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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 처음으로 기내에서 조직배양 방법을 통한 선피막이의 대량 배양을 위한 식물체 재분화 시스템을 확립하여 유용물질 연구에 대한 기초자료를 제공함에 목적이 있다.
- 약용식물로 쓰이는 선피막이 {Hydrocotyle maritima Honda) 를 기내에서 재분화 가능성에 대해 조사하였다. 선피막이의 엽병 절편체를 식물생장조절제 (0~5㎎/ℓ NAA와 0~5㎎/ℓ 2, 4-D)가 단독 또는 0.
제안 방법
- 0.5㎎/ℓ 2, 4-D와 0.5㎎/ℓ BA가 첨가된 처리구에서 유도된 캘러스로부터 체세포 배를 유도하였다. 체세포 배발생에 대한 생장조절제의 영향은 농도가 낮을수록 발생이 활발하였다.
- 0.5㎎/ℓ 2, 4-D와 0.5㎎/2 BA가 첨가된 처리구에서 유도된 캘러스로부터 체세포 배의 발생을 위해 0~1㎎g/ℓ의 2, 4-D와 0~1㎎/ℓ의 BA를 조합하여 3% (v/v) sucrose와 0.8%agar (w/v)가 포함된 MS배지에 첨가하였다. Petri dish 당 100㎎의 embryogenic callus를 치상하고, 5주간 명배양하여 체세포 배의 발생율을 조사하였다.
- 5㎎/ℓ NAA와 0.5㎎/ℓ BA가 첨가된 처리구에서 유도된 캘러스를 3주 간격으로 계대배양하여 기관분화를 유도하였다. 선피막이의 캘러스가 신초 발생시 가장 적합한 식물 생장조절제와 농도롤 알아보기 위해 Kinetin, BA, Zeatin 및 TDZ를 첨가하여 조사한 결과, Kinetin과 BA가 다른 처리구에 비해 우수한 신초 발생율과 재분화율을 보였고, Zeatine 약간의 부정근만 발생하였으며 TDZ 처리구에서는 BA와 Kinetin보다 낮은 재분화율를 나타내었다 (Table 3).
- 8%agar (w/v)가 포함된 MS배지에 첨가하였다. Petri dish 당 100㎎의 embryogenic callus를 치상하고, 5주간 명배양하여 체세포 배의 발생율을 조사하였다. 기내배양을 통하여 발생된 체세포 배는 호르몬이 첨가되지 않은 MS 기본배지로 계대배양 하였다.
- NAA를 2, 4-D의 농도와 마찬가지로 단독으로 처리한 결과 호르몬에 대한 반응이 없거나 유도된 캘러스는 2, 4-D를 처리했을때와 마찬가지로 괴사하거나 갈변하였다 (Data not shown). 다음으로 2, 4-D와 BA를 조합하여 처리하였다. 그 결과 각각 0.
- , 1995), 캘러스 유도에는 일반적으로 종에 따라 특정농도의 옥신 또는 옥신과 시토키 닌의 조합이 작용한다. 따라서 캘러스를 유도하기 위해 호르몬의 종류와 농도를 알아보았다. 2, 4-D를 0.
- 2 기압에서 15분간 멸균하여 1회용 petri dish에 각각 20㎖씩 분주하였다. 배양온도는 25±1℃에서 6주간 암배양하여 캘러스 발생율을 조사하였다.
- 선피막이의 엽병 절편체를 식물생장조절제 (0~5㎎/ℓ NAA와 0~5㎎/ℓ 2, 4-D)가 단독 또는 0.1~2㎎/ℓ BA와 조합 첨가된 배지에서 6주 동안 배양하였다. 2, 4-D 또는 NAA을 단독으로 처리해도 캘러스가 발생하나, 가장 좋은 결과는 각각 0.
- 엽병 절편은 각 petri dish에 15개씩 치상하였으며, 배지는 3% sucrose와 0.8% 한천 및 여러가지 농도 (0, 0.1, 0.5, 1, 2.5 및 5㎎/ℓ)의 1-Naphthaleneacetic acid (NAA), 2, 4_Dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) 및 Benzyladenine (BA)가 단독 또는 혼합 첨가된 MS 기본 배지 (Murashige & Skoog, 1962)를 사용하였으며, 배지의 pH는 5.8로 조정한 후, 121℃, 1.2 기압에서 15분간 멸균하여 1회용 petri dish에 각각 20㎖씩 분주하였다. 배양온도는 25±1℃에서 6주간 암배양하여 캘러스 발생율을 조사하였다.
- 유도된 캘러스들은 3주 간격으로 계대배양 하였으며, 5㎎/ℓ NAA와 1㎎/ BA가 첨가된 처리구에서 유도된 유백색의 캘러스를 100㎎을 cytokinin [Zeatin, Thidiazuron (TDZ), BA, Kinetin]이 여러 농도(0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 3 및 5㎎/ℓ)로 첨가된 배지에 치상하여, 16시간 광조건 하에서 6 주간 배양하여 부정아 발생율을 조사하였다.
대상 데이터
- 5㎎/ℓ BA 조합구에서 나타났다. Kinetin를 3㎎/ℓ로 처리시 캘러스로부터 가장 많은 신초 (캘러스당 12개)을 발생시켰다. 또한, 0.
