[논문]CTLA-4 항원의 세포막 도달 기작에서 친수성 N말단 아미노산 잔기의 역할

한지웅; 이혜자; 김진미; 최은영; 정현주; 임수빈; 최장원; 정용훈

doi:10.4110/in.2002.2.2.102

문제 정의

이 연구에서는 이러한 결과에 토대하여 사람 활성 T 세포 표면 항원 CTLA-4가 세포질에서 세포막으로 도달하는 특성 기전을 규명하고자 이 분자의 leader sequence 및 세포외역에 대한 2종의 상이한 항-펩타이드 항체를 제조하였다. 이 항체들을 사용하여 이 분자의 세포표면 및 세포질 내 발현 양상의 차이를 조사하는 한편 다양한 막 도달 서열 중 N-말단 결손 변이 CTLA4Ig 융합 유전자를 사용하여 이 분자의 막도달 기전을 규명하고자 하였다.
이 연구에서는 이러한 결과에 토대하여 사람 활성 T 세포 표면 항원 CTLA-4가 세포질에서 세포막으로 도달하는 특성 기전을 규명하고자 이 분자의 leader sequence 및 세포외역에 대한 2종의 상이한 항-펩타이드 항체를 제조하였다. 이 항체들을 사용하여 이 분자의 세포표면 및 세포질 내 발현 양상의 차이를 조사하는 한편 다양한 막 도달 서열 중 N-말단 결손 변이 CTLA4Ig 융합 유전자를 사용하여 이 분자의 막도달 기전을 규명하고자 하였다.
제조 anti-peptide antibody의 항원인식 특이성 검정. 전술한 바와 같이 이 연구에서는 3 종류의 사람 CD152 항원에 대한 항-펩타이드 항체를 개발하였고, 이들의 항원인식 여부 및 그 특이성을 검정하였다.
1). 이 항-펩타이드 항체의 항원 인식능이 특이성이 있는지를 확인하기 위하여 antihuman CTLA4pB antibody를 대상으로 하여 이 항체를 제조할 때 항원으로 사용된 human CTLA4pB 펩타이드가이 항체의 유전자 재조합 human CTLA4Ig 인식을 저지하는지를 알아보았다(Fig. 2). Fig.
이 연구에서는 CTLA-4 분자의 막 도달 서열 및 세포 외역(extracellular domain)에 대한 2종의 상이한 항-펩타이드 항체를 제조하여 이 분자의 사람 말초 혈액 림프구 에서 이 분자가 어떤 기전으로 세포질 내에서 세포막 영역으로 도달할 수 있는지를 이해 규명하고자 하였다.

