본 연구는 폐수 중의 질소 제거를 위한 생물학적 처리용 미생물 개발을 위한 목적으로 질소의 산화 능력이 뛰어난 균주를 분리하였다. 분리된 세균 중에서 질소 산화능과 생육 속도가 뛰어난 CH-N 균주를 선별하였으며, 생리, 생화학적 특성 조사에 의해 Bacillus sp로 추정되어 Bacillus sp. CH-N이라 명명하였다. 분리 균주는 0.5% glucose가 포함된 초기 pH가 7,0인 암모니아 및 아질산성 질소 함유 배지에서 30시간 배양 후 각각 85%와 90%의 암모니아성과 아질산성 질소의 감소율을 나타내었다. 폐수 및 생활하수에 분리 균주를 이용한 결과, 수질 속의 암모니아성 질소가 단시간에 크게 감소시키는 효과를 확인하였다. 균주를 고정시킨 담체의 질소산화 효과를 시험하고자 Bacillus sp. CH-N을 고정시킨 세라믹 담체를 이용한 결과, 배양 2일 후에는 암모니아성 질소가 전부 제거되었다.
본 연구는 폐수 중의 질소 제거를 위한 생물학적 처리용 미생물 개발을 위한 목적으로 질소의 산화 능력이 뛰어난 균주를 분리하였다. 분리된 세균 중에서 질소 산화능과 생육 속도가 뛰어난 CH-N 균주를 선별하였으며, 생리, 생화학적 특성 조사에 의해 Bacillus sp로 추정되어 Bacillus sp. CH-N이라 명명하였다. 분리 균주는 0.5% glucose가 포함된 초기 pH가 7,0인 암모니아 및 아질산성 질소 함유 배지에서 30시간 배양 후 각각 85%와 90%의 암모니아성과 아질산성 질소의 감소율을 나타내었다. 폐수 및 생활하수에 분리 균주를 이용한 결과, 수질 속의 암모니아성 질소가 단시간에 크게 감소시키는 효과를 확인하였다. 균주를 고정시킨 담체의 질소산화 효과를 시험하고자 Bacillus sp. CH-N을 고정시킨 세라믹 담체를 이용한 결과, 배양 2일 후에는 암모니아성 질소가 전부 제거되었다.
Abstract: In order to improve the system for biological nitrogen oxidizing process in sewage and wastewater, a bacterium having high abilities to oxidize of nitrogen was isolated from wastewater and polluted soils. The strain was identified to Bacillus sp. CH-N, based on the physiological and bioche...
Abstract: In order to improve the system for biological nitrogen oxidizing process in sewage and wastewater, a bacterium having high abilities to oxidize of nitrogen was isolated from wastewater and polluted soils. The strain was identified to Bacillus sp. CH-N, based on the physiological and biochemical properties. Characteristics and oxidizing ability of both ammonia and nitrite were examined for the strain, Bacillus sp. CH-N. The strain showed the oxidizing rate about 80% to 90% on the sewage and wastewater after 48 h culture. The nitrogen oxidizing rate was increased in proportion to the initial concentration of glucose. The microorganism, Bacillus sp. CH-N cell immobilized on ceramic carrier were evaluated for the oxidation of ammonia in culture media.
Abstract: In order to improve the system for biological nitrogen oxidizing process in sewage and wastewater, a bacterium having high abilities to oxidize of nitrogen was isolated from wastewater and polluted soils. The strain was identified to Bacillus sp. CH-N, based on the physiological and biochemical properties. Characteristics and oxidizing ability of both ammonia and nitrite were examined for the strain, Bacillus sp. CH-N. The strain showed the oxidizing rate about 80% to 90% on the sewage and wastewater after 48 h culture. The nitrogen oxidizing rate was increased in proportion to the initial concentration of glucose. The microorganism, Bacillus sp. CH-N cell immobilized on ceramic carrier were evaluated for the oxidation of ammonia in culture media.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 질소를 제거해 줄 수 있는 미생물을 폐수처리에 이용하고 자 질소산화능이 우수하며 자연계에서 생육이 양호한 Bacillus sp.를 분리하여 균주의 특성을 밝히며, 질소산화능을 조사하여 실처리 공정에 적용할 수 있는 균주 개발을 위한 기초적 연구를 수행하였기에 보고하고자 한다.
