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문제 정의
- 본 연구에서는 MA0 저해 활성을 나타내는 자생식물을 이용하여 항우울, 항피로, Parkinson's disease 등의 중추 신경계와 관련한 질환의 치료제 개발 및 운동능력 향상을 위한 건강기능식품 소재 개발연구의 일환으로 동물을 이용한 시험관실험에서 오디(상심자) 메탄올 추출물이 추출물 수준에서 MA0 저해활성을 갖는 것을 확인하였으며 경구투여를 통한 in vivo 실험을 통해 체내 MA0 활성에 미치는 영향을 확인하였다.
제안 방법
- 경구투여용 시료의 조제 - 건조한 상심자 l(X)g을 가정용 분쇄기를 이용하여 분말로 만들고 여기에 약 800ml의 80% 에탄올 용액을 가하여 환류냉각하면서 100℃에서 6시간씩 3회 반복하여 가열 추출하였다. 탈지면으로 여과하고 여액을 40℃ 수욕상에서 감압 농축하여 에탄올 추출물 17.
- 투여하였다. 대조군에는 같은 조건으로 증류수 4ml씩을 경구 투여하였다. 이 양은 시료 건조 중량으로 동물 체중 당 0.
- 상심자 메탄올 추출 및 용매 분획 건조한 약재용 상심자 100 g을 정량하여 가정용 분쇄기로 1 분간 마쇄하여 분말로 만들고 여기에 80% 메탄올 1000ml를가하여 95℃ 수욕상에서 환류냉각하면서 6시간 가열추출 하였다. 실온으로 식힌 후 여과하고 그 박을 80% 메탄올로 세척하여 여액이 1000ml 되게 하고 45℃ 수욕 상에서 감압농축하여 메탄올 추출물 1500 mg을 얻었다.
- 8 mg이었다. 상심자는 비타민과 유기산이 풍부한 열매로서 생리활성을 나타내는 것으로 알려진 성분에 대한 연구가 지금까지 보고된 바가 없으므로 활성 성분에 대한 구체적인 성분연구를 시도할 목적으로 상법에 따라 용매 분정상 동물과 스트레스 상태인 동물에 대한 약물의 효과가 서로 유사한 경향으로 나타나는 것을 확인하였고 시험관 내에서 한성약물이 MA0-A 및 MAO-B의 효소활성을 강력히 저해하는 것을 확인한 바 있으므로7) 상심자 추출물이 같은 경향으로 나타날 것으로 예상하고 시험관 내에서 MA0-A 및 MAO-B의 활성에 대한 효과를 측정하여 보았다.획한 각 분획을 대상으로 효소 활성에 대한 저해 효과를 측정하였다.
- 시료의 경구 투여 - 동결건조한 상심자 분말 10 mg을 증류수 1ml에 녹이고 이 액을 실험 하루 전에 절식시킨 동물에게 전날 오후와 실험 당일 2시간 전에 2회에 걸쳐 4ml씩 경구 투여하였다. 대조군에는 같은 조건으로 증류수 4ml씩을 경구 투여하였다.
- 시료의 추출 및 검액 조제 - 건조한 약재용 상심자 100g을 정량하여 가정용 분쇄기로 1분간 마쇄하여 분말로 만들고 여기에 80% 메탄올 1000mZ를 가하여 95℃ 수욕 상에서 환류 냉각하면서 6시간 가열 추출하였다. 실온으로 식힌 후 여과하고 그 박을 80% 메탄올로 세척하여 여액이 1000 m/되게 하고 45℃ 수욕상에서 감압 농축하여 메탄올 추출물을 얻었다.
- 실험동물에게 대표적인 한성약물인 황련을 경구로 투여했을 때 MA0-A는 그 활성이 농도의존적으로 증가하였으며 MAO-B의 경우 역시 농도의존적으로 활성이 현저히 감소한다는 사실을 보고한 바 있으며7) 한성약물인 상심자를 경구로 투여했을 때 운동 중 동물 체내의 MA0 활성에 미치는 효과가 황련과 비슷하게 나타날 것으로 기대하고 상심자 추출물을 경구투여한 흰쥐의 뇌와 간에서 MAO-A 및 MAO-B의 활성 변화를 측정하였다.
- 실험동물에게 상심자 메탄올 추출물을 경구투여한 후 동물의 체내에서 일어나는 MA0의 활성 변화를 관찰하였다. 한편, 상심자 추출물의 용매 분획물들이 시험관 내에서 효소 활성에 미치는 영향을 비교 관찰하였다.
- 실온으로 식힌 후 여과하고 그 박을 80% 메탄올로 세척하여 여액이 1000 m/되게 하고 45℃ 수욕상에서 감압 농축하여 메탄올 추출물을 얻었다. 이 추출물을 상법에 따라 분획하여 클로로포름 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획, 물 분획을 각각 얻었다. 각 분획을 10mg/ml 용액이 되도록 증류수로 녹이고 이 액을 원액으로 l(10mg/m/), 1/2(5mg/mZ), 1/4 (2.
