Arachidonic acid(AA), which is stored in membrane glycerophospholipids, is liberated by phospholipase $A_2(PLA_2)$ enzymes and is sequentially converted to cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (LOX) then to various bioactive prostaglandins (PGs,) and leukotrienes (LTs). In order to find ...
Arachidonic acid(AA), which is stored in membrane glycerophospholipids, is liberated by phospholipase $A_2(PLA_2)$ enzymes and is sequentially converted to cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (LOX) then to various bioactive prostaglandins (PGs,) and leukotrienes (LTs). In order to find the specific inhibitors of AA metabolism enzymes such as $PLA_2$, COX-2, 5-LO and lyso PAF acetyltransferase. 195 Korean indigenous plant extracts were evaluated for their inhibitory activity on $PGD_2,\;LTC_4$ production from cytokine-induced mouse bone marrow-derived mast cells (BMMC) and arachidonic acid released from phospholipid and PAF production from lyso PAF. From this screening procedure, methanol extract of eight plants such as Saururus chinensis, Aster tataricus, Chrysanthemum cinerariaefolium, Reynoutria japonica, Disocorea nipponica, Epimedium koreanum, impatiens textori, Veronica rotunda var. subintegra were found to inhibit production of inflammatory mediators in vitro assay system.
Arachidonic acid(AA), which is stored in membrane glycerophospholipids, is liberated by phospholipase $A_2(PLA_2)$ enzymes and is sequentially converted to cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (LOX) then to various bioactive prostaglandins (PGs,) and leukotrienes (LTs). In order to find the specific inhibitors of AA metabolism enzymes such as $PLA_2$, COX-2, 5-LO and lyso PAF acetyltransferase. 195 Korean indigenous plant extracts were evaluated for their inhibitory activity on $PGD_2,\;LTC_4$ production from cytokine-induced mouse bone marrow-derived mast cells (BMMC) and arachidonic acid released from phospholipid and PAF production from lyso PAF. From this screening procedure, methanol extract of eight plants such as Saururus chinensis, Aster tataricus, Chrysanthemum cinerariaefolium, Reynoutria japonica, Disocorea nipponica, Epimedium koreanum, impatiens textori, Veronica rotunda var. subintegra were found to inhibit production of inflammatory mediators in vitro assay system.
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문제 정의
12,13) 최근에는 PAF길항제 개발 이외도 R\F의 생합성의 율속 효소인 lyso B4F-acetyltransferase (lyso R\F-AT) 저해제를 찾아서 새로운 의약품을 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구자는 이 효소의 저해제를 검색하던 중 luteolin 등과 같은 flavonoid에서 저해활성을 발견하여 보고하였다.14)
이상에서 기술한 것과 같이 본 연구진은 지금까지 천연물에서 성분의 분리 및 구조결정에 관한 다년간의 경험을 바탕으로 in vitm 검색계를 사용하여 195종의 자생식물로부터 새로운 항 염증 작용을 나타내는 자생식물의 발굴을 통하여 새로운 치료제 개발에 필요한 기초적인 자료를 제공하려고 한다.
제안 방법
PGD2 assay kit (Amersham, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 측정한 후 COX-2 활성으로 환산하였다. 이때 검체는 (12.
RBL cell lysate, [3H] acetyl CoA , lyso PAF 및 100 mM Tris-HCl (pH 6.9)를 가하여 37℃ 10분 반응시킨 후 생성되는 [3H] acetyl PAF를 유기용매법으로 추출한 후 액체 scintillation counter로 측정한다. 이때 검체는 (50 p.
건조한 시료 100 g을 메타놀 (methanol)로 3시간 3회 열 추출하고, 이 추출액을 농축 건조하여 이를 저해제 검색에 사용하였다.
반응은 120xg, 4℃에서 5 분간 원심분리 하여 종결시키며, 원심분리 후 상층액을 PGD2 유리 량의 측정에 이용하였다. 배양상등액내의 PGR는 EIA kit (Cayman사)를 사용하여 ELISA법으로 측정하여 COX-2의 저해활성을 검토하였다.
상기 방법으로 BMMC에 KL 혼합자극제를 처리하여 30 분 후 배양 상등액 중의 Eiq를 EIA kit (Cayman사)를 사용하여 ELISA법으로 측정하여 5-LO 활성으로 환산하였다. 이때 검체는 (25 μg/ml) 5 분간 전 처리하였다.
대상 데이터
Male BALB/cJ mice로부터 채취한 골수세포는 50% enriched medium(RPMI 1640 containing 100 units/mZ penicillin, 100 p.g/m/ streptomycin, 10 mg/m/ gentamycin, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM nonessential amino acids and 10% fetal bovine serum)과 IL-3의 공급원으로 50% WEHI- 3 cell-conditioned medium을 사용하여 배양하면 약 4주 후 98% 이상의 BMMC를 얻을 수 있었으며, 4주 후의 세포를 사용하였다.
sPLAz-UA의 유전자 (450b.p> 함유한 PUC 119 plasmid (PCU 119-hIIPLA2)로부터 insect cell expression vector PVL 1392 vector에 subcloning한 후 insect cell인 SF 9 cell 에 감염시 켜 (Low Temp. Incubator, 27℃) Grace's insect medium (Invitroge사)/10% FCS로 배양한 후, 배양액중에 분비되는 정제하여 효소원으로 사용하였다.
