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문제 정의
- 이처럼 천연물로부터의 약리 효능의 연구는 질병 치료의 효과적인 완치를 위해 없어서는 안 될 의학 분야의 중심적 연구 분야로 발전되고 있는 실정 이디-. 이에 본 연구는 예전부터 한방에서 탁월한 효능이 있는 한약재 중 산수유 함유 성분의 약리 효능을 규명하고자 invitro 상에서 약리 효능 실험을 시헹, 비교 검토한 결과, 산수유의 클로로포름 추출물이 멜라닌 세포의 증식 억제와 cell death에 미치는 영향을 조사하여 흥미있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 0)을 첨가하여 DNA pellet을 용해한 후 분광광도계를 이용하여 260 nm와 280 nm의 optical density (OD) 값을 측정하여 DNA를 정량하였다. 10㎍의 각 DNA 표본들을 10㎍/ml 농도의 ethidium bromide를 포함한 1.2% (w/v) agarose gel에서 50 v, 2시간 정도 전기 영동시켰으며 ultraviolet light에서 DNA pattern을 관찰하였다.
- 본 연구에서 DNA fragmentation 실험을 실시한 결과 cell sigaling에 의한 자발적이고 능동적 사멸 현상의 하나인 DNA 분절회는 명확히 관찰되지 않았으며, DNA tugging 현상이 관찰되었디-. DNA tugging현상도 미세하고 다양하게 분절화된 DNA fragment의 연속적 끌림의 한 현상이므로, 이를 확인하기 위하여 Hoechst 염색(Araki, 1987; Crissman, 1987; Latt, 1976)을 실시하여 염색질의 응축과 분절 화를 형광 현미경으로 관찰한 결괴-, B16/F10 melanoma 세포에서 염색질 응축과 분절화 현상이 관찰되었다. 이상의 결과를 종합해보면 산수유의 클로로포름 추출물은 B16/F10 melanoma 세포의 분열 증식을 억제, 차단하여 세포의 죽음을 유도하는 것으로 사료되는 바이다.
- DNA 분절 현상을 관찰하기 위하여 Wizard Genomic DNA puiification kit(Promega Co. Medison, US A)를 이용하여 total DNA를 추출하였다. 세포에 산수유 chloroform 추출물을 여러 농도별로 처리하고 세포를 PBS 용액으로 세척한 후 원심분리기를 이용하여 순수 세포만을 모았다.
- 1과 동일한 조건하에서 처리된 세포들을 이용하여 DNA fragmentation을 확인하였다. 대조군 세포와 세포 고사가 유도된 세포들로부터 total DNA를 취하여 agarose gel로 전기영동을 실시하였다. 그 결과 세포
- 대조군과 실험군의 각 well에 0.05% trypsine - 0.02% ED1A용액을 가하여, 각 well에서 세포를 분리 수거하였다. 이 분리수거한 세포를 PBS로 2회 세척한 후 0.
- 본 실험에서는 피부암 세포인 B16/F10 melanoma 세포의 세포 사멸에 대한 산수유 클로로포름 추출물의 효과를 알아보기 위하여 추출물의 농도를 1-150 ㎍/ml 농도로 증가시키면서 세포 배양 배지에 처리하여 48시간 동안 세포를 배양하였다. Fig.
- 산수유 1.5 kg에 용매를 넣어 상온에서 교반하고 연속추출법으로 각 추출물을 얻었다. 각 추출물을 0.
- 산수유 추출물이 피부암 세포인 B16/F10 melanoma 세포의 분열 증식에 어떠한 영향을 나타내는지를 규명하기 위하여, B16/F10 melanoma 세포에 산수유의 클로로포름 추출물을 처리한 후 MTT 검색법에 의한 세포의 생존율, Trypan blue법에 의한 세포수, DNA fragmentation, chro-matin condensation의 변화를 측정하였다. 산수유 클로로포름 추출물을 농도별로 처리 한 후 24시간, 48시간 배양한 B16/F10 melanoma 세포의 생존율은 대조군에 비해 농도 의존적으로 감소하며 억제되었고 세포의 형태 학적관찰에서도 농도 의존적으로 세포 사멸(죽음)에 의한 세포막 외부 융기의 돌출과 세포 응축 현상이 관찰되었다.
