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문제 정의
- 따라서 본 연구는 위의 두 식물의 줄기 및 열매에서 기존의 추출방법을 통하여서는 추출하기 어려운 essential oil를초임계 추출 장치를 이용하여 추출하여, 면역세포의 생육 증진 효과, cytokine 분비량 측정 , 항암활성 등의 생리활성검증을 통하여 이들이 면역 증진제로서의 가능성을 부여하고, 향후 본 연구 자료들이 식품에 관련된 분야에 바탕 자료로서 가치를 지니게 하기 위해 본 연구를 수행하였다.
- 0 g/C 의 농도에서 약 75%의 생육 억제 활성을 나타내었다. 이는 앞에서 실시한 면역 활성 결과를 통해 활성화된 면역체계에 의해 항암활성이 증가한 것으로 사료되어지 는 바이다.
- 대응하는 기작을 가지고 있다. 이러한 면역체계가 활성화되면서 외부에서 항원이 침입하여 발생하는 암과 같은 질병 발생에 대하여, 활성화된 면역세포에 의하여 궁극적으로 항암활성이 나타날 것으로 사료되어지는 바이다.
제안 방법
- , 1988)에 의하여 실험군의 면역세포 생육 증진 효과를 측정하였다. MTT assay 실험방법은 대상 세포의 농도를 4-5X104 cells/m£ 의 농도로 조절한 후, 24 well plate에 900 ㎕씩 첨 가하여 24시간 동안 배양 (37℃, 5% CQ)시킨 후 시료의 최종농도를 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 g/0 로 100 ㎕씩 첨가하여 48시간 동안 다시 배양 (37℃, 5% COD하였다. 여기에 100 ㎕의 MTT(50 mg/m£) 용액을 첨가하여 4시간 동안 다시 배양 (37℃, 5% CO)하여 formazan을 형성시킨 후, DMS0 900 ㎕를 첨가하여 formazan을 다시 녹였다.
- ) 의 줄기부와 열매는 임업 연구원에서 기증 받아 사용하고, 유향 carteii Birew) 은 서울의 경동시장에서 국내산을 구입하여 사용하였다. 각 시료들은 증류수를 이용하여 세척하고 열풍건조기로 건조하였으며, 세절기를이 용하여 절단한 것을 초임계 추출장치를 이 용하여 essential oil을 추출하였다. 초임계 추출장치는 Fig.
- 각 시료로부터 초임계 추출한 각각의 정유 성분들의 유방암 세포인 MCF-7와 간암 세포인 Hep3B에 대한 생육 저해 능을 알아보았으며, 그 결과들은 Fig. 3과 Fig. 4에 각각 나타내었다. 우선 유방암 세포인 MCF-7에 대한 각 정유 성분들의 암세포 생육 저해능을 살펴보면, 각각의 정유 성분들을 0.
- , 1993). 그리고 각 실험 결과들은 실험군에서 최대치와 최소치를 제외한 자료들의 mean 土 SD으로 표시 하였다.
- 0 g/。로 100 成씩 첨가하여 다시 배양 (37℃, 5% CQ)하였다. 배양배지를 원심분리기를 이용하여 상등액을 취한 다음 450 nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 얻어진 O.D값을 표준물질을 이용해 작성한 표준곡선과 비교하여 cytokine의 양을 즉정하였다.
- 4에 각각 나타내었다. 우선 유방암 세포인 MCF-7에 대한 각 정유 성분들의 암세포 생육 저해능을 살펴보면, 각각의 정유 성분들을 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 g/0 의 농도로 투여하였다. 각 정유 성분의 투여량이 증가하면서 암세포의 생육 저해 능이 증가하는 농도 의존적인 경향을 나타내었다.