- Petri dish 당 100㎎의 embryogenic callus를 치상하고, 5주간 명배양하여 체세포 배의 발생율을 조사하였다. 기내배양을 통하여 발생된 체세포 배는 호르몬이 첨가되지 않은 MS 기본배지로 계대배양 하였다. 완전한 식물체는 vermiculite: perlite (1:1) 혼합토로 채운 pot에 옮겨 실온에서 순화하였다.
- 본 연구에 사용된 선피막이 (Hydrocotyl maritima Honda)은 전남대학교내에서 서식 중인 식물체를 10월초에 채취하여 잎을 제거하고 엽병만을 70% 에탄올에서 3분간, 3% sodium hypochlorite 용액에서 6분간 표면살균 후 멸균수로 5회 세척하여 약 10㎜의 길이로 잘라서 사용하였다.
성능/효과
- 1A). 2, 4-D 농도를 고농도로 처리할수록 반응이 없거나 캘러스가 괴사하여 캘러스 유도에는 저농도가 적합하였다. NAA와 BA를 조합한 처리구에서는 캘러스 발생과 함께 부정근 발생이 주를 이루었다 (Table 2).
- 1~2㎎/ℓ BA와 조합 첨가된 배지에서 6주 동안 배양하였다. 2, 4-D 또는 NAA을 단독으로 처리해도 캘러스가 발생하나, 가장 좋은 결과는 각각 0.5㎎/ℓ 2, 4-D와 0.5㎎/ℓ BA, 5㎎/ℓ NAA와 0.5㎎/ℓ BA 조합구에서 나타났다. Kinetin를 3㎎/ℓ로 처리시 캘러스로부터 가장 많은 신초 (캘러스당 12개)을 발생시켰다.
- 1B). Kinetin과 BA 모두 3㎎/ℓ 첨가된 처 리구에서 가장 좋은 결과를 보여 가장 적당한 농도로 조사되었다. Kinetin과 BA의 농도가 고농도로 첨가될수록 재분화율은 높게 나타나지만, 신초 발생은 낮게 발생하여 재분화 효율을 저해하는 것으로 나타났다.
- Kinetin과 BA 모두 3㎎/ℓ 첨가된 처 리구에서 가장 좋은 결과를 보여 가장 적당한 농도로 조사되었다. Kinetin과 BA의 농도가 고농도로 첨가될수록 재분화율은 높게 나타나지만, 신초 발생은 낮게 발생하여 재분화 효율을 저해하는 것으로 나타났다.
- 다음으로 2, 4-D와 BA를 조합하여 처리하였다. 그 결과 각각 0.5㎎/ℓ 농도에서 유백색을 띄는 캘러스가 발생하였으며 유도 및 생장이 가장 활발하였다 (Table 1; Fig. 1A). 2, 4-D 농도를 고농도로 처리할수록 반응이 없거나 캘러스가 괴사하여 캘러스 유도에는 저농도가 적합하였다.
- 기관발생으로 유도된 신초에 NAA를 처리하여 발근을 유도한 결과 NAA 호르몬 없이도 발근이 쉽게 유도되었다. 기관분화와 배분화를 통하여 이루어진 완전한 식물체는 3주간 기내에서 배양 후 바로 vermiculite : perlite = 1:1 토양에 옮겨, 온도 25±1℃에서 습도를 유지시키면서 활착을 유도한 결과 쉽게 활착을 하여 대량증식의 가능성을 높여주었다 (Fig.
- Kinetin를 3㎎/ℓ로 처리시 캘러스로부터 가장 많은 신초 (캘러스당 12개)을 발생시켰다. 또한, 0.5㎎/ℓ 2, 4-D와 0.5㎎/ℓ BA가 첨가된 배지에서 유도된 배발생 캘러스를 호르몬이 없는 배지에서 배양하였을 때, 체세포 배가 분화되었고, 식물체로 더 잘 발달하였다.
- 5㎎/ℓ BA가 첨가된 처리구에서 유도된 캘러스를 3주 간격으로 계대배양하여 기관분화를 유도하였다. 선피막이의 캘러스가 신초 발생시 가장 적합한 식물 생장조절제와 농도롤 알아보기 위해 Kinetin, BA, Zeatin 및 TDZ를 첨가하여 조사한 결과, Kinetin과 BA가 다른 처리구에 비해 우수한 신초 발생율과 재분화율을 보였고, Zeatine 약간의 부정근만 발생하였으며 TDZ 처리구에서는 BA와 Kinetin보다 낮은 재분화율를 나타내었다 (Table 3). 배지에 시토키닌류를 단독으로 처리하여 여러 개의 부정아를 유도하는 방법으로 (Clog et al.
- 체세포 배발생에 대한 생장조절제의 영향은 농도가 낮을수록 발생이 활발하였다. 특히, 생장조절제가 없는 배지에서 배발생이 가장 많이 유도되어 배발생에 식물생장조절제는 필요없는 것으로 나타났다 (Table 4). 발생된 배는 접합자 배와 같은 정상적인 단계를 거쳐 식물체를 이루었다 (Fig.
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