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문제 정의
- 본 연구에서는 경북지방 양돈장에서 병성감정 의뢰된 돼지가검물에서 분리한 S. suis를 대상으로 PCR에 의한 균의 동정,생화학적 성상 및 항균제 감수성시험을 실시하고 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- )내에서 실시하였다. PCR 반응조건은 94℃, 5분간 pre-denaturation시킨 다음, denaturation (94℃, 30초), annealing (60℃, 30초) 및 extension (72℃ 60초)의 과정을 30회 반복 수행시키고 최종적으로 DNA extension을 72℃에서 5분간 실시하였다. PCR이 끝난 후 증폭된 유전자 부위의 확인을 위해 ethidium bromide가 함유된 1.
- PCR은 Accu-PowerⓇ HL PCR premix [1U Taq DNA polymerase, 250 uM each dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10 mM Tris-HCl (pH9.0), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, stabilizer and tracking dye, BioneerⓇ]에 template DNA 5 μl와 제작한 primer 1 μl를 첨가하여 T-gradient thermoblock (Germany, Biometra Co.)내에서 실시하였다.
- PCR이 끝난 후 증폭된 유전자 부위의 확인을 위해 ethidium bromide가 함유된 1.5% agar gel (Bioneer, Korea)에 각 반응이 끝난 시료를 8 μl씩 취하여 한천 사이에 점적한 후 110V, 30분간 전기영동을 실시하고 자외선조사 하에서 특정 위치의 DNA band를 확인하고 사진촬영을 실시하였다.
- 다음 α-용혈을 일으키는 작은 집락을 분리하여 비동화 말혈청 5%을 첨가한 Tryptic soy agar (TSA, Difco, USA)에 계대하여 37℃, 18시간 배양한 다음 -70℃에 냉동보관하고 생화학적 성상, PCR 및 항균제 감수성시험 등 추가실험을 실시하였다.
- 항균제 감수성 시험은 Clinical Laboratory Standards Institute[4]의 기준에 따라 디스크 확산법(disc diffusion method)을 이용하여 다음과 같이 실시하였다. 먼저 분리주를 5% 면양혈액첨가배지 37℃, 18시간 동안 배양한 후 멸균면봉으로 집락을 채취하여 5 ml 멸균생리식염수에 균희석농도를 표준탁도(McFarland No. 0.5)로 희석하고 멸균면봉을 사용하여 미리 준비한 5% 면양혈액첨가배지에 균등하게 획선 도말한 다음 항생제 disc를 배지당 8개를 접종하고 37℃, 18시간 배양한 후 disc 주위에 나타난 발육저지대를 caliper를 이용하여 측정하였고, 항생제에 대한 감수성 결과는 disc 제조사에서 제시한 기준에 따랐다. 본 실험에 사용한 항균제는 BBL sensi-disc (BDⓇ, USA) 제품인 penicillin (10 U), amoxycillin/Clavulanic acid (20/10 μg), ampicillin (10 μg), cephalothin (30 μg), cefoperazone (75 μg), cefepime (30 μg), kanamycin (30 μg), gentamicin (10 μg), amikacin (30 μg), neomycin (30 μg), streptomycin (10 μg), norfloxacin (10 μg), erythromycin (15 μg), clindamycin (2 μg), ciprofloxacin (5 μg), chloramphenicol (30 μg), doxycycline (30 μg), tetracycline(30 μg), trimethoprim/sulfamethoxazole (1.
- 분리주의 PCR을 위해 genomic DNA 추출은 18시간 순수분리하여 증균계대한 균주를 백금이로 1획선 채취하여 멸균증류수 500 μl 첨가한 microtube에 접종하고 90℃에서 30분간 중탕가열한 다음 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 균체성분을 침전시킨 후 상층액 300 μl 를 새로운 microtube에 옮겨 냉동보관하면서 PCR을 위한 template DNA로 이용하였다.
- 분리한 S. suis 의심균주에 대하여 상용화 세균 동정킷트(API20-STREP, bioMeriux, France)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 생화학적 성상을 검사하였다.
대상 데이터
- 2004년부터 2009년까지 경북지방 소재 양돈장에서 병성감정 의뢰된 환돈을 부검하여 채취한 폐, 관절 및 뇌 등의 가검물을 대상으로 면양혈액 5% 첨가 혈액배지에서 37℃, 18시간 배양하였다. 다음 α-용혈을 일으키는 작은 집락을 분리하여 비동화 말혈청 5%을 첨가한 Tryptic soy agar (TSA, Difco, USA)에 계대하여 37℃, 18시간 배양한 다음 -70℃에 냉동보관하고 생화학적 성상, PCR 및 항균제 감수성시험 등 추가실험을 실시하였다.