- 각 시료들은 증류수를 이용하여 세척하고 열풍건조기로 건조하였으며, 세절기를이 용하여 절단한 것을 초임계 추출장치를 이 용하여 essential oil을 추출하였다. 초임계 추출장치는 Fig. 1과 같은 구조를 갖는 것을 이용하였으며, 초임계 추출장치를 이용하여 추출하기 위해 시료들은 100 g 씩 살균된 거즈를 이용하여 밀봉한 다음 vessel 부에 넣고 추출하였다. 추출조건은 vessel 부의 압력이 3000-3500 psi, 온도는 35~45℃로 유지시켰으며, 총 가압 시간은 시료 투여 후약 3시간이었으며 , 가압 후 추출 시 추출기의 온도는 601 로 유지하였다.
- 한편 T 세포의 cell density는 24 well plate 에 세포를 2.0 xio4 cells/M의 농도로 조절한 후 시료를 투여 하여 8일 동안 배양시켜 각 well의 cell 수를 hemacytometer# 이용하여 1일 간격으로 측정하였다. Cytokinee Ⅱ.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 노간주나무 (Juniperus figida Sieb.) 의 줄기부와 열매는 임업 연구원에서 기증 받아 사용하고, 유향 carteii Birew) 은 서울의 경동시장에서 국내산을 구입하여 사용하였다. 각 시료들은 증류수를 이용하여 세척하고 열풍건조기로 건조하였으며, 세절기를이 용하여 절단한 것을 초임계 추출장치를 이 용하여 essential oil을 추출하였다.
- 본 실험에 사용된 세포는 human promyelocytes (HL- 60) 인 전골수세포로서 macrophage나 granulocyte로 분화가 되어 사멸하는 기작을 가지고 있다. (Edmund & Wolf, 1985).
- 세포 배양용 배지로 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) 과 RPMI 1640는 GIBCO (USA)사로부터 구입하였고, 혈청인 Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO사의것을 사용하였으며 , gentamycin sulfate, Hepse buffer는 Sigma (USA)사의 것을 사용하였고, trysin—EDTA는 GIBCO사의 것을 사용했다. 염색제 3- (4, 5-dimethyl- 2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2-tetrazo~ lium bromide (MTT) 와 sulforhodamine B (SRB)는 Sigma사로부터구입하여 실험에 사용하였고, potassium phosphate buffer saline (PBS), dimethyl sulfoxide (DMSO), yrichloroacetic acid (TCA) 는 Sigma사로부터 구입 하여 사용하였다.
- 사용하였다. 실험에 사용된 세포들은 DMEM과 RPMI 1640배지에 10% heating-inactivated FBS를 첨가시켜 배양하였다.
- 실험에 이용된 세포주는 면역세포 생육 증진 효과에 인간면역 세포인 T cell (Jurkat, ATCC, USA)과 B cell (Raji, ATCC, USA) 을 이용하여 검증하였고, 항암 활성은 인간 폐암 세포인 MCF-7 (Breast adenocarcinoma, human, ATCC, USA) 와 인간 간암 세포인 Hep3B (Hepatocellular carcinoma, human, ATCC, USA)를 사용하였고, 세포 분화능 실험에는 인간 전 골수성 세포인 HL-60 (Pro-myelocytic leukemia, human, ATCC, USA)을 사용하였다. 실험에 사용된 세포들은 DMEM과 RPMI 1640배지에 10% heating-inactivated FBS를 첨가시켜 배양하였다.
- 것을 사용했다. 염색제 3- (4, 5-dimethyl- 2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2-tetrazo~ lium bromide (MTT) 와 sulforhodamine B (SRB)는 Sigma사로부터구입하여 실험에 사용하였고, potassium phosphate buffer saline (PBS), dimethyl sulfoxide (DMSO), yrichloroacetic acid (TCA) 는 Sigma사로부터 구입 하여 사용하였다.
- 인간 전 골수성 세포인 HL-60 (human promyelocytic leukemia) 세포를 4x:05 cells/i成의 농도로 24 well plate에 1 圳 접종하여 전 배양하였다. 24시간 간격으로 배지를 제거한 후 세포를 수확하여 320 g에서 10분간 원심 분리하여 침전시킨 다음, 200 ㎕의 0.
- 추출조건은 vessel 부의 압력이 3000-3500 psi, 온도는 35~45℃로 유지시켰으며, 총 가압 시간은 시료 투여 후약 3시간이었으며 , 가압 후 추출 시 추출기의 온도는 601 로 유지하였다. 초임계 추출에 사용된 gas는 열과 압력 그리고 폭발성이 없는 CO2 gas를 사용하였다.