- 일반 실험실 조건에서 적응시킨 SD계 흰쥐 6마리를 한 군으로 하여 12시간 전에 절식시킨 동물에게 위에서 언급한 방법으로 조제한 상심자 동결건조 분말을 2회 경구투여하고 2시간이 경과한 후 해부하여 좌심실에서 채혈하여 실혈시킨 후 뇌와 간을 적출하여 MAO-A, MAO-B의 활성 변화를 측정하였다. 한편 약물 대신 증류수를 투여한 동물의 효소 활성을 따로 측정하여 약물에 의한 효소 활성의 변화에 대한 대조군으로 하였다.
- 측정하였다. 한편 약물 대신 증류수를 투여한 동물의 효소 활성을 따로 측정하여 약물에 의한 효소 활성의 변화에 대한 대조군으로 하였다.
- 관찰하였다. 한편, 상심자 추출물의 용매 분획물들이 시험관 내에서 효소 활성에 미치는 영향을 비교 관찰하였다.
- 상심자는 비타민과 유기산이 풍부한 열매로서 생리활성을 나타내는 것으로 알려진 성분에 대한 연구가 지금까지 보고된 바가 없으므로 활성 성분에 대한 구체적인 성분연구를 시도할 목적으로 상법에 따라 용매 분정상 동물과 스트레스 상태인 동물에 대한 약물의 효과가 서로 유사한 경향으로 나타나는 것을 확인하였고 시험관 내에서 한성약물이 MA0-A 및 MAO-B의 효소활성을 강력히 저해하는 것을 확인한 바 있으므로7) 상심자 추출물이 같은 경향으로 나타날 것으로 예상하고 시험관 내에서 MA0-A 및 MAO-B의 활성에 대한 효과를 측정하여 보았다.획한 각 분획을 대상으로 효소 활성에 대한 저해 효과를 측정하였다. 에틸아세테이트 분획에서 가장 강한 MAO-A 및 MAO-B에 대한 저해 활성이 확인되었으며 에틸아세테이트 분획의 MAO-A 및 MA0-B에 대한 IC50 값은 각각 0.
- 효소 활성 측정 - 조제한 효소원을 사용하여 문헌의 방법에 준하여 효소 활성을 측정하고 각 실험군의 대조군을 기준으로 하여 효소 활성의 변화를 정해진 수식에 따라 계산하였다.6,7)
- 효소원의 조제 - 흰쥐의 뇌 조직을 이용하여 전보에 보고한 방법대로 조제한 단백질을 희석하여 효소원으로 사용하였다.6)
대상 데이터
- 5주령의 Sprague Dawley계 웅성 흰 쥐를 (주)바이오제노믹스 사에서 공급받아 온도 23±3℃, 습도 50±10%, 12시간 주기로 조명을 조절하는 동물사육실에서 일반 고형 사료와 물을 자유롭게 공급하면서 2~4주간 적응시킨 후 실험에 이용하였다.
- 실험에 사용한 상심자는 서울시 소재 경동시장 대덕한의원에서 건조시킨 한약재를 구입하여 사용하였고 시료의 일부는 표준품(NP20-187)으로 보관하였다. 효소 활성 측정에 사용한 세로토닌, 벤질아민, 이온교환수지 AmberUte CG-50 등은 Sigma사 제품을 사용하였고 기타 컬럼 크로마토그라피용 용매 및 시료 추출용 용매는 국산 특급 시약을 사용하였다.
- 표준품(NP20-187)으로 보관하였다. 효소 활성 측정에 사용한 세로토닌, 벤질아민, 이온교환수지 AmberUte CG-50 등은 Sigma사 제품을 사용하였고 기타 컬럼 크로마토그라피용 용매 및 시료 추출용 용매는 국산 특급 시약을 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 SAS 통계 프로그램을 이용하였으며9) Student t-test를 사용하여 유의차 검정을 하였다. 모든 통계는 5% 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- The reaction mixture for MAO-B assay (final volume 1 ml) contained appropriate amount of the crude enzyme, and substrate (benzylamine). The enzymatic activity was measured according to the spectrophotometric procedure as described in the experimental method.
- 단백질 함량은 bovine serum albumin을 표준물질로 하고 Bradford's method를 이용하여 측정하였다.10)
- 효소 활성 측정 - MAO-A 및 MAO-B의 효소원 조제 및 효소 활성 측정은 앞에서 서술한 방법에 준하였다.
- 효소 활성 측정 - McEwen 등의 방법에 준하여 효소 활성을 측정하고 각 실험군의 대조군을 기준으로 하여 효소 활성의 변화를 정해진 수식에 따라 계산하였다.8)
- 효소원의 조제 - 흰쥐의 간 미토콘드리아 분획을 상법에 따라 분리하여 효소원으로 사용하였다.