제안 방법

항펩타이드 항체 제조. 사람 CTLA-4 분자의 신호펩타이드역과 세포외역에 해당하는 아미노산 서열 중에서 N'-M₁ACLGFQRHKAQLNLA₁₆C-C'서열을 갖는 17 mer 의 펩타이드 N (CTLA4pN)과 N'-C₁₀₃TGTSSGNQV₁₁₂-C'서열을 갖는 10 mer의 CTLA-4 펩타이드 B (CTLA4pB) 두 가지를 peptide synthesizer를 사용하여 제조한 다음 운반단백질인 keyhole limpet hemocyanin (KLH, Calbiochem, U.S.A.)에 결합하여 면역에 사용하였으며, coupling 반응에는 m-Maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS, Pierce)를 사용하였다. MBS를 dimethyl formamide (DMF)에 녹인 다음, 50 mM sodium phosphate buffer에 녹아 있는 5 mg의 KLH 용액에 1：40의 비율로 가한 다음 실온에서 30분간 반응하였고 Sephadex G-25 column을 통과시켜서 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.
매 회 상기의 제조된 펩타이드-KLH를 펩타이드 기준 200 ug씩 2주 간격으로 New Zealand White 토끼(수컷, 약 2.0 kg 내외)에 근육 및 피하 경로로 4회 면역한 후 마지막 면역일로부터 2주 후 전채혈하여 혈청을 분리하였다. 이 혈청에 KLH를 점적하여 KLH에 반응하는 항체를 제거하고 다시 protein G 또는 protein A column (Pierce, U.
유전자 재조합 CTLA4Ig 융합 단백 제조. 본 연구에서 개발한 항-펩타이드 항체의 항원 인식여부 및 특이성 검정의 항원으로 사용하기 위하여 CTLA-4 세포외역과 사람 IgG의 hinge region 이하 상쇄부위를 클로닝하였다. 이 융합 유전자를 chinese hamster ovary 세포인 CHO-k1 세포에 transfection하여 배양여액으로 분비되는 유전자 재조합 CTLA4Ig 융합 단백을 protein-A column으로 정제하여 항원으로 사용하였다.
두 oligonucleotide를 가한 다음 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 6 mM (NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100, 100μg/ml BSA 1 mM poly (dNTPs), RNAsin (Biotec) 200 U, Moloney murine leukemia virus, reverse transcriptase (Gibco-BRL) 20 U, forward primer 500 ng, reverse primer 500 ng, RNA template 10 ng, 그리고 Pfu DNA polymerase (Stratagene) 또는 Taq DNA polymerase (Perkin-Elmer Cetus) 2.5 U를 혼합하였다. 이 혼합 반응물 50μl를 만들고 멸균된 mineral oil을 상첨한 후 42℃에서 10분 반응시킨 다음, 94℃ 3분, 58℃ 1분, 74℃ 1분 30초씩 2회, 그리고 94oC 1분, 58oC 1분, 74oC 1분 30초씩 30회의 연속 반응시킨 후 DNA thermal cycler (Perkin-Elmer Cetus)를 사용하여 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을(12) 실시하여 extracellular CTLA-4 domain cDNA를 얻었다.
5 U를 혼합하였다. 이 혼합 반응물 50μl를 만들고 멸균된 mineral oil을 상첨한 후 42℃에서 10분 반응시킨 다음, 94℃ 3분, 58℃ 1분, 74℃ 1분 30초씩 2회, 그리고 94oC 1분, 58oC 1분, 74oC 1분 30초씩 30회의 연속 반응시킨 후 DNA thermal cycler (Perkin-Elmer Cetus)를 사용하여 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을(12) 실시하여 extracellular CTLA-4 domain cDNA를 얻었다.
domain cloning은 사람말초혈액을 배양 없이 바로 사용하였으며 이의 PCR 용 primer는 forward primer, 5-A TCT GCA GAG CCC AAA TCT TGT GAC-3와 reverse ward primer, 5'-TT CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA-3' 두 oligonucleotide를 사용했으며 이하의 과정은 상기와 동일하였다. 이두 cDNA를 eukaryotic expression vector인 pCR-3 (Invitrogen, U.S.A.)에 클로닝하고 융합하였다(13). 이를 dideoxy chain termination법으로(14) 아래의 primer들을 사용하여 유전자의 염기서열을 확인하였고 이를 발현에 사용하였다.
IgCH2. 5'-GGC GTG GAG GTG CAT AAT GC-3' (IgG1 CH2 domain 중간 primer) 이상의 과정을 통하여 확인된 plasmid들을 large-prep 하여 15μg을 5×10⁶/ml의 CHO-k1 세포와 혼합한 다음 electroporater (BTX T820)에 cuvette을 넣고 480 V, 99 μsec, 2 cycle 조건에서 electroporation을 실시하였다. 세포들을 geneticin G418 (Gibco, 1,500μg/ml) 함유 무혈청 배지인 CHO-SFM (GIBCO, USA)에 배양하여(15) 배양여액을 수거하고 이를 다시 Protein-A sepharose (Pharmacia, Sweden) column을 이용하여 순수정제된 CTLA4Ig 융합 단백을 얻었다.
) 등을 사용하였다. 일차 항체반응 후 BF로 3회 세척한 다음 anti-rabbit goat IgG-peroxidase 및 anti-mouse goat IgG-peroxidase 등을 1：2,000으로 희석하여 2시간반응시켰다. 반응 후 이를 다시 BF로 3회 세척한 다음 이차 증류수로 1회 최종 세척하였다.
면역효소검사법 . Rabbit anti-human IgG를 carbonatebicarbonate buffer (pH 9.6)로 희석하여100 ug/ml 농도로각 well에 50 ul씩 가한 후 4도에서 하룻밤 동안 부착한후 washing buffer (PBS, pH 7.4, 0.05% Tween 20～1% Bovien serum albumin) 100 ul씩 점적하여 실온에서 1시간 동안 반응시켜 비특이 반응을 억제하였다. 0.
제조 anti-peptide antibody의 항원인식 특이성 검정. 전술한 바와 같이 이 연구에서는 3 종류의 사람 CD152 항원에 대한 항-펩타이드 항체를 개발하였고, 이들의 항원인식 여부 및 그 특이성을 검정하였다.
먼저 이 연구에서 제조된 2종의 사람 CTLA-4 항원에 대한 항-펩타이드 항체의 항원인식 여부 및 그 특이성의 검정을 위해 CTLA4Ig 융합 단백을 제조하였다. 이 실험에서 CTLA4pB 펩타이드는 농도에 비례하여 Western blot상에서 이 항체의 human CTLA4Ig 인식을 특이적으로 억제하였으며, 200 ug/ml의 농도에서 완벽하게 항원 인식을 저지함이 확인되었고 이는 제조된 항-펩타이드 항체가 human CTLA-4를 항원으로서 특이성 있게 인식하고 있음을 증명하는 것으로 생각된다.
05% Tween 20～1% Bovien serum albumin) 100 ul씩 점적하여 실온에서 1시간 동안 반응시켜 비특이 반응을 억제하였다. 0.1% BSA 와 0.05% Tween 20이 함유된 PBS로 상기의 CHO세포 배양여액을 단계별로 희석 50 ul씩 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 peroxidase labelled rabbit antihuman IgG (KPL, USA)를 PBS-0.