국내 자생하는 식물을 무작위로 195종을 선택하여, 유기용매법으로 추출한 후 염증반응에 직·간접적으로 관여하고 있음이 알려진 아라키돈산 대사계에 관련된 효소들의 저해 활성을 검색한 결과를 Table I에 요약하였다.
5 ng/mZ) 15분간 전 처리한 하였다. 본 실험에 사용한 검체는 전부 DMSO에 녹여서 사용하였다.
시약 - Recombinant mouse c-Kit ligand (KL), IL-10, aspirin은 Sigma Chemical사 (St. Louis, MO), IL-ip, IL-3, WEHI-3 cell는 일본 Showa 대학 Kudo Ichiro 교수로부터, Lipopolysaccaride (LPS)는 Difco Laboratories사 (Detroit, MI), RPMI-1640 Medium은 GIBCO BRL사, Fetal bovine serum (FBS)는 Hyclone사, LTC4 및 PGD2 EIA kit (Cayman사), BCA Protein Assay Reagent는 PIERCE사, dimethylsulfoxide (DMSO)는 MERCK사에서 구입하여 사용하였으며, [3H]acetyl Coenzyme A (Amersham사), Tris (hydroxymethyl) aminomethane, CaCL등은 Sigma사로부터, 1.4-bis[2-(phenyloxazolyl)]-benzene(POPOP), 2, 5-dipheny-loxazole (DPO)는 Dojin사로부터 구입하여 사용하였으며, 이외의 모든 시약은 특급품을 사용하였다.
실험재료 - 본 연구에 사용한 생약은 의성, 봉화 약초시험장 시험포에서 수집하였으며, 본 논문의 공동저자인 배기환 교수가 감정하여 실험재료로 사용하였다.
효소원으로서는 rat 비만세포 유래의 cell line인 RBL-2H3 를 대량 배양하여 homogenize한 후 100, 000xg로 원심분리하여 pellet를 이용하였다.
이론/모형
PLA2 활성 측정은 100 mM Tris-HCl(pH 9.0), 6 mM CaCl2, 기 질 2.5 IμM l-acyl-2-[l-14C] arachidonoyl-sn- glycerolphosphoethanolamine (48 mCi/m mole, NEN) 및 효소(10 ng) 및 천연물 추출액 2.5 를 함유한 반응액을 37℃로, 지정된 시간 동안 반응한 후, 생성된 [14℃]유리지방산을 Dole 등의 방법21)에 따라 추출하여 liquid scintillation counter Minaxi Tri-Carb, Packard, USA)로 측정하여 PLA2활성으로 환산하였다. 검체는 (2.
성능/효과
1. Group IIA에 90% 이상 강한 저해활성을 나타내는 식물로는 모란suffructicosd), 쥐손이풀sibiricum), 석결명(CasszN occidentalis), 대극(Euphorbium pekinensis), 호장(Reymoutria japonica), 이식-여뀌 (Persican'a filiformis)% 6종류이었다.
2. RXF 생합성에 70% 이상 강한 저해활성을 나타내는 식물로는 강활(Angelica koreana), 달맞이꽃odoratd), 진달래 (Rhododendron mucronulatuni), 범부채 (Belamcanda chinensis), 박하(Mentha arvensis), 호장 (Reynoutria japonicd), 고본(Angelica tenuissimd), 좁쌀풀 (Lysimachia dahurica), 유럽감초(Glycyrrhiza glabra), 이삭여뀌 (Persicaria filiformis) 등 10종류이었다.
3. COX-2에 60% 이상 강한 저해활성을 나타내는 식물로는 의성개나리viridissima), 적하수오 (Pleurop- terum multiflorum), 맥문동(Liriope platyphylla), 강활 (Angelica koreana), 삽주(Airactylodes japonicd), 큰까치수염(Lasymachia barystachys)등 6종류이었다.
4. 5-LO에 대하여 80% 이상 강한 저해활성을 나타내는 식물로는 배초향(Agastache rugosa), 우산나물(Syneiles palmata), 술패랭이꽃(Dianthus superbus var. longicaly- cinus), 대극(Euphorbium pekinensis), 제충국(Chrysan-themum cinerariaefol), 제비꽃(Viola mandshuricd), 부채마(Epimedium koreanum), 삼시구엽초(Epimedium koreanum), 작두콩(Canavalia gladiata)등 9종류이었다.
5. 비록 각각의 효소에 대하여 강한 저해활성은 나타내지 않았지만 아라키돈산 대사계효소 전반에 걸쳐 비교적 강한 저해활성을 나타내는 식물로는 삼백초(chinensis), 개미취(Aster tataricus), 제충국(Chrysanthemum cinerariae- folium), 호장(Reynoutria japonica), 부채마(Dioscorea nipponica), 삼지구엽초(EpimMiwz koreanum), 물봉선 (Impatiens textori), 산꼬리풀(Veronica rotunda var. subintegra)등 8종류이었다.