- 산수유 클로로포름 추출물이 B16/F10 melanoma 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 클로로포름추출물을 0.1 ㎍/ml에서 150 ㎍//ml까지 다양한 농도로 처리하고 24시간, 48시간 배양한 후에 MTT 방법으로 세포의 생존율을 관찰하였다(Fig. 1). MTT 결과에서 보는 바와 같이, 클로로포름 추출물에 의한 세포 생존율은 0.
- 산수유 클로로포름에 노출된 B16/F10 melanoma 세포의 세포 사멸이 수동적이고 물리적인 necrosis인지, cell signal에 의한 능동적이고 자발적 apoplosis인지를 확인하기 위하여 Fig. 1과 동일한 조건하에서 처리된 세포들을 이용하여 DNA fragmentation을 확인하였다. 대조군 세포와 세포 고사가 유도된 세포들로부터 total DNA를 취하여 agarose gel로 전기영동을 실시하였다.
- 산수유 클로로포름을 처리한 B16/FI0 melanoma 세포의 죽음의 기전이 apoptosis에 의한 것인지 또는 necrosis 에 의해 나타니는 현상인지를 확인하기 위해 apoptosis의 특징인 핵 염색질의 농축을 조사하였다. 산수유 클로로포름 추출물이 150㎍/ml의 농도가 되도록 B16/F10 melanoma 세포에 48시간 처리한 후, Hoechst 염색 법으로 형광 현미경하에서 세포의 염색질 응축과 분절화 현상이 관찰되었다(Fig.
- 세포를 48시간 배양한 후 상층액을 버리고, 당일 제조한 100㎍/ml MTT를 배양 용기당 1ml 씩 넣어 은박지로 포장한 후 3시간 동안 배양하였다. 살아있는 세포는 MTT 와 반응하여 보라색 불용성 formazan 침전물이 형성되며 이것을 용해시키기 위하여 상층액을 버리고 10% DMSO를 200㎕씩 넣고 15분간 실온에서 방치한 후 ELISA reader로 570nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.
- 세포들을 24well plate에 2×104 cells/ml정도의 세포수로 배양 배지에 분주한 후 산수유 클로로포름 추출물을 투여하였고 B16/F10 melanoma 세포에 여러 가지 농도 (0.1~120㎍/ml)로 48시간 동안 처리 하였다. 산수유 클로로포름 추출물은 4℃에 저장하였고 사용 직전, 실험에 필요한 농도로 사용 배지에 희석하여 사용하였다.
- Medison, US A)를 이용하여 total DNA를 추출하였다. 세포에 산수유 chloroform 추출물을 여러 농도별로 처리하고 세포를 PBS 용액으로 세척한 후 원심분리기를 이용하여 순수 세포만을 모았다. pell하에 nucleai- lysis buffer를 첨가하여 세포를 파괴한 후 RNAse를 첨가하고 37℃에서 15분간 방치한 후 RNA를 처리하였다.
- 여기에 isopropanol을 첨가한 후 침전에 의해 응축된 DNA를 70% 에탄올에 세척한 후 15분간 실온에서 air dry 시켰다. 여기에 TE 완충용액(10mM Tris-HCI, pH 8.0, 1 mM EDIA, pH 8.0)을 첨가하여 DNA pellet을 용해한 후 분광광도계를 이용하여 260 nm와 280 nm의 optical density (OD) 값을 측정하여 DNA를 정량하였다. 10㎍의 각 DNA 표본들을 10㎍/ml 농도의 ethidium bromide를 포함한 1.
- 02% ED1A용액을 가하여, 각 well에서 세포를 분리 수거하였다. 이 분리수거한 세포를 PBS로 2회 세척한 후 0.02 ml와 동량의 0.4%(w/v) tiypan blue룰 잘 섞은 다음 hemocytometer에 넣고 광학현미경을 이용하여 ttypan blue에 염색된 살아 있는 세포수를 측정하였디-.
