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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 전통적으로 향기성분으로 사용된 회향, 유향 그리고 노간주에 대해 초임계 추출법을 통해 정유성분을 추출하여, 기존에 추출법을 통해 추출할 수 없는 특정의 정유성분을 추출하고, 이의 생체 조절 기능을 검증하기 위해 항암, 항 돌연변이 신경세포 활성에 대한 실험을 통해 효과를 검증함으로써 이들의 생체 조절자로서의 가능성을 부여하고자 하였다.
제안 방법
- 주었다. 36시간 배양한 후 5 ㎕/㎖의 6TG를 포함하는 배지로 교체하여 48시간 더 배양한 뒤 MTT 방법에 의하여 실험군의 항 돌연변이 원성을 측정하였다.
- SRB as say를 이용하여 정 상 세 포에 대한 각 sample 농도에서 세포독성을 측정하고, 또한 각 암 세포주의 생육 억제 활성을 측정한 후 각 농도에서의 세포 독성에 대한 암세포 생육 억제 활성의 비로 selectivity를 계산한다.
- SRB(sulforhodamine B) as say는 세 포 단백 질을 염색하여 세포의 증식이나 독성을 측정하는 방법으로 실험 대상 세포인 A549, AGS, HEL299(10% FBS, RPMI 1640 배지)의 세포 초기 접종농도를 4-5X104 cell/㎖으로 96 well plate의 각 well에 100㎕씩 첨가하여 24시간 동안 배양(37℃, 5% CQ)한 후, 각각의 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 gli 로 100㎕씩 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 후에 상등액을 제거하고 차가운 10%(w/v) TCA(trichloroacetic acid ) 100㎕를 가하여 4℃에서 1시간동안 방치한 후 증류수로 4~5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 l%(v/v) acetic acid에 녹인 0.
- 각 시료로부터 초임계 추출한 각각의 정유 성분을 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 잉Q 의 농도로 투여하여 인간 정상 폐세포주인 HEL299에 대한 세포 독성과 인간 폐암세포주인 A549 그리고 인간 위암세포주인 AGS에 대한 생육 저해능을 알아보았다. Fig.
- 시료는 증류수로 세척한 후 음건한 다음, 세절기를 이용하여 가늘게 절단하였다. 그리고 초임계 추출장치의 vessel부로 시료를 넣기 위해 살균된 거즈를 이용하여 100g 씩 담아 누출이 없게 잘 밀봉한 다음 vessel 부에 투입하였다. 추출조건으로 vessel부의 압력은 3000~3500psi이며 온도는 35~45℃로 유지하였다.
- 0 gli 로 100㎕씩 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 후에 상등액을 제거하고 차가운 10%(w/v) TCA(trichloroacetic acid ) 100㎕를 가하여 4℃에서 1시간동안 방치한 후 증류수로 4~5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 l%(v/v) acetic acid에 녹인 0.4%(w/v) SRB용액을 100㎕씩 첨가하고 상온에서 30분 동안 염색시켰다. 결합되지 않은 SRB 염색액 은 1% acetic acid로 4~5회 정도 세척, 건조시킨 후에 10 mM Tris buffer 100㎕를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다(Rubinstein et al.
- 관찰하였다. 세포의 생육활성은 세포들이 사멸기에 접어든 시료투여 8일 후 측정한 세포 생존률을 기초로 하였다.
- 시료를 각 농도별로 100㎕를 첨가하여 매일 현미경(X 100) 사진 촬영을 실시하였다. 이 현미경 사진을 이용하여 신경돌기의 길이를 측정하여 본래의 길이로 환산하여 신경돌기의 길이로 하였다.
- 신경돌기를 지니는 세포는 현미경상에서 측정하였다. 신경돌기가 세포동체와 같거나 보다 큰 세포를 신경돌기를 지니는 세포로 하였다. 본 실험에서는 100개 이상의 세포를 측정하였다.
- 각각의 사진에서 신경돌기의 길이가 가장 길게 연장된 세포를 기초로 하여 본 실험에 이용하였다. 신경돌기를 지니는 세포는 현미경상에서 측정하였다. 신경돌기가 세포동체와 같거나 보다 큰 세포를 신경돌기를 지니는 세포로 하였다.
- 사진 촬영을 실시하였다. 이 현미경 사진을 이용하여 신경돌기의 길이를 측정하여 본래의 길이로 환산하여 신경돌기의 길이로 하였다. 각각의 사진에서 신경돌기의 길이가 가장 길게 연장된 세포를 기초로 하여 본 실험에 이용하였다.