대상 데이터

세포배양. 건강한 성인에서 채취한 혈액을 RPMI-1640배지로 1：1로 희석한 후 Ficoll-Hypaque (FH)에 중첩하여 2,000×g로 20분간 밀도구배 원심침전하였고 이를 세척하여 사용하였다. 10% 우태아 혈청 함유 RPMI-1640배지(FBS-RPMI)로 림프구 농도를 5×10⁵/ml로 조절하여 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다.
7)으로 용출하여 PBS로 투석한 후 다음 실험에 사용하였다. 이렇게 제조된 항체는 각각 상기의 서술된 펩타이드순으로 anti-CTLA4pN 및 anti-CTLA4pB로 명명 하여 사용하였다.
6, blocking buffer, 이하 BF)로 blocking한 후 동일 BF에 일차 항체를 넣고 하룻밤 반응시켰다. 이 때 사용된 일차 항체는 아래의 본 연구에서 제조된 항-펩타이드 항체와 intracellular CD152 protein complex를 면역하여 얻은 항체 및 Pharmingen에서 시판 중인 항체(anti-human CD152, U.S.A.) 등을 사용하였다. 일차 항체반응 후 BF로 3회 세척한 다음 anti-rabbit goat IgG-peroxidase 및 anti-mouse goat IgG-peroxidase 등을 1：2,000으로 희석하여 2시간반응시켰다.
, Lugano, Switzerland)에 넣어 450～492 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조 시료는 mok plasmid를 transfection시킨 CHO세포 배양여액을 사용하였다.
이 실험에 사용된 항원은 전술한 방법으로 제조 및 정제된 human CTLA4Ig 융합 단백으로 분자량은 monomer 상태에서 50 kD이고 dimer 상태에서는 100 kD였다. 이를 전술된 사람 CD152의 세포외역 부위를 인식할 수 있는 anti-human CTLA4pN와 anti-human CTLA4pB 두 항체로 Western blot을 실시한 결과 이들 모두 유전자 재조합 human CTLA4Ig 융합 단백의 monomer 혹은 homodimer 를 항원으로 인식하였다(Fig.

이론/모형

)에 클로닝하고 융합하였다(13). 이를 dideoxy chain termination법으로(14) 아래의 primer들을 사용하여 유전자의 염기서열을 확인하였고 이를 발현에 사용하였다.

