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문제 정의
- 만성항염작용, 항위염 및 위궤양 활성과 간손상에 대한 작용을 시험한 결과, 소염작용이 탁월한 것을 확인한 바 있다.8) 본보에서는 오리나무 수피 엑스에서 소염 활성물질 분리를 하기 위한 전 단계로써 엑스가 어떠한 소염 및 진통작용을 갖는지 확인하고자 시험을 실시하였다.
- Adjuvant 유발 관절염 - 흰쥐의 Adjuvant 유발 관절염에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 본 실험을 실시하였다. 즉, 체중 130-160g 웅성 흰 쥐의 10마리를 1군으로 하여 Claude등의 방법11)에 따라 실시하였다.
제안 방법
- 120~ 160 g 웅성 흰 쥐의 뒷 발바닥에 1% carrageenan 0.1 mf을 피하주사하여 부종을 유발시키고, 검체는 carrageenan 주사 30 분 전에 경구투여하였다. Carrageenan 주사 30분, 1시간, 2 시간, 3시간에 4회에 걸쳐 부종의 용적을 plethysmometer로측정 한 다음, 주사전의 용적을 기준으로 하여 그 증가율을 다음 식으로 계산하여 부종 억제 정도를 검정하였다.
- 1 ml/10 g씩 생쥐의 복강내에 주사하여 혈관투과성을 증대 켰다. 20분 후 복강액을 채취하여 3, 000 rpm에서 10분간 원심분리하여 이물질을 제거히고 자외부 흡수 스팩트럼 (585 nm)에서 혈관투과성의 정도를 검정하였다. 검체는 Evans blue 주사 30분 전에 경구투여하였다.
- 1 mf을 피하주사하여 부종을 유발시키고, 검체는 carrageenan 주사 30 분 전에 경구투여하였다. Carrageenan 주사 30분, 1시간, 2 시간, 3시간에 4회에 걸쳐 부종의 용적을 plethysmometer로측정 한 다음, 주사전의 용적을 기준으로 하여 그 증가율을 다음 식으로 계산하여 부종 억제 정도를 검정하였다. 대조약물로는 ibuprofen 200mg/kg을 경구투여하여 비교하였다.
- 20분 후 복강액을 채취하여 3, 000 rpm에서 10분간 원심분리하여 이물질을 제거히고 자외부 흡수 스팩트럼 (585 nm)에서 혈관투과성의 정도를 검정하였다. 검체는 Evans blue 주사 30분 전에 경구투여하였다. 대조약물로는 ibuprofen 200mg/kg을 경구투여하여 비교하였다.
- Carrageenan 주사 30분, 1시간, 2 시간, 3시간에 4회에 걸쳐 부종의 용적을 plethysmometer로측정 한 다음, 주사전의 용적을 기준으로 하여 그 증가율을 다음 식으로 계산하여 부종 억제 정도를 검정하였다. 대조약물로는 ibuprofen 200mg/kg을 경구투여하여 비교하였다.
- 1 ml씩을 흰 쥐의 발바닥에 피하주사하여 염증을 유발시키고, 2시간 후에 검체를 투여한 다음, 일정 시간 후에 analgesymeter로 동통역치(g)를 측정하였다. 동통 역치는 흰쥐의 발바닥에 16g/sec의 속도로 서서히 압력을 가하여, 흰쥐가 발을 빼려고 하거나 아파서 몸을 뒤틀 때를 동통반응으로 하였다. 진통작용은 대조군 동통역치에 대한 %를 구함으로써 나타내었다.
- 시약 및 기기 - 시 약은 ethanol, acetic acid (Duksan Chemical Co.), Brewer's yeast, carrageenan (λ-type), Evans blue, ibuprofen (Sigma Chem. Co., USA), Complete Freund's adjuvant (Difco Lab.)을 사용하였으며, 검체는 식염수에 용해하여 경구로 투여하였다. 기타시약은 일급시약을 사용하였다.