- 전통적인 향기치료제로 쓰여온 회향, 유향 그리고 노간주를 사용하여 최근 신기술로 평가되고 있는 초임계 유체추출법을 통해 생체 조절기능을 지닌 기능성 정유 성분을 추출하였다. 기존의 SDE 추출법과 비교하여 추출수율 측면에서 비교적 높은 결과를 얻어내어 정유 추출시 장차 SDE 추출법을 대체할 신기술로 평가되었다.
- 총 7일간의 배양기간동안 매일 생 세포수를 관찰하였으며, 이를 위해 trypan blue dye exclusion 방법으로 세포수를 관찰하였다. 세포의 생육활성은 세포들이 사멸기에 접어든 시료투여 8일 후 측정한 세포 생존률을 기초로 하였다.
- 항 돌연변이원성을 측정하기 위하여 6TG-resistant cell을 5X102 cell/mC의 농도로 24 well plate에 접종하여 24시간 배양 후 배지를 교체하여 주고, 여러 시료와 대조구인 4NQO를 농도별로 투여한 다음 3시간 후 배지를 교체하여 주었다. 36시간 배양한 후 5 ㎕/㎖의 6TG를 포함하는 배지로 교체하여 48시간 더 배양한 뒤 MTT 방법에 의하여 실험군의 항 돌연변이 원성을 측정하였다.
대상 데이터
- 각 시료의 신경분화 활성측정을 위해 pheochromocytoma (PC12) 신경세포주를 이용하였다. 10% FBS를 함유한 RPMI 1640의 기본배지에서 배양된 세포를 0.
- 이 현미경 사진을 이용하여 신경돌기의 길이를 측정하여 본래의 길이로 환산하여 신경돌기의 길이로 하였다. 각각의 사진에서 신경돌기의 길이가 가장 길게 연장된 세포를 기초로 하여 본 실험에 이용하였다. 신경돌기를 지니는 세포는 현미경상에서 측정하였다.
- 본 실험에 사용된 회향(FoeEcu/um vulgare Mill), 유향(BosweUia carteii Birew)은 열매부를 그리고 노간주나무(Juniperus ligida Sieb.)는 줄기부를 사용하였으며, 회향과 유향은 서울에 위치한 경동시장에서 국내산을 구입하였으며, 노간주나무는 임업연구원에서 기증 받아 사용하였다. 시료는 증류수로 세척한 후 음건한 다음, 세절기를 이용하여 가늘게 절단하였다.
- 신경돌기가 세포동체와 같거나 보다 큰 세포를 신경돌기를 지니는 세포로 하였다. 본 실험에서는 100개 이상의 세포를 측정하였다.
- 실험에 사용된 세포주는 Chineses hamster lung cell(CHO V79 strain)로 이 세포주는 Ford와 Yerganian에 의해 어린 hamster의 lung에서 분리되어진 21개의 염색체를 갖는 karyotype(chinese hamster, 2n=22)이다 배양 배지는 Minimum Essential Medium(MEM)배지에 적응시켜 10% fetal bovine serum, 0.25% trypsine, 37.5℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 실험에 사용하기 전에 6-TG resistant 세포를 선별하기 위해 액체질소에서 보관하던 세포를 37.
- 추출물의 성분분석을 위해 GC/MS(8000 top series/Autospec M363 series)를 이용하였으며, 분석 조건은 Table 1과 같다.
성능/효과
- 3은 폐암 세포에 대한 억제능과 선택적 사멸도(selectivity)를 나타낸 그림이다. 3가지 시료 모두 농도 의존적인 저해능을 보였으며, 저농도인 0.4, 0.6 g/ℓ 의 농도에서는 유향이 60%내외로 비교적 높은 암세포 억제능을 보였지만 최대농도 1.0 g/C 에서는 회향이 약 70%로서 다른 시료에 비해 높은 억제능을 보여주었다. 선택적 사멸도는 3가지 시료모두 4~6의 사멸도를 나타내었다.
- 모든 시료에서 농도 의존적으로 억제율이 증가하는 것을 확인하였다. 가장 높은 억제율을 보인 것은 유향으로 최고 농도인 1.0 g/ℓ에서 억제율이 45.3%으로 나타났다. 이는 김(Kim et al.
- 또한 신경돌기 연장실험에서도 모든 시료에서 농도 의존적으로 신경돌기가 연장되었다. 가장 좋은 활성을 보인 것은 회향으로 237 ㎛로 나타나 다른 시료들에 비해 신경돌기 연장능이 높게 나타났다. 이 사실로 기초하여 회양의 초임계 정유 추출물의 휘발성 알콜 계열에 성분들이 신경세포에 대해 강한 활성을 보인다는 것을 확인하였다.
