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문제 정의
- 11)본 연구팀은 피부질환 치료제 및 미백제 개발을 목적으로 생약 및 한약재를 이용하여 멜라닌색소와 관련된 연구를 계속 진행해 오고 있다.12-16) 이런 연구의 일환으로 소염효과를 보이는 산수유가 멜라닌세포의 멜라닌화에 관여하는지를 알아보기 위하여 산수유 메탄올 추출물이 tyrosinase 효소활성 및 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하였다.
- 있다. 한편 이러한 천연물 및 한약재의 효능과 작용기전이 밝혀진 약물을 대상으로 임상적으로 유용한 처방을 개발하기 위한 새로운 치료법의 연구를 통하여 한의학적 치료법의 새로운 연구분야의 개척을 선도하고자 한다.
제안 방법
- 멜라닌 양을 측정하였다. B16/F10 melanoma 세포에 메탄올 추출물을 각각 1 ㎍/m/에서 200 ㎍/ml의 다양한 농도로 처리하고 48시간 배양한 다음 멜라닌 생성을 측정하였다. Fig.
- MTT Assay - 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl -2H-tetrazolium bromide (MTT) 정 량Sr MosmannS] 방법17)을 변형하여 실시하였다. 세포를 48시간 배양한 후 상층 액을 버리고, 당일 제조한 500 |ig/m/ MTT를 배양 용기당 1ml 씩 넣어 은박지로 포장한 후 3시간 동안 배양하였다.
- Trypan blue 검사 - 대조군과 실험군의 각 well에 0.05% tyrosine - 0.02% EDTA 용액을 가하여, 각 well에서 세포를 분리 수거하였다. 이 분리 수거한 세포를 PBS로 2회 세척한 후 0.
- 메탄올 추출물이 멜라닌 생성에 미치는 영향 - 생체에서의 멜라닌 합성은 기질인 tyrosine이 tyrosinase에 의해 quinone과 indolquinone화합물들의 여러 중간체를 거쳐 멜라닌이 생성된다 기-끄) 메탄올 추출물이 in vivo에서 멜라닌합성에 미치는 영향을 직접적으로 확인하기 위하여 최종산물인 멜라닌 양을 측정하였다. B16/F10 melanoma 세포에 메탄올 추출물을 각각 1 ㎍/m/에서 200 ㎍/ml의 다양한 농도로 처리하고 48시간 배양한 다음 멜라닌 생성을 측정하였다.
- 멜라닌 양 측정 - 멜라닌 양은 Hosoi'8)등의 방법을 변형하여 사용하였다. 세포를 배양하여 PBS로 2회 세척한 후 원심분리하여 세포 침전물을 만들었다.
- 10% DMSO가 첨가된 1 N NaOH 용액을 200첨가하고 80℃에서 1 시간 동안 용해하였으며 , 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 양은 합성 멜라닌(Sigma Co.)을 사용하여 작성된 표준 직선에서 구하고, 실험군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌양에 대한 백분율로 계산하였다.
- 산수유 메탄올 추출물이 tyrosinase활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 B16/F10 melanoma 세포에 메탄올 추출물을 농도별로 처리하고, 48시간 배양한 후 tyrosinase 활성도를 측정하였다. Fig.
- 산수유 메탄올 추출물이 세포생존율에 미치는 영향 - 산수유 메탄올 추출물이 B16/F10 melanoma 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 메탄올 추출물을 1 ㎍/mZ에서 300|ig/m/까지 다양한 농도로 처리하고, 48시간 배양한 후에 MTT 방법으로 세포의 생존율을 관찰하였다. Fig.
- 산수유 추출물이 피부의 멜라닌 색소 형성에 어떠한 영향을 나타내는지를 규명하기 위하여, B16/F10 melanoma 세포에 산수유의 메탄올 추출물을 처리한 후 세포의 생존율, 멜라닌 양의 변화 및 tyrosinase 활성도를 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 세포를 48시간 배양한 후 상층 액을 버리고, 당일 제조한 500 |ig/m/ MTT를 배양 용기당 1ml 씩 넣어 은박지로 포장한 후 3시간 동안 배양하였다. 살아있는 세포는 MTT와 반응하여 보라색 불용성 formazan 침전물이 형성되며 이것을 용해시키기 위하여 상층액을 버리고 10% DMSO를 200㎕씩 넣고 15분간 실온에서 방치한 후 ELISA reader로 570nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.
- 02% EDTA 용액을 가하여, 각 well에서 세포를 분리 수거하였다. 이 분리 수거한 세포를 PBS로 2회 세척한 후 0.02 mZ와 동량의 0.4% (w/v) trypan blue를 잘 섞은 다음 hemocytometer에 넣고 광학현미경을 이용하여 trypan blue에 염색되지 않은 살아 있는 세포수를 측정하였다.
대상 데이터
- 검액조제 - 본 실험에서 사용한 산수유는 원광대학교 한의과대학 한방병원에서 구입한 시료를 n-hexane에 용해시켜 상온에서 24시간 3회 추출한 다음, 이 추출액을 여지로 여과한 후, 감압농축하고 동결건조 시켜 시료를 얻었다. 계속하여 클로로포름, 에틸아세테이트, 메탄올, 물로 추출하고, 여액을 감압 농축하였다.