- 잘 씻어 건조한 오리나무 수피 830 g에 70% 에탄올을 가하여 수욕상에서 5시간, 4회 추출한 후 여과하여 여액을 농축, 건조하여 제조하였으며 수율은 13.9%였다.
- 잘 씻어 말린 오리나무 수피 830 g을 에탄올로 추출하여 115g(13.9%)의 엑스를 얻었으며, 이 엑스의 소염 및 진통작용 시험을 실시하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 즉, 체중 130-160g 웅성 흰 쥐의 10마리를 1군으로 하여 Claude등의 방법11)에 따라 실시하였다. 즉, Freund's com plete adjuvant (Mycobacterium tuberculosis) 0.1 ml/rat를 흰 쥐의 오른쪽 뒷 발바닥에 피하주사하고, 18일 이후부터 28 일 되는 날까지 검체를 투여하였으며, 약물투여 시작일부터 3일 간격으로 10일간 plethysmometer로 족부종을 측정하였다. 대조약물로는 ibuprofen 200 mg/kg을 사용하였다.
- 실시하였다. 즉, 생쥐에 0.7%의 acetic acid 0.1 ml/10 g을 복강으로 투여한 10분 후부터 10분간 writhing 증상의 발생수를 계수하였다. 검체는 초산 투여 30분 전에 경구로 투여하였다.
- 이 방법은 염증부위의 동통에 대한 감수성을 증대시켜 그 증대된 감수성이 진통제에 의해 억제되는 것에 기초한 것이다. 즉, 흰쥐를 하룻밤 절식시킨 뒤, analgesymeter를 이용하여 300g의 압력에도 반응하지 않는 흰쥐를 먼저 제외시킨 다음, 20% brewer's yeast-생리식염수 현탁액 0.1 ml씩을 흰 쥐의 발바닥에 피하주사하여 염증을 유발시키고, 2시간 후에 검체를 투여한 다음, 일정 시간 후에 analgesymeter로 동통역치(g)를 측정하였다. 동통 역치는 흰쥐의 발바닥에 16g/sec의 속도로 서서히 압력을 가하여, 흰쥐가 발을 빼려고 하거나 아파서 몸을 뒤틀 때를 동통반응으로 하였다.
대상 데이터
- 1 ml/rat를 흰 쥐의 오른쪽 뒷 발바닥에 피하주사하고, 18일 이후부터 28 일 되는 날까지 검체를 투여하였으며, 약물투여 시작일부터 3일 간격으로 10일간 plethysmometer로 족부종을 측정하였다. 대조약물로는 ibuprofen 200 mg/kg을 사용하였다.
- 실험동물 - 삼양동물(주)에서 분양받은 체중 160~220g의 Sprague-Dawley계 웅성 흰쥐 및 20~25 g의 ICR계 생쥐를 22±2℃에서 2주간 이상 사육하여 적응시킨 뒤 실험에 사용하였으며, 동물실 내의 명암은 12시간씩으로 자동조절시켰고, 고형사료(삼양사료) 및 물은 충분히 공급하였다.
- 오리나무 수피에탄올 엑스의 제조 - 시험에 사용한 오리나무 수피는 서울시 소재 경동시장에서 국내산을 구입하였다. 잘 씻어 건조한 오리나무 수피 830 g에 70% 에탄올을 가하여 수욕상에서 5시간, 4회 추출한 후 여과하여 여액을 농축, 건조하여 제조하였으며 수율은 13.
이론/모형
- Carrageenan유발 횐쥐 족부종 시험 - Winter등의 방법9)에 따라서 오리나무 수피에탄올 엑스의 흰쥐의 carrageenan- induced paw edema에 대한 억제작용을 실시하였다. 120~ 160 g 웅성 흰 쥐의 뒷 발바닥에 1% carrageenan 0.