후속연구
금후 아라키돈 대사계 관련효소에 대한 선택적인 저해제개발이나 광범위한 저해 활성을 나타내는 물질을 찾고자 할 때는 상기의 식물을 중심으로 유기용매 분획법으로 분리한 검체를 사용하여 저해제를 검색하면 지금까지 보고된 저해제와는 다른 구조를 가진 항염증 및 항알러지제의 개발이 가능하리라 사료된다.
참고문헌 (21)
Ishizaki, J., Suzuki, N., Higashino, K, Yokota, Y., Ono, T, Kawamoto, K, Fujii, N., Arita, H. and Hanasaki, K (1999) Cloning and characterization of novel mouse and human secretory phospholipase $A(_2)s.$ J. Biol. Chem. 274: 24973-24979
Valentin E., Koduri R.S., Scimeca J.C., Carle G., Gelb M.H., Lazdunski M. and Lambeau G. (1999) Cloning and recombinant expression of a novel mouse-secreted phospholipase Az. J. Biol. Chem. 274: 19152-19160
Vadas, P., Pruzanski, P. (1986) Biology of diseases. Role of secretory phospholipase $A_2$ in the pathobiology of diseases. Lab. Invest. 55: 391-404
Chang, H. W., Kudo, I., Hara, S. and Inoue, K. (1986) Extracellular phospholipase A $A_2$ activity in peritoneal cavity of casein-treated rats. J. Biochem. 100: 1099-1101
Hara, S., Kudo, I., Chang, H. W. and Inoue, K (1989) Purification and characterization of extracellular phospholipase $A_2$ from human synivial fluid in rheumatoid arthritis .J. Biochem. 105: 395-399
Forster, S., Ilderton, E., Norris, JFB. and Yardley, H. J. (1985) Characterization and activity of phospholipase $A_2$ in normal human epidermis and in lesion-free epidermis of patients with psoriasis or eczema. Br. J. Dermatol. 112: 135-147
Morita, I., Schindler, M., Regier, M.K., Otto, J.C., Hori, T., DeWitt, D.L. and Smith, W.L. (1995) Different intracellular location for prostaglandin H synthase-l and synthase-2. J. BioI. Chem. 270: 10902-10908
Pilbram, C.C., Kawaguchi, H., Hakeda, Y., Voznesensky, O., Alander, C. B. and Raisz, L.G (1993) Differential regulation of inducible and constitutive prostaglandin endoperoxide synthase in osteoblastic Me 3T3-El cells. J. BioI. Chem. 268: 25643-25649
Pritchard Jr.K.A., O'Banion, M.K., Miano, J.M., Vlasic, N., Bhatia, U.G., Young, D.A. and Stemerman, M.B. (1994) Induction of cyclooxygenase-2 in rat vascular smooth-muscle cells in-vitro and in-vivo., J. Biol. Chem. 269: 8504-8509.
Reddy, S.T. and Herschman, H.R. (1994) Ligand induced prostaglandin synthesis requires expression of the TislO/Pgs2 prostaglandin synthase gene in murine fibroblast and macrophages. J. BioI. Chem. 269: 15473-15480
Morley, J., Page, C. P., Mazzoni, L. and Sanjar, S. (1986) Effect of ketotifen upon responses to platelet activating factor: A basic for asthma prophylaxis. Annals ofAllergy, 56: 335-349
Doebber, T. W., Wu, M.S., Robbins, J.C., Choy, B. M., Chang, M. N. and Shen, T. Y. (1986) Platelet activating factor(PAF) involvement in endotoxin-induced hypotension in rats. Studies with PAF-receptors antagonist Kadsurenone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 127: 799-808
Yanoshita R., Chang n.w, Son K.H., Kudo I. and Samejima Y (1996) Inhibition of lyso-PAF acetyltransferase activity by flavonoids. Inflammation Res. 45: 546-549
Murakami, M., Bingham, C.O., Matsumoto, R., Austen, K.F., and Arm, J.P. (1995) IgE-dependent activation of cytokine-primed mouse cultured mast cells induces a delayed phase of prostaglandin $D_2$ generation via prostaglandin endoperoxidase synthase-2. J. Immunol. 155: 4445-4453
Murakami, M., Matsumoto, R., Urade, Y., Austen, K.F., and Arm, J.P. (1995) c-Kit ligand mediates increased expression of cytosolic phopholipase $A_2,$ prostaglandin endoperoxide synthase-I, and hematopoietic prostaglandin $D_2$ synthesis and increased IgE-dependent prostaglandin $D_2$ generation in immature mouse mast cells. J. Biological Chem. 270: 32393246
Moon, T.C., Murakami. M., Kudo, I., Son, K.H., Kim, H.P. and Chang H.W. (1999) A new class of COX-2 inhibitor, rutaecarpine from Evodia rutaecarpa. Inflammation Res. 48: 621-635
Chang, H. W., Baek, S. H., Chung, K. W., Son, K. H., Kim, H. P. and Kang, S. S. (1994) Inactivation of phospholipase $A_2$ by naturally occuring biflavonoid, ochnaflavone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 205: 843-849
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