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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 질소를 제거해 줄 수 있는 미생물을 폐수처리에 이용하고자 자연계에서 생육이 양호하며 유기물 분해능이 우수한 균주인 Bacillus sp.를 이용하여 수질 중의 질소 제거 능력을 조사하였으며, 이와 같은 질소산화 능력을 수처리 공정에 적용할 수 있는 균주로 개발하고 자 기초적 연구를 수행하였기에 보고 하고자한다.
- 암모니아성 질소의 산화를 측정하기 위하여 ammonium sulfate를 첨가한 배지에서 배양한 후, 시간대에 따른 암모니아의 경시적인 감소율 변화를 보고자 하였다. 일정 시간대 별로 샘플링하여 균생육 정도를 측정하고 생육된 균을 4℃, 10, 000 rpm에서 원심분리 하여 얻은 배지의 상등액에 존재하는 암모니아성 질소, 아질산성 질소 및 질산성 질소의 함량을 측정하였다.
제안 방법
- 실험 균주인 Bacillus sp. A8-8을 공장 폐수와 생활 하수 를 이용하여 폐수에 존재하는 암모니아성질소 및 아질산성 질소 산화율을 측정하였다. 미리 전 배양한 균주를 접종하고 아무런 영양원을 첨가하지 않고서 30 ℃ 에서 진탕하 면서 질소의 산화률을 측정한 결과를 Fig.
- 일정 시간대 별로 샘플링하여 균생육 정도를 측정하고 생육된 균을 4℃, 10, 000 rpm에서 원심분리 하여 얻은 배지의 상등액에 존재하는 암모니아성 질소, 아질산성 질소 및 질산성 질소의 함량을 측정하였다. 또한, 아질산성 질소의 산화를 확인하기 위해서는 sodium nitrite를 첨가한 배지에서 배양한 배양 상등액으로부터 동일 방법으로 샘플링하여 균생육정도를 측정하고 생육된 배지의 상등액에 존재하는 각종 아질산성 질소와 질산성 질소의 함량을 측정하였다.
- 미생물을 고정시킨 고정 담체를 이용한 질소의 산화능 을 조사하고자, 고정 담체를 암모니아성 질소로 sodium sulfate를 첨가한 배지에 넣었고 탄소원으로 0.5% 폐당밀을 첨가하여 30℃ 에서 교반 시키면서 암모니아성 질소와 아질 산성 질소가 경시적으로 산화되어 변화된 결과를 Fig. 7에 나타냈다. 담체를 1/50, 1/250 (v/v) 양으로 접종한 시험 결과, 반응 후 24시간에는 초기의 암모니아성질소가 전부 없어진 결과를 보였으며 액체 배양 조건에서와 같이 질산성 질소가 초기에 다량 존재하였다가 24시간 이후부터 크게 감소하는 경향이었다.
- 배양한 미생물을 담체에 고정시킨 sample을 2-4% glutaraldehyde (0.1M cacodylate buffer pH 7.2, 0.1% MgSO4 포함)로 30분에서 24시간동안 실온에서 전고정하였다. Cacodylate buffer pH 7.
- 실험 균주의 배양학적 조건에 따른 질소의 산화력을 조사하고자 배양 온도 및 배양 배지의 초기 pH에 따른 균주의 생육 특성을 조사하였다 (Fig. 1). 실험 균주 Bacillus sp.
- 실험 균주의 생육도는 610nm의 홉광도로 측정하였으며, 사용한 기기는 UV-spectrophotometer(Phamacia Biotech, Ultrospec3000, U.S.A)를 사용하였다. 암모니아성질소 및 아질산성 질소 산화 균주의 산화율은 배지 내의 암모니아 성 질소, 아질산성 질소 및 질산성 질소의 농도 변화를 경시적으로 측정하여 비교하였다.
- A)를 사용하였다. 암모니아성질소 및 아질산성 질소 산화 균주의 산화율은 배지 내의 암모니아 성 질소, 아질산성 질소 및 질산성 질소의 농도 변화를 경시적으로 측정하여 비교하였다. 암모니아성 질소는 인돌페 놀법, 아질산성 질소는 디아조화법, 질산성 질소는 부루신법을 이용하였으며, 이는 수질오염 공정 시험법에 준하여 분석하였다 [1].
- 이때 건조된 담체의 다공질 공극 사이로 수분이 충전되면서 미생물 입자가 흡착, 고정되어 생물막을 형성하게 된다. 이 과정에서 형성된 생물막의 모습을 전자 현미경으로 관찰하여 확인하였다. 질소 산화능의 측정은 미생물이 부착된 담체를 1/50, 1/250 (v/v)의 양이 되게 액체 배지에 접종한 후, 경시적으로 암모니아성 질소와 질산성 질소의 변화 양상을 측정하였다.
- 암모니아성 질소의 산화를 측정하기 위하여 ammonium sulfate를 첨가한 배지에서 배양한 후, 시간대에 따른 암모니아의 경시적인 감소율 변화를 보고자 하였다. 일정 시간대 별로 샘플링하여 균생육 정도를 측정하고 생육된 균을 4℃, 10, 000 rpm에서 원심분리 하여 얻은 배지의 상등액에 존재하는 암모니아성 질소, 아질산성 질소 및 질산성 질소의 함량을 측정하였다. 또한, 아질산성 질소의 산화를 확인하기 위해서는 sodium nitrite를 첨가한 배지에서 배양한 배양 상등액으로부터 동일 방법으로 샘플링하여 균생육정도를 측정하고 생육된 배지의 상등액에 존재하는 각종 아질산성 질소와 질산성 질소의 함량을 측정하였다.