- 세포배양 - B16/F10 melanoma 세포는 C0 세포배양기 (37℃, 5% CO2)에서 10% fetal bovine serum (Gibco. Co.)이 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 여기에 penicillinstreptomycin (Sigma Chemical Co.
데이터처리
- 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's f-test를 이용하였다.
- 통계방법 - 실험결과는 평균 표준편차로 표시하였으며 , 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's f-test를 이용하였다.
이론/모형
- Tyrosinase 활성도 측정 - Tyrosinase 활성도는 Matinez- Esparz/)의 방법에 의하여 측정하였다. 각 well의 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 만들고, 100 ㎕의 lysis buffer(1% Triton X-100, 10 mM sodium phosphate, 0.
- 산수유의 용매별 추출물의 수득율 - 산수유 L5 kg에 용매를 넣고 상온에서 교반하며 연속추출법을 이용하여 각 추출물을 얻었다. 각 추출물을 0.
성능/효과
- 1. 메탄올 추출물은 B16/F10 melanoma 세포의 생존율에 영향을 거의 주지 않았다.
- 2. Tyrosinase 활성도는 메탄올 추출물 처리군 모두에서 통계적으로 유의한 증가를 보였다.
- 3. 멜라닌 생성은 tyrosinase 활성도와 마찬가지로 메탄올 추출물 처리군의 처리농도 에 비례하여 증가하였으며, 모두 통계적으로 유의한 증가를 보였다.
- 1에서 보는 바와 같이, 메탄올 추출물에 의한 세포 생존율은 최고 300|ig/m/ 처리시에도 유의할만한 변화를 나타내지 않았다. 이 결과를 다시 확인하기 위하여 trypan blue 방법으로 메탄올추출물을 처리하고 세포수를 조사해본 결과도 MTT 방법의 결과와 마찬가지로 농도가 증가해도 유의할만한 변화를 나타내지 않았으며 또한 세포의 형태학적 변화를 관찰해 본 결과 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다(Fig. 2). 이상의 결과를 종합해 볼때 사용한 메탄올 추출물의 농도 범위는 세포증식이나 독성이 없는 것으로 사료된다.
- 2). 이상의 결과를 종합해 볼때 사용한 메탄올 추출물의 농도 범위는 세포증식이나 독성이 없는 것으로 사료된다.
- 4 m 필터로 여과한 후, 여과액을 증류기로 35℃에서 감압농축시킨 후 냉동 건조하여 건조중량을 얻었으며 각 용매별 수득율을 Table I에 나타내었다. 추출물의 수득율은 용매의 극성정도에 따라 수득율이 증가하였으며 수득율은 시료의 건조중량에 대한 추출물 함량의 백분비로 하였다.
- 3에서 보는 바와 같이 메탄올 추출물들의 처리 양이 증가함에 따라 tyrosinase 측정값은 대조군에 비하여 모두 유의성 있는 증가를 보였다. 특히, 200 ㎍/ ml 농도에서 메탄올 추출물 처리군이 대조군에 비하여 2.6 배의 증가를 보였으며, 전체적으로 첨가량이 증가함에 따라대조 군에 비하여 실험군에서 모두 통계적으로 유의성 있게 증가되는 경향을 보였다.
- 05). 한편, 메탄올 추출물을 처리한 군들의 tyrosinase 활성과 멜라닌 양을 비교해 볼 때, 200 |ig/m/ 농도에서 tyrosinase활성은 메탄올 추출물 처리 군이 대조군에 비하여 2.6배 증가하였으나 멜라닌 생성은 약 1.5배 증가하여, tyrosinase 활성이 멜라닌 양에 비하여 더 많이 증가하는 경향을 보였다. 이는 tyrosinase 활성이 멜라닌 생성되는 초기단계에서 크게 증가되는 반면에, 멜라닌은 다른 경로들도 많고 최종산물이므로 여러 단계를 거치므로 적게 만들어질 수 있으리라 사료된다.
후속연구
- 산수유의 약리작용에 관하여는 물 추출물이 항히스타민, 항아세틸콜린 및 항 바륨작용이 있고, 9)황색포도상구균10)을 억제하는 것으로 보고되었으며 메탄올추출물과 그의 에틸분획물이 소염 작용에 효과가 있음이 보고되었다.11)본 연구팀은 피부질환 치료제 및 미백제 개발을 목적으로 생약 및 한약재를 이용하여 멜라닌색소와 관련된 연구를 계속 진행해 오고 있다.12-16) 이런 연구의 일환으로 소염효과를 보이는 산수유가 멜라닌세포의 멜라닌화에 관여하는지를 알아보기 위하여 산수유 메탄올 추출물이 tyrosinase 효소활성 및 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하였다.
- 이상의 결과를 종합해보면 산수유의 메탄올 추출물은 B16/F10 melanoma 세포에서 tyrosinase 활성을 증가시키고 멜라닌 합성을 증가시킴으로서 멜라닌화를 촉진하는 작용이 있음이 확인되었으며, 앞으로 산수유의 메탄올 추출물에 의한 멜라닌 생성의 반응경로를 규명하고 그 주성분을 밝히는 연구가 진행됨으로써 산수유가 멜라닌 색소의 감소나 소실에 의해 유발되는 색소성 질병인 백반증 치료에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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