- 5% agar gel (Bioneer, Korea)에 각 반응이 끝난 시료를 8 μl씩 취하여 한천 사이에 점적한 후 110V, 30분간 전기영동을 실시하고 자외선조사 하에서 특정 위치의 DNA band를 확인하고 사진촬영을 실시하였다. Molecular size marker는 1 kb 100 bp DNA ladder (Bioneer, Korea)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 항균제는 BBL sensi-disc (BDⓇ, USA) 제품인 penicillin (10 U), amoxycillin/Clavulanic acid (20/10 μg), ampicillin (10 μg), cephalothin (30 μg), cefoperazone (75 μg), cefepime (30 μg), kanamycin (30 μg), gentamicin (10 μg), amikacin (30 μg), neomycin (30 μg), streptomycin (10 μg), norfloxacin (10 μg), erythromycin (15 μg), clindamycin (2 μg), ciprofloxacin (5 μg), chloramphenicol (30 μg), doxycycline (30 μg), tetracycline(30 μg), trimethoprim/sulfamethoxazole (1.25/23.75 μg)과 OxoidⓇ (UK)제품인 enrofloxacin (5 μg), Ceftiofur (30 μg), tilmicosin (15 μg), spectinomycin (100 μg), florfenicol (30 μg) 등 24종을 사용하였다.
이론/모형
- 균 동정을 위해 Marois 등[27]의 방법에 따라 S. suis의 특이 유전자부위인 16S-rRNA 부위의 primer (F: 5'-CAG TAT TTA CCG CAT GGT AGT TAT-3', R: 5'-GTA AGA TAC CGT CAA GTG AGA A-3')를 제작하여 PCR을 실시하였다.
- 항균제 감수성 시험은 Clinical Laboratory Standards Institute[4]의 기준에 따라 디스크 확산법(disc diffusion method)을 이용하여 다음과 같이 실시하였다. 먼저 분리주를 5% 면양혈액첨가배지 37℃, 18시간 동안 배양한 후 멸균면봉으로 집락을 채취하여 5 ml 멸균생리식염수에 균희석농도를 표준탁도(McFarland No.
성능/효과
- 2%)가 감수성을 나타내었다. Aminoglycoside 계열 중에서는 spectinomycin에 35주(57.4%)가 감수성이 있는 것으 로 조사되었고 kanamycin, amikacin, neomycin, streptomycin에는 모든 균주가 내성이 있는 것으로 나타났다. Tetracycline 계열인 doxycycline과 tetracycline에는 각각 10 주와 1주만이 감수성을 나타내었다.
- 1과 같다. PCR 후 증폭산물을 젤 상에서 전기영동하여 자외선 조사하여 확인한 결과 304 bp에서 DNA 분절이 검출되었다.
- 디스크확산법에 의한 항생제 감수성 시험 결과는 Table 4와 같다. Penicillin, ampicillin, amoxacillin/clablanic acid에 각각 55.7%, 80.3%, 98.4%의 감수성을 나타내었으며, cepha-losporin 계열 중에서는 cefopherazone에 60주(98.4%)가 감수성을 나타내었고, quinolone 계열 항균제인 norfloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin에는 각각 32주(52.5%), 39주(63.9%), 30주(49.2%)가 감수성을 나타내었다. Aminoglycoside 계열 중에서는 spectinomycin에 35주(57.
- 당 분해능은 ribose, arabinose는 분해능이 없었으며, lactose는 모든 균주가 분해능이 있고 trehalose, inulin, raffinose, starch, glycogen은 균주마다 분해능에 차이를 나타내었으며, 전용동정프로그램(apiweb, API 20 STREP ver 7.0)으로 동정한 결과 모두 S. suis 로 동정되었다.