질소산화 측정을 위한 배양.암모니아 질소의 산화를 측정하기 위하여 ammonium sulfate를 첨가한 배지에서 배양한 후, 시간대에 따른 암모니아성질소의 경시적인 감소율 변화를 보고자 하였다. 일정 시간대별로 샘플링하여 균생육 정도를 측정하고 생육된 균을 4℃, 10, 000 rpm에서 원심분리하여 얻은 배지의 상징액에 존재하는 암모니아성, 아질산성 및 질산성 질소의 함량을 측정하였다.
제안 방법
분리균주인 Bacillus sp. CH-N을 공장 폐수와 생활폐수를 이용하여 폐수에 존재하는 암모니아성질소 및 아질산성 질소산화율을 측정하였다. 미리 전 배양한 균주를 접종하고 아무런 영양요소를 첨가하지 않고서 30℃에서 진탕하면서 질소의 산화률을 측정한 결과를 Fig.
일정 시간대별로 샘플링하여 균생육 정도를 측정하고 생육된 균을 4℃, 10, 000 rpm에서 원심분리하여 얻은 배지의 상징액에 존재하는 암모니아성, 아질산성 및 질산성 질소의 함량을 측정하였다. 또한, 아질산성 질소의 산화를 확인하기 위해서는 sodium nitrite를 첨가한 배지에서 배양한 배양 상징액으로부터 동일 방법으로 샘플링하여 균생육 정도를 측정하고 생육된 배지의 상징액에 존재하는 각종 아질산성 질소와 질산성 질소의 함량을 측정하였다.
분리된 균주의 생육 특성.분리균의 배양학적 조건에 따른 질소의 산화력을 조사하고자 배양온도 및 배양 배지의 초기 pH 에 따른 균주의 생육 특성을 조사하였다 (Fig. 2).분리 균주 Bacillus sp.
분리균주의 담체고정화 및 질소산화능 측정. 미생물을 담체에 고정화시키는 방법은 분리한 Bacillus sp.
분석 방법. 분리균주의 생육도는 610nm에서 흡광도로 측정하였으며, 사용한 기기는 UVspectrophotometer(Ultrospec3000, Phamacia Biotech, USA)를 사용하였다. 암모니아 및 아질산성 질소 산화 균주의 산화율은 배지 내의 암모니아성 질소, 아질 산성 질소 및 질산성 질소의 농도변화를 경시적으로 측정하였다.
균주의 분리 및 동정. 생활하수, 공장 폐수 및 오염된 토 양 환경에서 토양을 채취하여, 10 g을 100 mZ의 멸균수에 넣고 200rpm, 30분 동안 혼합한 후 6단계 희석 평 판법으로 LB 배 지에도 말하여 생성된 콜로니를 암모니아가 함유된 배지 (Table 1)에서 7일간 진탕배양을 하여 농화된 균주를 고체평판 배지에서 도 말하여 37℃에서 1일 배양하였다. 생성된 콜로니를 4일간 액체 배양하면서 질소 이용이 우수한 균주를 분리하여, 그람 양성균이며 암모니아 및 아질산성 질소를 산화시키는 균주를 분리하여 CH-N이라 하였다.
분리균주의 생육도는 610nm에서 흡광도로 측정하였으며, 사용한 기기는 UVspectrophotometer(Ultrospec3000, Phamacia Biotech, USA)를 사용하였다. 암모니아 및 아질산성 질소 산화 균주의 산화율은 배지 내의 암모니아성 질소, 아질 산성 질소 및 질산성 질소의 농도변화를 경시적으로 측정하였다. 암모니아성질소는 인돌페놀법, 아질산성질소는 디아조화 법, 질산성 질소는 부루신법을 이용하였으며, 이는 수질오염 공정시험법에 준하여 분석하였다.
균주를 분리하여 사용하였다. 얻어진 콜로니 수백 개를 암모니아가 함유된 배지 (Table 1)에서 7일간 진탕배양을 하면서 암모니아성질소 산화능이 우수한 균주를 이차적으로 분리하였다. 분리된 균주 중에서 Bacillus의 생리· 생화학적 특성을 갖는 암모니아질소 산화능이 가장 우수한 균주를 선별하였다.