- 검체의 진통효과를 평가하기 위하여 초산처치로 유도되는 복부의 수축반응을 지표로 하는 초산법을 이용하였다. 초산법은 Koster등이 초산을 이용한 writhing syndrome 반응을 abdominal contraction response라 하여 진통약물 검정에 유용한 방법의 하나로, 이 반응의 억제여부를 확인하여 진통 효과를 평가하였다.
- 항염증 효과를 검정한다. 따라서 혈관투과성 항진의 염증병태모델의 작성을 위하여 기염제로써 acetic acid를 투여하고, 투과성 항진의 지표로 복강내로 유출하는 Evans blue 의 색소량을 지표로 하였다. 대조군의 복강내 Evans blue 양은 86.
- 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 염증으로 인한 통증에 대한 진통효과실험인 Randall-SeHtto 시험법과 초산유발 writhing syndrome 실험을 통하여 진통효과도 확인되었다. 이와 같은 효능을 구체적으로 활용하고자, 본 연구 결과는 앞으로 소염 및 진통 작용과 관련된 활성물질 분리, 동정 및 약리활성 기전연구를 실시하기 위하여 기초 연구자료로 이용할 것이다.
- 모세혈관 투과성 억제작용 - Winter등의 방법9)에 준하여, 검체가 단백질 친화성 색소의 모세혈관 투과성에 미치는 영향을 검토하였다. 즉, Evans blue 1% 용액 0.
- 원심분리기는 Hanil Co.의 UNION 32R을 spectophotometer는 Bio-Rad의 ELISA reader를 사용하였으며, 부종즉정에 사용한 plethysmometer와 Rabdall-Selitto assay에 사용한 analgesymeter는 Ugo Basil (Italy)의 제품을 사용하였다.
- 실시하였다. 즉, 체중 130-160g 웅성 흰 쥐의 10마리를 1군으로 하여 Claude등의 방법11)에 따라 실시하였다. 즉, Freund's com plete adjuvant (Mycobacterium tuberculosis) 0.
- 초산 유발 writhing syndrome 시험 - 초산유발 writhing syndrome 시험은 Koster 등의 방법13)에 준하여 실시하였다. 즉, 생쥐에 0.
성능/효과
- 시험이다.14) 흰쥐에서 carrageenan유발 부종실험을 실시한 결과, 오리나무 수피 엑스 500 및 1, 000 mg/kg을 투여한 결과, 1, 000 mg/kg을 투여한 군에서 검체 투여 1, 2, 3시간째에 각각 32.8, 24.4 및 46.9%의 유의성 있는 부종억제효과를 나타내었으며, 특히 1 시간 및 3시간째에는 대조약물인 ibuprofen 보다 더 높은 부종 억제효과를 나타내었다(Fig. 1).
- 15) 또한 실험적 염증 중에서 비교적 만성의 경과를 취하고 그 발현기전에 면역계가 관여하는 것이 인정되고 있는 것이 흰쥐 adjuvant 관절염이다. 관절염을 유발한 흰쥐에 검체 500 및 l, 000mg/kg을 투여한 결과, l, 000mg/kg 투여시 검체투여 6일과 10일째 되는 날에 225 및 18.7%의 억제효과를 보였으며, 대조약물인 ibuprofen 200 mg/kg 보다 강한 작용을 나타내었다(Table I).
- 따라서 혈관투과성 항진의 염증병태모델의 작성을 위하여 기염제로써 acetic acid를 투여하고, 투과성 항진의 지표로 복강내로 유출하는 Evans blue 의 색소량을 지표로 하였다. 대조군의 복강내 Evans blue 양은 86.8(ig/mouse였으나, 오리나무 수피 엑스를 투여한 경우 500mg/kg 및 1,000 mg/kg 투여 시 15.3 및 28.0%의 용량의존적인 억제작용을 나타내어 소염작용 중 혈관 투과성 억제작용의 영향이 있음을 확인하였다(Fig. 2).