- 모든 시료에서 농도 의존적으로 생육도가 증가하는 것을 볼 수 있었다. 그 중 가장 높은 생육도를 보인 것은 회향의 초임계 추출물로서 9.6 X103 cells/㎖로 다른 시료들보다 높은 생육도를 보였다. 신경돌기 형성세포와 신경돌기연장에 대한 결과에서도 모든 시료가 농도 의존적으로 생육도가 증가했고, 그 중 가장 좋은 활성을 나타낸 것은 최고 농도(1.
- 4는 위암세포에 대한 억제능을 나타낸 그림으로 모든 시료가 농도 의존적인 저해능을 보여주었다. 그 중 가장 높은 저해능을 보인 것은 회향으로 최대농도인 1.0 g/£ 에서 약 80%로서 다른 시료들에 비해 보다 높은 암세포 저해능을 보여주었다. 선택적 사멸도는 4~6으로 나타났다.
- Table 2에 나타내었다. 기존에 사용된 SDE(Simultaneous steam distUlation & extraction)을 통해 주줄 한 정유성분의 수율도 첨가하여 비교한 결과(Kim et al., 2000), 기존 SDE방법에 비해 초임계 추출방법에 의한 정유 성분 추출시 회향의 경우 4.0%(v/w)로서 같은 SDE 추출법을 통해 분리된 2.4%(v/w)보다 초임계 추출법을 통한 분리방법이 더 높은 수율을 나타내었으며, 반면 노간주나무의 경우 SDE 추출법을 통한 수율이 각각 3.2%(v/w)로 초임계 정유 추출법의 2.4%(v/w)보다 높게 나타난 것을 확인하였는데, 이는 기존의 SDE 추출법의 경우 용매를 사용하여 증류하는 방식이기 때문에 시료에 사용된 용매에 용해되는 성분이 대량으로 존재할 경우, 용매를 사용하지 않는 초임계 추출법보다 높은 추출 수율을 얻을 수 있을 것이라 사료되며, 노간주나무의 경우는 목질부이며, 반면 유향이나 회향은 과실부이므로 추출용매가 사용된 SDE 추출법 이 초임계 CO?를 이용한 추출법보다 높은 수율을 얻을 수 있었으리라 사료된다.
- 기존의 SDE 추출법과 비교하여 추출수율 측면에서 비교적 높은 결과를 얻어내어 정유 추출시 장차 SDE 추출법을 대체할 신기술로 평가되었다. 추출용매를 사용해야 하는 SDE 추출법과는 달리 무색, 무취인 CO2를 이용하여 정유 성분을 분리하는 초임계 추출법은 인체에 무해한 정유 성분을 얻을 수 있다는 것이 가장 큰 장점이라 사료되며, 분리된 정유 물질에 대해 성분 분석 결과 대부분이 휘발성 알코올 계열에 물질임을 확인할 수 있었다.
- 5에 나타내었다. 모든 시료에서 농도 의존적으로 생육도가 증가하는 것을 볼 수 있었다. 그 중 가장 높은 생육도를 보인 것은 회향의 초임계 추출물로서 9.
- 결과를 Table 4에 나타내었다. 모든 시료에서 농도 의존적으로 억제율이 증가하는 것을 확인하였다. 가장 높은 억제율을 보인 것은 유향으로 최고 농도인 1.
- 로부터 정유 성분의 성분분석을 Table 1과 같은 방법으로 수행하였으며 MS data에 대한 비교 및 분석 결과를 Table 3에 나타내었다. 분석 결과는 Table 3에서 나타난 것과 같이 회향은 octyl ester 과 scaleol을 포함한 총 10개의 성분이 확인되었으며 그리고 유향은 1-octanol 과 duvatriendiol을 포함한 종 7개의 성분이 확인되었다. 노간주나무는 cyclopentanol과 longipinene을 포함한 총 9개의 성분과 2개의 이성질체를 확인하였다.
- 노간주나무는 cyclopentanol과 longipinene을 포함한 총 9개의 성분과 2개의 이성질체를 확인하였다. 성분분석 결과 회향과 유향의 성분 대부분이 중복되는 것을 확인하여 2회 반복 분석을 실시하였으나 같은 결과를 보여줌으로서 회향과 유향의 정유성분이 큰 차이가 없는 것을 확인하였다. 반면 노간주나무의 경우에는 이들 2가지의 정유추출물과 일치되는 성분이 거의 나타나지 않았다.
- 6 X103 cells/㎖로 다른 시료들보다 높은 생육도를 보였다. 신경돌기 형성세포와 신경돌기연장에 대한 결과에서도 모든 시료가 농도 의존적으로 생육도가 증가했고, 그 중 가장 좋은 활성을 나타낸 것은 최고 농도(1.0 glU )에서 회향으로 4.0 X103 cells/m{로 나타났다. 또한 신경돌기 연장실험에서도 모든 시료에서 농도 의존적으로 신경돌기가 연장되었다.