이론/모형
- 간 면역 세포인 B cell과 T cell의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 면역세포 생육 증진 효과는 3-(4, 5-dimethyI- 2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2-tetrazolium bromide assay (MTT) 방법 (Michael et al., 1988)에 의하여 실험군의 면역세포 생육 증진 효과를 측정하였다. MTT assay 실험방법은 대상 세포의 농도를 4-5X104 cells/m£ 의 농도로 조절한 후, 24 well plate에 900 ㎕씩 첨 가하여 24시간 동안 배양 (37℃, 5% CQ)시킨 후 시료의 최종농도를 0.
- 있다. 그 중 T세포에 대한 면역 증진 효과를 확인하기 위하여 MTT 분석 방법을 이용하여 면역 세포의 생육도를 측정 하여 Fig. 2에 나타내었다.
성능/효과
- 25배 이상의 높은 생육 증진 활성을 나타내었다. T cell의 생육도에서 노간주 열매와 줄기의 정유 성분에 비해 유향 열매의 정유 성분이 보다 높은 생육 증진 활성을 나타내었다.
- 각 정유 성분의 투여량이 증가하면서 암세포의 생육 저해 능이 증가하는 농도 의존적인 경향을 나타내었다. 가장 활성은 높은 시료는 노간주 열매의 정유 성분으로 0.6 g/C 농도에서부터 약 80%의 높은 생육 억제 활성을 나타내 었으며 , 또한 1.0 g/0 의 농도에서 약 84%의 높은 생육 억제 활성을 나타내었다. 노간주 줄기의 정유 성분과 유향 열매의 정유 성분은 시료 투여 최고 농도인 1.
- 1X10, cells®의 세포 활성을 나타내었다. 각 시료에 대한 세포 당 IL-6의 분비량을 살펴보면, 노간주 열매의 정유 성분이 배양 6일째 3.15X10-3 pg/cell로 가장 많은 분비량을 나타내었고, 유향 열매와 노간주 줄기의 정유 성분은 각각 2.9X1CT pg/cell와 2.93xlO-3 pg/cell의 분비량을 나타내었다. 그리고 각 시료에 대한 세포 당 TNF-a의 분비량을 살펴보면, IL-6와 다르게 배양 2일째 가장 많은 분비량을 나타내었으며, 그 양은 노간주 열매의 정유 성분이 5.
- 0 g/0 의 농도로 투여하였다. 각 정유 성분의 투여량이 증가하면서 암세포의 생육 저해 능이 증가하는 농도 의존적인 경향을 나타내었다. 가장 활성은 높은 시료는 노간주 열매의 정유 성분으로 0.
- 우선 각 시료에 대한 cell density를 살펴보면 모든 시료에서 배양시간 의존적으로 세포농도가 증가하는 것을 보여주었으며 배양 4일째 가장 높은 세포 활성도를 나타내었다. 그 중에서 유향 열매의 정유 성분이 배양 4일째 6.9xlO4 cells/i此로 가장 높은 활성을 나타내었고, 노간주 열매와 줄기의 정유 성분들은 각각 6.3 X104 cells/成과 6.1X10, cells®의 세포 활성을 나타내었다. 각 시료에 대한 세포 당 IL-6의 분비량을 살펴보면, 노간주 열매의 정유 성분이 배양 6일째 3.
- 93xlO-3 pg/cell의 분비량을 나타내었다. 그리고 각 시료에 대한 세포 당 TNF-a의 분비량을 살펴보면, IL-6와 다르게 배양 2일째 가장 많은 분비량을 나타내었으며, 그 양은 노간주 열매의 정유 성분이 5.89X10-3 pg/cell로 가장 많은 분비량을 나타내었고, 노간주 줄기와 유향 열매의 정유 성분은 각각 5.39X10T pg/cell와 5.67 pg/cell의 분비량을 나타내었다. 이상의 결과는 앞에서 실시한 면역세포의 생육 증진 활성을 뒷받침하는 자료로서, 면역세포의 생육 증진으로 인하여 면역 체계가 활성화 되면서 cytokine의 분비량도 증가되는 것으로 사료되어진다.