- 오리나무 수피에서 새로운 활성의 검색 및 활성성분 분리의 일환으로 오리나무 수피에탄올 엑스의 관절염에서 급 . 만성항염작용, 항위염 및 위궤양 활성과 간손상에 대한 작용을 시험한 결과, 소염작용이 탁월한 것을 확인한 바 있다.8) 본보에서는 오리나무 수피 엑스에서 소염 활성물질 분리를 하기 위한 전 단계로써 엑스가 어떠한 소염 및 진통작용을 갖는지 확인하고자 시험을 실시하였다.
- 이 방법은 소염성 진통약에서 마약성 진통약까지 넓게 적용시킬 수 있는데, 마약성 진통약에서는 정상발과 염증발, 양쪽의 역치를 모두 상승시키지만, 말초에 작용점을 가지는 소염성 진통약은 염증 발의 동통 역치만을 상승시킨다. 본 실험에서의 진통효과는 염증을 일으킨 발에서만 측정하였는데 , 그 결과로 검체 대신 식염수만을 투여한 대조군의 경우, 역치는 염증을 일으키기 전 17.6 g에서 30분, 1시간, 2시간 및 3시간 째에 각각 6.3, 6.3, 7.1 및 5.5로 나타났다. 오리나무 수피 엑스 투여군의 경우, 500mg/kg 투여시에는 대조군과 큰 차이를 나타내지 않았으나, 1, 000mg/kg을 투여하였을 때 30분, 1시간 및 2시간째에 대조군에 비교하여 각각 48.
- 5로 나타났다. 오리나무 수피 엑스 투여군의 경우, 500mg/kg 투여시에는 대조군과 큰 차이를 나타내지 않았으나, 1, 000mg/kg을 투여하였을 때 30분, 1시간 및 2시간째에 대조군에 비교하여 각각 48.9, 22.9 및 50.9%의 역치 증가율을 나타내었으며, 3시간 째에는 대조군에 비교하여 137.5%의 역치 증가율을 나타내어 대조약물인 ibupro- fen의 효과와 동일한 유의성 있는 효과를 나타내었다(Fig. 3).
- 오리나무 수피에탄올 엑스의 약리활성 검색 실험에서 오리나무 수피 엑스가 급성 염증인 carrageenan 유발 족부 종을 억제하고, 모세혈관 투과성을 감소시킴으로써 급성 염증에 대한 소염작용이 있음을 확인할 수 있었고, 만성 관절염 모델인 adjuvant 유발 관절염에서 부종을 억제함으로써 오리나무 수피 엑스가 급성 및 만성 염증 모델에 대하여 우수한 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 염증으로 인한 통증에 대한 진통효과실험인 Randall-SeHtto 시험법과 초산유발 writhing syndrome 실험을 통하여 진통효과도 확인되었다.
- 초산법은 Koster등이 초산을 이용한 writhing syndrome 반응을 abdominal contraction response라 하여 진통약물 검정에 유용한 방법의 하나로, 이 반응의 억제여부를 확인하여 진통 효과를 평가하였다. 초산으로 복강 염증 유발 10분 후 10분간 writhing syndrome의 횟수를 측정한 결과, 대조군은 21.9회의 증상을 나타내었으며, 오리나무 수피 엑스의 경우 500mg/kg 및 1,000 mg/kg 투여 시에 각각 20.5 및 38.7%의 용량 의존적인 증상억제 효과를 나타내었다.
후속연구
- 또한 염증으로 인한 통증에 대한 진통효과실험인 Randall-SeHtto 시험법과 초산유발 writhing syndrome 실험을 통하여 진통효과도 확인되었다. 이와 같은 효능을 구체적으로 활용하고자, 본 연구 결과는 앞으로 소염 및 진통 작용과 관련된 활성물질 분리, 동정 및 약리활성 기전연구를 실시하기 위하여 기초 연구자료로 이용할 것이다.
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