- 시행하였다. 클로로포름 분획물들 중 3번 분획물로 처리된 세포들을 5% formaldehyde 용액에서 고정시킨후 1 X PBS로 씻어주고 Hoechst 33342(Sigma Chemocal Co., St. Louis, NY, USA) 염색시약을 1 X PBS에 10 ㎛이 되게 희석하여 15분간 염색한 후 다시 Phosphate-buffered saline (PB$)로 세척하여 형광 현미경으로 관찰하였다.
대상 데이터
- B16/F10 mehmoma 세포는 CO2 세포배양기 (37℃ , 5% CO2)에서 10% fetal bovine serum (Gibco. Co.) 이 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 여기에 pcniciLlin-streptomycin (Sigma Chemical Co.
- 본 실험에서 사용한 산수유 열매는 원광대학교 한의과대학 한방병원에서 구입하였으며 사용시료는 n-hexiine 으로 상온에서 24시간 3회 추출한 다음, 이 추출액을 여과지로 여과한 후, 감압 농축하고 동결건조시켜 시료를 얻었다. 계속하여 Chloroform, EtAC, MeOH, H2O 로 추출하고, 추출액을 여과한 후 감압 농축하였다.
데이터처리
- 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's T-test를 이용하였다.
- 실험결과는 평균 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's T-test를 이용하였다.
이론/모형
- 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheny1-2H-tetrazolium bromide(MTT) 정량은 Mosmann의 방법 (Mosmann, 1983)으로 실시하였다. 세포를 48시간 배양한 후 상층액을 버리고, 당일 제조한 100㎍/ml MTT를 배양 용기당 1ml 씩 넣어 은박지로 포장한 후 3시간 동안 배양하였다.
- Apoptosis과정에서 일어나는 DNA 분절화와 염색질 농축을 관찰하기 위하여 Hoechst 염색 (Araki, 1987; Latt, 1976)을 시행하였다. 클로로포름 분획물들 중 3번 분획물로 처리된 세포들을 5% formaldehyde 용액에서 고정시킨후 1 X PBS로 씻어주고 Hoechst 33342(Sigma Chemocal Co.
성능/효과
- 1). MTT 결과에서 보는 바와 같이, 클로로포름 추출물에 의한 세포 생존율은 0.1㎍//ml~최고 150㎍//ml 처리시 유의할 만한 변화를 나타내었다. 이 결과를 다시 확인하기 위하여 trypan blue 방법으로 클로로포름 추출물을 처리하고 세포수를 조사해본 결과 MTT 방법의 결과와 마찬가지로 농도가 층가함에 따라 유의할 만한 감소를 나타내었으며(Fig.
- 3). 더불어 산수유의 구성 화합물 중 알려진 단일 물질과 클로로포름 추출물을 B16/F10 melanoma 세포에 대해 MTT방법으로 세포 생존율을 비교, 측정해 본 결과 구성 회합물 중 Ursolic acid 에 의해 B16/ F10 melanoma 세포가 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(Table I). 이상의 결과를 종합해 볼 때 산수유 클로로포름 주줄물의 농도가 증가함에 따라 B16/F10 melanoma 세포의 분열 증식을 억제하여 세포 사멸을 유도한 것으로 사료된다.
- 이와 더불어 세포막 지질로부터 ceramide의 유리, 미토콘드리아의 cytochrome C의 유리 현상과 caspase 단백질 분해효소의 활성화를 동반한다(Buja, 1993; Kerschmann, J 995; Nagata, 2000). 본 연구에서 DNA fragmentation 실험을 실시한 결과 cell sigaling에 의한 자발적이고 능동적 사멸 현상의 하나인 DNA 분절회는 명확히 관찰되지 않았으며, DNA tugging 현상이 관찰되었디-. DNA tugging현상도 미세하고 다양하게 분절화된 DNA fragment의 연속적 끌림의 한 현상이므로, 이를 확인하기 위하여 Hoechst 염색(Araki, 1987; Crissman, 1987; Latt, 1976)을 실시하여 염색질의 응축과 분절 화를 형광 현미경으로 관찰한 결괴-, B16/F10 melanoma 세포에서 염색질 응축과 분절화 현상이 관찰되었다.