이 때 건조된 담체의 다 공질 공극 사이로 수분이 충전되면서 미생물 입자가 흡착, 고정되어 생물막을 형성하게 된다. 이 과정에서 형성된 생물막의 모습을 전자현미경으로 관찰하여 확인한다. 질소산화능의 측정은 미생물이 부착된 담체를 1/50, l/250(v/v)의 양이 되게 액체배지에 접종한 후, 경시적으로 암모니아성 질소와 질산성 질소의 변화 양상을 측정하였다.
담체를 1/50, l/250(v/v) 양으로 접종한 시험한 결과, 반응 후 24시간에는 초기의 암모니 아성 질소가 전부 없어진 결과를 보였다. 이때, 균주를 직접 배양한 처리구에서와 같이 아질산성 질소의 일시적 생성을 확인하였다. 아질산성 질소를 배양용액에 처리한 경우 또한 전부 질산성 질소로 산화되어지는 결과를 나타내었다.
암모니아 질소의 산화를 측정하기 위하여 ammonium sulfate를 첨가한 배지에서 배양한 후, 시간대에 따른 암모니아성질소의 경시적인 감소율 변화를 보고자 하였다. 일정 시간대별로 샘플링하여 균생육 정도를 측정하고 생육된 균을 4℃, 10, 000 rpm에서 원심분리하여 얻은 배지의 상징액에 존재하는 암모니아성, 아질산성 및 질산성 질소의 함량을 측정하였다. 또한, 아질산성 질소의 산화를 확인하기 위해서는 sodium nitrite를 첨가한 배지에서 배양한 배양 상징액으로부터 동일 방법으로 샘플링하여 균생육 정도를 측정하고 생육된 배지의 상징액에 존재하는 각종 아질산성 질소와 질산성 질소의 함량을 측정하였다.
이 과정에서 형성된 생물막의 모습을 전자현미경으로 관찰하여 확인한다. 질소산화능의 측정은 미생물이 부착된 담체를 1/50, l/250(v/v)의 양이 되게 액체배지에 접종한 후, 경시적으로 암모니아성 질소와 질산성 질소의 변화 양상을 측정하였다.
고정된 샘플에서 용액을 제거한 뒤에 탈수를 한다. 탈수 과정은 50%, 70%, 95% 에탄올에서 각 10분간, 그리고 무수 에탄올에서 10분간 2회 탈수한다. 탈수한 뒤에 샘플을 풍건하고, 임계점 건조기어서 건조한 뒤에, 주사 전자현미경(SEM)으로 관찰하여 사진 촬영하 였다.
탈수 과정은 50%, 70%, 95% 에탄올에서 각 10분간, 그리고 무수 에탄올에서 10분간 2회 탈수한다. 탈수한 뒤에 샘플을 풍건하고, 임계점 건조기어서 건조한 뒤에, 주사 전자현미경(SEM)으로 관찰하여 사진 촬영하 였다.11)
대상 데이터
균주의 분리 및 동정.본 연구에 사용한 균주는 부산 . 경남 근교의 생활하수 및 공장폐수로 오염된 토양환경 조건을 가진 10여 가지 지역의 토양을 채취하여 분리된 세균 중에서 질소의 이용이 양호한 Bacillus sp.
이론/모형
균주의 동정은 각종 형태, 생리학적, 생화학적 특성을 API 50 CHB Kit를 사용하여 Bergey's manual of systematic bacteriology에 준하여 동정하였다.9)
암모니아 및 아질산성 질소 산화 균주의 산화율은 배지 내의 암모니아성 질소, 아질 산성 질소 및 질산성 질소의 농도변화를 경시적으로 측정하였다. 암모니아성질소는 인돌페놀법, 아질산성질소는 디아조화 법, 질산성 질소는 부루신법을 이용하였으며, 이는 수질오염 공정시험법에 준하여 분석하였다.10)
성능/효과
인간 및 가축의 분뇨, 도시 하수, 산업폐수, 비료에 의한 농업폐수 및 쓰레기 침출수에 포함된 질소 성분은 호소의 부영양화를 일으켜 수생 생태계의 악영향을 끼친다.1)이들 질소 오염원의 질소 형태를 살펴보면, 암모니아성질소와 유기질소로 구성되어 있다. 일반적으로 자연계에서의 질소 사이클은 질소분자(N2)→ 암모니아성 질소(NH3-N)→ 아질산성질소(NO2-N)→ 질산성 질소(NO3-N)→ N질소분자(N2)의 순환고리에 의해 질소의 존재 형태가 변화한다.