- suis를 대상으로 항균제 감수성 시험을 실시하여 대부분의 균주가 ampicillin 등 8종의 항균제에 감수성이 있으나 일부 균주가 tetracycline, lincomycin 및 spiramycin에는 저항성이 있다고 보고하면서 혈청형별로 감수성 약제에 차이가 있으며 분리 연도별 연쇄상구균의 혈청형에 다소 변화가 있다고 보고한 바 있다. 본 실험에서는 penicillin 계열과 cephalosoporin 계열 항균제에는 대부분 높은 감수성을 나타내었으나 tetracycline 계열과 aminoglycocide 계열에는 대부분의 균주가 내성을 가지는 것으로 나타났고 quinolone 계열의 항균제인 norploxacin, enrofloxacin, ciprofloxacin에도 내성을 나타내는 균주가 다수 조사되어 Wisselink 등[53]과 Zhu 등[55]의 다른 연구자들의 항균제 감수성 시험과 유사한 결과를 나타내었다. Marie 등[26] 은 프랑스에서 분리한 사람 및 돼지 유래 S.
- 최근까지 35종의 혈청형으로 분류되며 생화학적 성상이 다양하여 기존의 혈청형에 따른 균의 분류에 많은 제약이 따른다[5,31]. 본 실험에서는 상용화 균동정 킷트인 API 20 STREP과 특이 유전자부위인 16S-rRNA에 대한 PCR을 실시하여 균을 동정하고 당 및 starch의 분해능의 차이에 따른 phenotype을 조사한 바 11개의 phenotype으로 나누어졌으며 이 중에서 lactose, trehalose, raffinose, glycogen 및 starch 분해능을 가진 균주가 19주로 가장 많은 것으로 조사되었다. 구 등[24]은 도축돈의 폐 병변에서 분리한 S.
- suis의 항균제 감수성 결과를 발표하면서 β-lactam 계열에 대한 치료목적으로 우선 사용을 언급한 바 있다. 본 실험에서도 cephalothin, cefoperazone, cefepime 및 ceftiofur에 대한 감수성 조사 결과 cefepime을 제외하고 대부분 높은 감수성을 가지는 것으로 조사되었다. Reams 등[32]은 1985년부터 1989년 사이에 분리한 256주의 S.
- 분리주 61주 모두에서 pyruvate (VP) 음성이었고, hippurate (HIP), esculin (ESC), pyrrolidonyl 2-naphthylamide (PYRA), α-D-galactopyranoside (αGAL), β-D-glucuronate (βGUR), β-D-galactopyranoside (βGAL), 2-naphthyl phosphate (PAL), L-leucine-2-naphthylamide (LAP), Decarboxylation of arginine반응에서 모두 양성을 나타내었다.
- 당 분해능의 차이에 따라 분류한 결과는 Table 3과 같다. 분리한 61주는 11개의 생물형으로 분류되었으며 이 중에서 lactose, trehalose, raffinose, starch, glycogen 분해능이 있는 균주가 19주로 가장 많았으며, 모든 균주가 lactose 분해능이 있으나 mannitol과 sorbitol에 대해서 공시균주 중 각각 1주 만이 분해능이 인정되었다.
후속연구
- suis의 내성획득과도 관련이 있을 것으로 생각되며 치료 목적 및 예방적 항균제의 사용시에 투약제의 선정에 더욱더 신중을 기울여야 할 것으로 생각된다. 또한 S. suis가 혈청형별에 따른 항균제의 감수성 차이가 여러 연구자에 의해 보고된 바 있으므로 PCR 등을 이용한 S. suis의 혈청형별에 대한 연구 및 개발이 지속적으로 이루어져 신속한 혈청형 동정이 약제 선정과 병행되어야 할 것으로 생각된다.
- suis는 혈청형 2형이 주로 감염되어 발생하며 그 외 다른 혈청형의 분포에 대한 조사도 많이 이루어졌고[51], 추가로 병원성 인자인 MRP와 EF에 대한 유전자 유무를 검출하여 병원성유무를 조사하기도 하나 일부 연구에서 환돈 유래 분리주의 경우에도 MRP와 EF의 불검출 균주가 다수 있는 것으로 조사되었다[10,35,52]. 본 연구에서는 환돈 유래 분리주에서 MRP와 EF에 대한 유무를 조사하지는 않아 추 후에 분리 장기에 따른 병원성 인자의 유무 등을 조사하여야 할 것으로 생각된다.
- 2%)만이 감수성 있는 것으로 조사되어 설파제에 대한 내성율이 높은 것으로 조사되었고, 특히 neomycin의 경우 전균주가 내성을 가지는 것으로 조사되어 많은 차이가 나타났다. 이러한 결과는 광범위한 항생제 오,남용에 의한 상재균인 S. suis의 내성획득과도 관련이 있을 것으로 생각되며 치료 목적 및 예방적 항균제의 사용시에 투약제의 선정에 더욱더 신중을 기울여야 할 것으로 생각된다. 또한 S.
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