- 5 이상일 경우 암세포에 대한 선택성이 존재하여 생육을 억제한다고 볼 수 있다. 실험결과 3가지 시료 모두다 1.5 이상의 선택적 사멸 도를 나타내 암세포에 대한 선택성이 있는 것으로 확인되었다. Fig.
- 8%를 보인 것에 비하면 수치상으로 높은 억제효과를 보여주었다. 유향 정유 추출물이 정상 세포에 대한 변이를 억제시키며 암세포에 대해서 특이적인 강한 항암효과를 나타내는 것을 확인함으로서 유향 정유 성분 내에 MNWG와 균주의 DNA와 RNA와의 결합을 억제하는 물질을 많이 함유한다는 것을 확인하였다. 이후 현재 항암제의 문제점으로 지적되고 세포독성과 변이에 대한 문제를 해결할 수 있는 잠재적 해결책으로서 정유 성분의 가능성을 제시하는 것이라 사료된다.
- 가장 좋은 활성을 보인 것은 회향으로 237 ㎛로 나타나 다른 시료들에 비해 신경돌기 연장능이 높게 나타났다. 이 사실로 기초하여 회양의 초임계 정유 추출물의 휘발성 알콜 계열에 성분들이 신경세포에 대해 강한 활성을 보인다는 것을 확인하였다. 이는 최근의 심각한 노인성 문제로 대두되고 있는 신경계 질병인 알츠하이머병에 대한 새로운 치료제로서의 가능성을 제시하는 대목이어서 이에 대한 심층적인 연구가 수행되어져야 한다고 생각된다.
- 추출용매를 사용해야 하는 SDE 추출법과는 달리 무색, 무취인 CO2를 이용하여 정유 성분을 분리하는 초임계 추출법은 인체에 무해한 정유 성분을 얻을 수 있다는 것이 가장 큰 장점이라 사료되며, 분리된 정유 물질에 대해 성분 분석 결과 대부분이 휘발성 알코올 계열에 물질임을 확인할 수 있었다. 정유성분들에 대한 생리활성 실험결과 항암, 항 돌연변이 그리고 신경활성이 아주 높은 것으로 나타나 aroma-theraphy로서 의 가능성을 제시하였다고 사료된다. 나아가 이 정유성분에 대한 in vivo 실험을 통해 기초의 약품으로서 연구가 수행되어진다면 전통적 인 치료제로서 사용된 천연물에 대한 현대적 가치부여가 가능하다고 생각된다.
- 기존의 SDE 추출법과 비교하여 추출수율 측면에서 비교적 높은 결과를 얻어내어 정유 추출시 장차 SDE 추출법을 대체할 신기술로 평가되었다. 추출용매를 사용해야 하는 SDE 추출법과는 달리 무색, 무취인 CO2를 이용하여 정유 성분을 분리하는 초임계 추출법은 인체에 무해한 정유 성분을 얻을 수 있다는 것이 가장 큰 장점이라 사료되며, 분리된 정유 물질에 대해 성분 분석 결과 대부분이 휘발성 알코올 계열에 물질임을 확인할 수 있었다. 정유성분들에 대한 생리활성 실험결과 항암, 항 돌연변이 그리고 신경활성이 아주 높은 것으로 나타나 aroma-theraphy로서 의 가능성을 제시하였다고 사료된다.
후속연구
- 정유성분들에 대한 생리활성 실험결과 항암, 항 돌연변이 그리고 신경활성이 아주 높은 것으로 나타나 aroma-theraphy로서 의 가능성을 제시하였다고 사료된다. 나아가 이 정유성분에 대한 in vivo 실험을 통해 기초의 약품으로서 연구가 수행되어진다면 전통적 인 치료제로서 사용된 천연물에 대한 현대적 가치부여가 가능하다고 생각된다.
- 반면 노간주나무의 경우에는 이들 2가지의 정유추출물과 일치되는 성분이 거의 나타나지 않았다. 열매부인 회향과 유향과는 달리 노간주나무의 목질부를 이용한 정유성분의 추출 후 성분분석 결과 열매부와 목질부의 성분이 많은 차이를 나타냄으로 이후 다른 천연물에 대한 정유 분석시 부위별로 세심한 분석이 요구되어진다고 사료된다.
- 선택적 사멸도는 4~6으로 나타났다. 위 실험을 통해 각 정유성분의 암세포에 대해 높은 저해능을 확인할 수가 있었는데, 이는 시료인 정유성분 내에 존재하는 휘발성 알콜 계열의 성분들에 의한 암세포에 대해 특이적인 저해능을 보임으로서 이후 in vivo 실험을 통해 억제 기작을 규명할 수 있다면 이후 기능성 의약품으로서 잠재적 가능성을 제시할 수 있을 것이라 사료된다.
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