25% glucose를 첨가하였을 때, Bacillus sp. CH-N 균주는 배양 48시간 후 50% 잔류량을 보였으나 탄소원의 농도가 0.5% 첨가하였을 때는 아질산성 질소가 90% 이상 소모되었다. 아질산성 질소의 급격한 산화이루어지는 12시간 경에는 질산성 질소가 최대의 증가치를 보이다가 점차 급격한 감소하는 경향을 보였다.
5% glucose로 처리한 Bacillus sp. CH-N은 더 빠른 암모니아의 제거율을 보였으며, 상대적으로 아질산태질소는 0.5% glucose 처리주에서 보다 빨리 제거되는 것으로 나타났다(Fig. 3b). 따라서 이 균주를 생물학적 처리용 미 생물 제재로서 개발 시에는 저농도 탄소 원에서의 균주 생육조건 확립과 저렴한 '탄소원을 이용한 배양시험을 실시하여 보다 더 경제적이며 적합한 배양조건과 질소 제거 효과의 확립을 위한 실험이 더욱 요망되어진다.
배지에서 생육시 질소 산화 능력이 우수한 Bacillus sp. CH-N이 공장 폐수와 생활폐수에서도 생육영양원의 무첨가 상태에서 높은 질소 제거 능력을 보였다. 그러나 배양시간이 길어짐에 따라 암모니아 제거 효율이 거의 변화가 없는 것은 폐수 중의 영양원이 고갈된 것이 원인으로 생각된다.
6에 나타내었다. Fig. 5에서 보는 바와 같이 폐수 중 암모니아성질소는 CH-N을 처리한 경우 48%의 감소율을 보여 암모니아성질소의 급속한 감소로 악취가 제거되었으며 아질산성 질소가 늘어나는 것을 확인할 수 있었다. 아질산성 질소는 각 초기 배지에 존재하는 농도에 비해 121배와 120배 증가하였다.
이러한 암모니아성질소의 제거에는 세라믹 담체에 고정된 균주의 질소산화효과를 액체 배양한.균주의 처리구와 비교해보면, 담체에 고정된 균주의 처리구가 더 효율적이었다. 앞으로 다양한 방법의 미생물 고정담체를 이용한 담체고정 효과 실험을 수행하여 더욱 더 좋은 효과를 가진 미생물 고정용 담체 개발이 요구되어진다.
8에 나타냈다. 담체를 1/50, l/250(v/v) 양으로 접종한 시험한 결과, 반응 후 24시간에는 초기의 암모니 아성 질소가 전부 없어진 결과를 보였다. 이때, 균주를 직접 배양한 처리구에서와 같이 아질산성 질소의 일시적 생성을 확인하였다.
CH-N을 48시간 동안 배양한 배양액을 세라믹 담체에 고정시켰다. 담체에 고정된 미생물의 상태를 확인하고 자 주사전자 현미경(SEM)으로 관찰하여 사진 촬영한 결과, 담체의 공극에 수많은 미생물이 잘 고정되어 있는 것을 확인하였다(Fig. 7).
아질산성 질소는 각 초기 배지에 존재하는 농도에 비해 121배와 120배 증가하였다. 따라서 공장 폐수에서의 질소 제거 능력은 사용한 분리균주에서 높은 제거 효과를 나타내었다. Fig.
3에서 보여주고 있다. 분리균주는 OD610에서 약 O.D 1.5까지의 생장률을 보였으며, 배양 48시간 이후에 0.25% glucose 첨가배양에서 암모니아성 질소를 85% 정도까지 감소시키고, 암모니아성질소의 산화가 증가되면서 배양 24시간에는 아질산성 질소의 생성이 최고치를 나타내었다가 이후 감소되는 현상을 볼 수 있었다 (Fig. 3a). 질소 원으로 암모니아성질소를 첨가한 배지에서의 생육도는 glucose의 농도를 0.