성능/효과

T 림프구의 helper 기능의 보조가 필요함을 보고한 바 있다. 또한이 항원 분자는 활성화된 사람 말초혈액 T 림프구에서 세포막형과 세포질 내재형의 두 가지 형태로 존재하고, 이 분자의 대부분(93% 이상)은 일차적으로 세포질 내에 잠복상태로 존재하다가 세포표면으로 전환(translocation)되고 세포질 내에서는 거대분자량의 단백 복합체를 형성하고 있음을 관찰하였다.
외래 유전자를 포함하지 않는 pCI-neo vector만을 transfection하여 얻은 Mock transfectant의 배양여액에서는 면역효소법 검사에서 항원 발현이 전혀 검출되지 않았다. CTLA4/L1-IgG1 융합 유전자를 함유한 pCI-neo vector를 transfection하여 얻은 CHO-k1 세포주를 동일한 방법으로 검색한 결과 항 사람 CTLA-4 항체로본 항원의 세포표면 발현이 매우 약하게 검출되었다 (Fig. 4). CTLA4/L2-IgG1부터 CTLA4/L5-IgG1까지의 융합 유전자를 transfection하여 얻은 세포주의 배양여액에서는 매우 높은 양의 융합단백이 배양여액으로 분비되는 것을 알 수 있었다(Fig.
4). CTLA4/L2-IgG1부터 CTLA4/L5-IgG1까지의 융합 유전자를 transfection하여 얻은 세포주의 배양여액에서는 매우 높은 양의 융합단백이 배양여액으로 분비되는 것을 알 수 있었다(Fig. 4). 이들 중에서 CTLA4/L3-IgG1이 가장 세포외 분비율이 높았고 그 다음으로 CTLA4/L2- IgG1였으며, CTLA4/L4-IgG1 CTLA4/L5-IgG1순으로 발현 율이 높게 나타났다.
4). 이들 중에서 CTLA4/L3-IgG1이 가장 세포외 분비율이 높았고 그 다음으로 CTLA4/L2- IgG1였으며, CTLA4/L4-IgG1 CTLA4/L5-IgG1순으로 발현 율이 높게 나타났다.
먼저 이 연구에서 제조된 2종의 사람 CTLA-4 항원에 대한 항-펩타이드 항체의 항원인식 여부 및 그 특이성의 검정을 위해 CTLA4Ig 융합 단백을 제조하였다. 이 실험에서 CTLA4pB 펩타이드는 농도에 비례하여 Western blot상에서 이 항체의 human CTLA4Ig 인식을 특이적으로 억제하였으며, 200 ug/ml의 농도에서 완벽하게 항원 인식을 저지함이 확인되었고 이는 제조된 항-펩타이드 항체가 human CTLA-4를 항원으로서 특이성 있게 인식하고 있음을 증명하는 것으로 생각된다. 이러한 항원 특이성이 확인된 항-펩타이드 항체는 세포액 분획에서는 34 kD 항원을 세포막 분획에서는 30 kD의 항원을 인식 하여 이 분자가 세포질 내와 세포표면에서의 상이한 두가지 유형으로 발현됨을 알 수 있었다.
이 실험에서 CTLA4pB 펩타이드는 농도에 비례하여 Western blot상에서 이 항체의 human CTLA4Ig 인식을 특이적으로 억제하였으며, 200 ug/ml의 농도에서 완벽하게 항원 인식을 저지함이 확인되었고 이는 제조된 항-펩타이드 항체가 human CTLA-4를 항원으로서 특이성 있게 인식하고 있음을 증명하는 것으로 생각된다. 이러한 항원 특이성이 확인된 항-펩타이드 항체는 세포액 분획에서는 34 kD 항원을 세포막 분획에서는 30 kD의 항원을 인식 하여 이 분자가 세포질 내와 세포표면에서의 상이한 두가지 유형으로 발현됨을 알 수 있었다. 이 두 유형간의 분자량 차이 4 kD는 정확하게 CTLA-4의 막 도달 서열로 추정되는 36개의 N-말단 아미노산의 분자량과 일치되고 있다.
이 두 유형간의 분자량 차이 4 kD는 정확하게 CTLA-4의 막 도달 서열로 추정되는 36개의 N-말단 아미노산의 분자량과 일치되고 있다. 즉 CTLA-4의 세포막형은 이 막 도달 서열을 갖고 있지 않음을 증명하기 위하여 전술한 방법으로 사람 CTLA-4 단백의 leader sequence를 인식하는 anti-CTLA4pN antibody와 CTLA-4 단백의 세포외역을 인식하는 antiCTLA4pB antibody를 사용하여 Western blot한 결과는 세포질 내재형 CTLA-4는 leader sequence를 갖고 있으며 세포표면 발현형 CTLA-4는 leader sequence가 제거된 단백 분자임을 알 수 있었다.
이상의 실험 결과로부터 시사되는 CTLA-4의 특성은 면역계의 경우 ICAM-1이 유사한 발현양상을 보이지만이 항원과는 뚜렷한 차이가 있다(16). 그러나 세포막 단 백으로서 세포표면에 직접적으로 발현되지 않는 예는 최근 들어서 많이 보고되고 있다.

후속연구

이상의 CD152분자에 적용 가능성 있는 단백 분자들의 예를 검토하여 보았으나 그 유사한 예를 찾기 어려운 매우 독특한 성격을 갖고 있다. 따라서 이 연구의 성적은 면역학뿐만 아니라 분자 및 세포 생물학 분야에서도 의미 있는 새로운 현상을 규명하는 데에 기여할 수 있을 것으로 생각한다.

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