성능/효과
- 1. 동물에게 상심자 추출물을 경구투여했을 때 MAO의 활성을 변화시키며, MAO-/ 활성이 증가되고 MAO-B는 활성이 감소하는 것으로 관찰되었다.
- 알려져 있다.2) 동의보감에는 소갈을 다스리고 오장을 이롭게 하며 뽕나무의 정(精)이 모여있다고 적고 있다.3) 오디는 각종 비타민류, 유기산류, 당류 등의 성분이 보고 되어 있고 활성 성분에 대한 연구보고는 아직 없다.
- 2. 상심자 메탄올 추출물은 시험관 내에서 MAO-A 및 MAO-B의 효소 활성을 현저히 저해하는 것으로 나타났으며 메탄올 추출물의 MAO-A 및 MAO-B에 대한 IC50 값은 각각 6.8 mg과 3.8 mg이었다.
- 3. 상심자 용매분획을 대상으로 효소 활성에 대한 저해 효과를 측정하여 에틸아세테이트 분획에서 가장 강력한 MAO-A 및 MA0-B에 대한 저해 활성이 확인되었으며 에틸아세테이트 분획의 MAO-A 및 MAO-B 에 대한 IC50 값은 각각 0.90 mg 이었다.
- 4. 부탄올 분획은 MAO-A 및 MAO-B에 대해 비교적 강한 저해 활성을 나타냈으며 각각의 IC50 값은 1.10 mg과 1.90 mg이었다. 물 분획의 경우는 MAO-A와 MAO-B에 대해 약하게 저해활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
- 5. 이상의 결론으로부터 상심자(오디)는 MAO 저해 활성을 나타내는 우수한 식물로 운동능력 향상, 피로회복, 우울증 개선, Parkinson' disease 등을 개선할 수 있는 건강기능식품 소재로서의 활용 가능성을 확인하였다.
- Fig. 1에 나타난 것처럼 상심자 추출물 대신 증류수를 투여한 대조군의 효소 활성을 기준으로 비교해보면 통계적 유의 차이는 없지만 MA0-A는 상심자 추출물에 의해서 효소 활성이 증가되는 것으로 나타났으며 MAO-B는 효소 활성이 감소하는 경향을 나타냈다. 이 결과는 한성 및 열성 스트레스 상태에 있는 동물에게 약물을 경구투여하고 효소 활성의 변화를 관찰한 실험에서 확인된 결과와 같은 경향을 나타내는 것으로 확인되었다.
- 사용하여 유의차 검정을 하였다. 모든 통계는 5% 수준에서 유의성을 검정하였다.
- 9mg이었다. 물 분획의 경우는 MAO-A와 MAO-B에 대해 약하게 저해활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 상심자는 약용보다는 식용으로 이용되어 왔으므로 독성이 없을 것으로 생각되며 식용으로 이용되어 온 식물들이 특징적으로 아주 강한 생리 활성을 나타내지 않는 것을 고려할 때 아주 훌륭한 MAO 저해활성을 나타내는 것으로 이해할 수 있다.
- 1 mg으로 나타났으나 고농도에서는 오히려 활성이 저하되는 것으로 나타났으며 MAO-B에 대한 저해 활성은 나타나지 않았다. 부탄올 분획은 MA0-A 및 MAO-B에 대해 비교적 강한 저해활성을 나타냈으며 각각의 IC50 값은 1.1 mg과 1.9mg이었다. 물 분획의 경우는 MAO-A와 MAO-B에 대해 약하게 저해활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
- 상심자 메탄올 추출물은 시험관 내에서 MAO-A 및 MAO-B의 효소 활성을 현저히 저해하는 것으로 나타났다. 메탄올 추출물의 MAO-A 및 MAO-B에 대한 IC50 값은 각각 6.
- 획한 각 분획을 대상으로 효소 활성에 대한 저해 효과를 측정하였다. 에틸아세테이트 분획에서 가장 강한 MAO-A 및 MAO-B에 대한 저해 활성이 확인되었으며 에틸아세테이트 분획의 MAO-A 및 MA0-B에 대한 IC50 값은 각각 0.90 mg이었다. 클로로포름 분획의 경우 낮은 농도에서 MAO-A에 대한 저해 활성을 나타내 IC50 값이 1.
- 이 결과는 한성 및 열성 스트레스 상태에 있는 동물에게 약물을 경구투여하고 효소 활성의 변화를 관찰한 실험에서 확인된 결과와 같은 경향을 나타내는 것으로 확인되었다. 즉 한성약물을 경구투여하고 한성 및 열성 스트레스를 유발시킨 경우 열성 스트레스에 의해 감소된 MAO-A의 활성을 현저히 증가시킴으로서 병증의 개선 효과를 기대하게 하는 반면, 한성 스트레스 유발 시에도 MAO-A의 효소 활성은 증가되어 기론에 의한 한의학의 약리학적 해석이 MA0 활성 변화로 설명될 수 있음을 확인한 저자 등의 이전 실험결과와 일치되는 결과임을 알 수 있었다.(1)
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