- 2에서 보여지듯 시료의 농도가 증가함에 따라 세포의 분열 증식은 점차적으로 감소하였으며 세포 사멸은 증가하였다. 산수유 클로로포름 추출물에 노출된 세포들의 형태학적인 특징을 현미경 하에서 관찰한 결과 세포 사멸에 의한 세포막 외부 용기의 돌출과 응축 현상을 볼 수 있었다(Fig. 3). 이러한 세포의 사멸 현상은 시료 성분이 B16/F10 melanoma 세포의 성장과 분열 증식을 억제시키면서 세포 사멸을 유도하는 증거라고 보여 진다.
- condensation의 변화를 측정하였다. 산수유 클로로포름 추출물을 농도별로 처리 한 후 24시간, 48시간 배양한 B16/F10 melanoma 세포의 생존율은 대조군에 비해 농도 의존적으로 감소하며 억제되었고 세포의 형태 학적관찰에서도 농도 의존적으로 세포 사멸(죽음)에 의한 세포막 외부 융기의 돌출과 세포 응축 현상이 관찰되었다. 세포의 죽음에는 외부의 자극에 의해 일어나는 세포의 타살 적 죽음과 자발적 죽음으로 나뉘며, 자발적 사멸(programmed cell death)은 다양한 형태적, 생화학적 변화들을 동반한다.
- 의해 나타니는 현상인지를 확인하기 위해 apoptosis의 특징인 핵 염색질의 농축을 조사하였다. 산수유 클로로포름 추출물이 150㎍/ml의 농도가 되도록 B16/F10 melanoma 세포에 48시간 처리한 후, Hoechst 염색 법으로 형광 현미경하에서 세포의 염색질 응축과 분절화 현상이 관찰되었다(Fig. 5).
- 1㎍//ml~최고 150㎍//ml 처리시 유의할 만한 변화를 나타내었다. 이 결과를 다시 확인하기 위하여 trypan blue 방법으로 클로로포름 추출물을 처리하고 세포수를 조사해본 결과 MTT 방법의 결과와 마찬가지로 농도가 층가함에 따라 유의할 만한 감소를 나타내었으며(Fig. 2), 세포의 형태학적 변화를 관찰해 본 결과 대조군과 실험군 사이에 유의성 있는 차이를 나타내었다(Fig. 3). 더불어 산수유의 구성 화합물 중 알려진 단일 물질과 클로로포름 추출물을 B16/F10 melanoma 세포에 대해 MTT방법으로 세포 생존율을 비교, 측정해 본 결과 구성 회합물 중 Ursolic acid 에 의해 B16/ F10 melanoma 세포가 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(Table I).
- 더불어 산수유의 구성 화합물 중 알려진 단일 물질과 클로로포름 추출물을 B16/F10 melanoma 세포에 대해 MTT방법으로 세포 생존율을 비교, 측정해 본 결과 구성 회합물 중 Ursolic acid 에 의해 B16/ F10 melanoma 세포가 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(Table I). 이상의 결과를 종합해 볼 때 산수유 클로로포름 주줄물의 농도가 증가함에 따라 B16/F10 melanoma 세포의 분열 증식을 억제하여 세포 사멸을 유도한 것으로 사료된다.
- DNA tugging현상도 미세하고 다양하게 분절화된 DNA fragment의 연속적 끌림의 한 현상이므로, 이를 확인하기 위하여 Hoechst 염색(Araki, 1987; Crissman, 1987; Latt, 1976)을 실시하여 염색질의 응축과 분절 화를 형광 현미경으로 관찰한 결괴-, B16/F10 melanoma 세포에서 염색질 응축과 분절화 현상이 관찰되었다. 이상의 결과를 종합해보면 산수유의 클로로포름 추출물은 B16/F10 melanoma 세포의 분열 증식을 억제, 차단하여 세포의 죽음을 유도하는 것으로 사료되는 바이다.
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