배양온도를 달리한 28℃에서 37℃의 범위에서는 생육이 양호하였다. 분리균주의 최적생육 조건은 37℃에서 pH 7인 중성에서 생육도와 질소산화률이 가장 우수함을 확인할 수 있었다. 또한 4℃에서 45℃의 배양 온도에서도 비교적 양호한 생육 활성을 나타내고 있음을 실험을 통해 알 수 있어서, 미생물을 이용한 생물학적 처리의 문제점인 겨울철 처리 효율에 있어서도 안정적인 처리 효율을 유지할 수 있는 균주로서 이용이 가능할 것으로 예상된다.
얻어진 콜로니 수백 개를 암모니아가 함유된 배지 (Table 1)에서 7일간 진탕배양을 하면서 암모니아성질소 산화능이 우수한 균주를 이차적으로 분리하였다. 분리된 균주 중에서 Bacillus의 생리· 생화학적 특성을 갖는 암모니아질소 산화능이 가장 우수한 균주를 선별하였다. 균주의 일반적인 계대 배양은 LB-broth를 사용하였으며, 질소산화 측정을 위한 배지의 조성은 Table 1에 나타낸 바와 같다.
5% 첨가하였을 때는 아질산성 질소가 90% 이상 소모되었다. 아질산성 질소의 급격한 산화이루어지는 12시간 경에는 질산성 질소가 최대의 증가치를 보이다가 점차 급격한 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 남 등6)이 분리한 질소산화 균주는 아질산성 질소 산화시에 4일 후에는 아질산성 질소가 거의 제거되면서 상대적으로 질산성 질소가 증가되는 균주였으나 본 실험에서의 균주는 아질산성 질소의 감소에 따른 질소 제거 효과가 뛰어난 것으로 생각되어질소 제거용 균주로서 더욱 적합하다고 할 수 있겠다.
아질산성 질소의 급격한 산화이루어지는 12시간 경에는 질산성 질소가 최대의 증가치를 보이다가 점차 급격한 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 남 등6)이 분리한 질소산화 균주는 아질산성 질소 산화시에 4일 후에는 아질산성 질소가 거의 제거되면서 상대적으로 질산성 질소가 증가되는 균주였으나 본 실험에서의 균주는 아질산성 질소의 감소에 따른 질소 제거 효과가 뛰어난 것으로 생각되어질소 제거용 균주로서 더욱 적합하다고 할 수 있겠다.
3a). 질소 원으로 암모니아성질소를 첨가한 배지에서의 생육도는 glucose의 농도를 0.5%로 2배 증가시킨 처리주에서 약간 증가하는 것으로 나타났다. 암모니아성질소의 감소량과 아질산성 질소의 상대적인 생성량의 경시적인 변화시험을 실시한 결과, 이는 탄소원의 농도가 증가함에 따라 더욱 빨라지며 산화율이 증가되어지는 현상을 확인하였으며, 0.
후속연구
3b). 따라서 이 균주를 생물학적 처리용 미 생물 제재로서 개발 시에는 저농도 탄소 원에서의 균주 생육조건 확립과 저렴한 '탄소원을 이용한 배양시험을 실시하여 보다 더 경제적이며 적합한 배양조건과 질소 제거 효과의 확립을 위한 실험이 더욱 요망되어진다.
분리균주의 최적생육 조건은 37℃에서 pH 7인 중성에서 생육도와 질소산화률이 가장 우수함을 확인할 수 있었다. 또한 4℃에서 45℃의 배양 온도에서도 비교적 양호한 생육 활성을 나타내고 있음을 실험을 통해 알 수 있어서, 미생물을 이용한 생물학적 처리의 문제점인 겨울철 처리 효율에 있어서도 안정적인 처리 효율을 유지할 수 있는 균주로서 이용이 가능할 것으로 예상된다.
균주의 처리구와 비교해보면, 담체에 고정된 균주의 처리구가 더 효율적이었다. 앞으로 다양한 방법의 미생물 고정담체를 이용한 담체고정 효과 실험을 수행하여 더욱 더 좋은 효과를 가진 미생물 고정용 담체 개발이 요구되어진다.
참고문헌 (12)
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