 조 등은 관절염 환 돈과 건강모돈에서 분리한 균주는 모두 음성이라고 보고하였으며, 본 실험에서도 분리된 균주 모두가 음성을 나타냈다. VP 시험과 0.65% NaCl troth의 발육능 시험에서 다른 연구자들의 보고5와 마찬가지로 모두 음성을 나타내었으며 bile esculin의 가수분해능은 소 등, 이 보고한 바와 같이 모두 양성을 나타냈으나 amylase의 생 성능은 소 등'은 모두 양성이라 하였으나 본 실험에서는 85%의 양성만을 보였다. 또한 당분해능 실험에서 소 등' 과 윤 등''이 보고한 것과 같이 ribose와 arabinose에서 모두 음성을 나타내었lactose는 모두 양성을 나타내었으며 trehalose, inulin 그리고 glucose는 매우 높은 양성률을 나타냈다.
suis는 sorbitol 음성이라 보고하였고 본 실험에서도 모든 분리 균주가 sorbitol 음성으로 나타나 일치하는 결과를 나타내었다. 그러나 maltose, mannitol 그리고 sucurose는 본 실험에서 10.3%, 0% 그리고 2.6%의 매우 낮은 양성률을 나타내었으나 소 등'은 96.8%, 67.7% 그리고 93.5%의 매우 높은 양성률을 나타내 본 실험 결과와는 매우 많은 차이를 나타내었다. 이 실험에서의 실험결과의 차이는 실험에 사용된 균의 분리 부위 및 건강돈 분리주 등의 차이에 의한 것이라 생각된다.
또한 당분해능 실험에서 소 등' 과 윤 등''이 보고한 것과 같이 ribose와 arabinose에서 모두 음성을 나타내었lactose는 모두 양성을 나타내었으며 trehalose, inulin 그리고 glucose는 매우 높은 양성률을 나타냈다. 그러나 소 등, 이 salicin에 대해 S. 의 분리균 모두가 양성이라 보고하였으나 본 실험에서는 매우 낮은 양성률을 나타내 상당한 차이가 인정되었다. Etevriese et al은 반추수와 말 등에서 분리한 S.
4%, 100%, 100%의 높은 양성을 나타냈다. 당분해능은 ribose, arabmose, mannitol, sorbitol에 대해서는 모든 균주가 음성을 나타낸 반면, lactose에 대해서는 모두 양성이었다. 또한 trehalose, inulin, raffinose, glucose는 70% 이상의 높은 양성률을 나타냈었으나 sucrose, maltose, salicin은 15% 이하의 매우 낮은 양성률을 나타냈다.
따라서 이 연구에서는 세계 여러나라에서 많은 발생 분포를 보이는 S. suis 1 (+14)형, 2 (+1/2)형, 7형 그리고 9형에 대해 국내에서는 최초로 multiplex PCR 기법을 이용하여 이들에 대하여 신속하고 정확하게 동정할 수 있었다. 이러한 진단기법은 역학과 전파경로 그리고 박멸계획 수립에 매우 유용한 진단기법으로서 활용될 것으로 기대된다.
당분해능은 ribose, arabmose, mannitol, sorbitol에 대해서는 모든 균주가 음성을 나타낸 반면, lactose에 대해서는 모두 양성이었다. 또한 trehalose, inulin, raffinose, glucose는 70% 이상의 높은 양성률을 나타냈었으나 sucrose, maltose, salicin은 15% 이하의 매우 낮은 양성률을 나타냈다.
suis에서 ribose, arabinose, mannitol, sorbitol^] 대해서는 모든 균주가 음성을 나타낸 반면, lactose에 대해서는 모두 양성이었다. 또한 trehalose, inulin, raffinose, glucose는 70% 이상의 높은 양성율을 나타냈으나 sucrose, maltose, salicin은 15% 이하의 매우 낮은 양성율을 나타냈다. 특히 S.
Streptococcus spp. 로 분리된 110개 균주를 대상으로 mrp 유전자에 대한 primer를 이용하여 PCR 적용한 결과 50개의 균주 (55%)에서만 517 bp의 특이적인 증폭 산물을 확인할 수 있었다 (Fig. 1).
S, suis는 Gram 양성 연쇄상 구균으로, 강한 용혈성을 나타내는 1 mm이하의 아주 작은 크기의 집락을 형성하며, 혈액한천배지상에서 잘 자랐다. 분리된 S. suis 모두는 catalase 시험, oxidase 시험, VP 시험, sodium hippurate 가수분해에 있어서 모두 음성반응을 보였으며, 0.65% NaCl broth에서 모든 균주가 자라지 않았으며, bile esculin 가수분해, amylase 생성, -galactosidase 생성, alkaline phosphatase 생성능은 매우 높은 양성반응을 나타내었다. 특히 S.
이 연구에서는 S. suis 2형이 분리된 50개 분리주중 19(38%)주로 가장 많이 분리되었다. 이러한 결과는 S.
65% NaCl broth에서 모든 균주가 자라지 않았으며, bile esculin 가수분해, amylase 생성, -galactosidase 생성, alkaline phosphatase 생성능은 매우 높은 양성반응을 나타내었다. 특히 S. suis 2형에 대한 bile esculin 가수분해, -galactosidase 생성, alkaline phosphatase 생성 능은 모두 100%의 양성을 나타내었다. 분리된 S.
또한 trehalose, inulin, raffinose, glucose는 70% 이상의 높은 양성율을 나타냈으나 sucrose, maltose, salicin은 15% 이하의 매우 낮은 양성율을 나타냈다. 특히 S. suis 2형의 경우 trehalose, inulin, raffinose는 다른 혈청형들에 비해 90% 이상의 매우 높은 양성율을 나타내었고 salicin에 대해서는 모두 음성으로 나타났다.
후속연구
이러한 진단기법은 역학과 전파경로 그리고 박멸계획 수립에 매우 유용한 진단기법으로서 활용될 것으로 기대된다. 또한 multiplex PCR 기법은 백신의 개발이나 인수공통전염병의 예방노력을 위한 S. wis의 다양한 혈청형을 보다 신속하게 구별할 수 있는 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
suis 1 (+14)형, 2 (+1/2)형, 7형 그리고 9형에 대해 국내에서는 최초로 multiplex PCR 기법을 이용하여 이들에 대하여 신속하고 정확하게 동정할 수 있었다. 이러한 진단기법은 역학과 전파경로 그리고 박멸계획 수립에 매우 유용한 진단기법으로서 활용될 것으로 기대된다. 또한 multiplex PCR 기법은 백신의 개발이나 인수공통전염병의 예방노력을 위한 S.
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