- 0 g/0 의 농도에서 약 84%의 높은 생육 억제 활성을 나타내었다. 노간주 줄기의 정유 성분과 유향 열매의 정유 성분은 시료 투여 최고 농도인 1.0 g/C 의 농도에서 각각 79%와 78%의 높은 암세포 생육 억제 활성을 나타내었다. 간암 세포인 Hep3B에 대한 각 정유 성분들의 암세포 생육 저해능은 유방암 세포의 경우와 같이 투여한 정유 성분의 양에 따라 암세포의 생육 저해능이 증가하는 농도 의존적인 경향을 나타내었으며 , 가장 활성이 높은 시료는 유향 열매의 정유 성분으로 1.
- 0 g/i 의 농도로 투여한 후, 배양 2, 4, 6일째 HL-60 세포의 분화도를 측정한 결과이다. 모든 시료들이 배양 시간이 늘어나면서 HL- 60 세포의 분화도가 증가하는 것으로 나타났다. 모든 정유 성분들의 HL-60 세포의 분화도는 모두 비교적 낮은 활성을 나타내었다.
- 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 우선 각 시료에 대한 cell density를 살펴보면 모든 시료에서 배양시간 의존적으로 세포농도가 증가하는 것을 보여주었으며 배양 4일째 가장 높은 세포 활성도를 나타내었다. 그 중에서 유향 열매의 정유 성분이 배양 4일째 6.
- 모든 정유 성분들의 HL-60 세포의 분화도는 모두 비교적 낮은 활성을 나타내었다. 유향 열매의 정유 성분이 control 군에 비하여 1.38배의 증진 활성을 나타내어 가장 높은 분화 도를 나타내었으며, 노간주 열매와 줄기의 정유 성분은 각각 1.37배와 1.32배의 활성을 나타내었다. 이는 각 시료들이 세포의 분화나 사멸기작에 직접적으로 작용하기보다는 면역체계에서 점진적으로 작용하는 것으로 추축할 수 있다.
- 간암 세포인 Hep3B에 대한 각 정유 성분들의 암세포 생육 저해능은 유방암 세포의 경우와 같이 투여한 정유 성분의 양에 따라 암세포의 생육 저해능이 증가하는 농도 의존적인 경향을 나타내었으며 , 가장 활성이 높은 시료는 유향 열매의 정유 성분으로 1.0 g/。의 농도에서 약 83%의 높은 암세포 생육 억제 활성을 나타내었고, 노간주 열매의 정유 성분 또한 1.0 g/ E 의 농도에서 약 80%의 높은 생육 억제 활성을 나타내었다. 노간주 줄기의 정유 성분은 1.
- 초임계 추출방법을 통하여 추출한 각 정 유 성분들의 인간면역 세포 중 하나인 T cell의 생육 증진 활성을 살펴보면 농도 의존적인 경향을 나타내었으며, 시료의 최고 농도인 1.0 g/C 의 농도에서 유향 열매의 정유 성분이 control 군에 비하여 약 1.33배의 생육을 증진시켜 가장 높은 활성을 나타내었다. 노간주 열매와 줄기의 정유 성분은 각각 1.
후속연구
- 추축할 수 있다. 본 실험을 통하여 얻어진 결과로 인하여 면역기능의 향상과 나아가 항암 활성의 증진 등의 목적으로 하는 기능성 식품의 개발이 가능할 것으로 사료되어지고, 앞으로 보다 폭넓은 연구가 이루어져 보다 다양한 생리 활성의 검증이 필요할 것으로 생각되어지는 바이다.
- 67 pg/cell의 분비량을 나타내었다. 이상의 결과는 앞에서 실시한 면역세포의 생육 증진 활성을 뒷받침하는 자료로서, 면역세포의 생육 증진으로 인하여 면역 체계가 활성화 되면서 cytokine의 분비량도 증가되는 것으로 사료되어진다.
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