- 이 과정에서 형성된 생물막의 모습을 전자 현미경으로 관찰하여 확인하였다. 질소 산화능의 측정은 미생물이 부착된 담체를 1/50, 1/250 (v/v)의 양이 되게 액체 배지에 접종한 후, 경시적으로 암모니아성 질소와 질산성 질소의 변화 양상을 측정하였다.
- A8-8을 사용하였다. 질소의 이용이 양호하도록 암모니아가 함유된 배지(Table 1)에서 7일간 진탕 배양을 하면서 암모니아성질소 산화능이 있음을 확인한 뒤에 공시 균주로 사용하였다. 균주의 일반적인 계대 배양은 LB-broth를 사용하였으며, 질소산화 측정을 위한 배지의 조성은 Table 1에 나타낸 바와 같다.
- 고정된 샘플에서 용액을 제거한 뒤에 탈수를 한다. 탈수 과정은 50%, 70%, 95% 에탄올에서 각 10분간, 그리고 무수 에탄올에서 10분 간 2회 탈수한다. 탈수한 뒤에 샘플을 풍건하고, 임계점 건조기에서 건조한 뒤에, 주사전 자현미경(SEM, JSM35CF, JAPAN)으로 관찰하여 사진 촬영하였다 [8].
- 탈수 과정은 50%, 70%, 95% 에탄올에서 각 10분간, 그리고 무수 에탄올에서 10분 간 2회 탈수한다. 탈수한 뒤에 샘플을 풍건하고, 임계점 건조기에서 건조한 뒤에, 주사전 자현미경(SEM, JSM35CF, JAPAN)으로 관찰하여 사진 촬영하였다 [8].
이론/모형
- 암모니아성질소 및 아질산성 질소 산화 균주의 산화율은 배지 내의 암모니아 성 질소, 아질산성 질소 및 질산성 질소의 농도 변화를 경시적으로 측정하여 비교하였다. 암모니아성 질소는 인돌페 놀법, 아질산성 질소는 디아조화법, 질산성 질소는 부루신법을 이용하였으며, 이는 수질오염 공정 시험법에 준하여 분석하였다 [1].
성능/효과
- 같은 질소의 농도를 처리하여 균주가 고정된 담체와 액체 배양균을 처리한 결과를 비교해보면, 담체의 경우 반응 후 24시간에 초기의 암모니아성 질소와 질산성 질소가 전부 없어진 반면, 액체 배양균은 36시간에 전부 없어졌다. 이 결과는 담체가 액체 배양액보다 효율이 우수함을 나타 내준다.
- 2에서 보여주고 있다. 균주의 생육도는 탄소원 농도에 따라 약간의 차이를 보였으며, 배양 12시간 때부터 암모니아성 질소의 감소를 보이기 시작해 24시간 이후에 암모니아성 질소를 72% 정도까지 감소시키고, 암모니아성 질소의 산화가 증가되면서 배양 30시간 후에는 아질산 생성이 최고를 나타내었다가 점차 감소되는 현상을 볼 수 있었다(Fig. 2A). 탄소원으로 0.
- 5에서 pH 10까지의 범위에서 생육이 양호 하였으며, 배양된 균주의 밀도를 높게 접종한 경우는 보다 더 폭넓은 범위의 초기 생육 pH에서도 생육 활성이 가능 하였다 (자료 미제시). 다양한 배양 온도에서의 생육도를 실험한 결과 28℃, 37℃ 그리고 42E에서 생육이 양호하였 으며 비교적 양호한 생육 활성을 나타내 보이는 생육 가능 온도 범위는 4℃에서 45℃로 넓게 나타났다. 본 결과는 미생물을 이용한 생물학적 처리의 문제점인 겨울철 처리 효율에 있어서도 안정적인 처리 효율을 유지할 수 있는 균주로서 이용이 가능할 것으로 예상된다.
- 7에 나타냈다. 담체를 1/50, 1/250 (v/v) 양으로 접종한 시험 결과, 반응 후 24시간에는 초기의 암모니아성질소가 전부 없어진 결과를 보였으며 액체 배양 조건에서와 같이 질산성 질소가 초기에 다량 존재하였다가 24시간 이후부터 크게 감소하는 경향이었다. 이때 균주를 직접 배양한 처리구에서와 같이 아질산성 질소의 생성은 계속하여 비슷한 양적 변화를 나타내었다.
- A8-8의 균주를 48시간 동안 배양한 배양액을 세라믹 담체에 고정시켰다. 담체에 고정된 미생물의 상태를 확인하고자 주사전자현미경(SEM) 으로 관찰하여 사진 촬영한 결과, 담체의 공극에 수많은 미생물이 잘 고정되어 있는 것을 확인하였다(Fig 6).
- 5배 늘어난 후 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 공장 폐수에서의 질소 제거 능력은 사용한 분 리 균주에서 높은 제거 효과를 나타내었다. Fig.
- A8-8의 생장률이 보다 빨랐다. 배양 12시간 이후 더 빠른 암모니아성 질소의 제거율을 보였으며, 30시간 이후 잔존량이 측정되지 않았으며, 상대적으로 아질산성 질소는 0.5% glucose 처리주에 비해 상대적으로 높은 증가를 보이다가 감소하였으며 이는 탄소원의 농도가 증가함에 따라 암모니아성 질소의 산화율이 증가되어지는 현상으로 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 한편 탄소원으로 0.
- 5% glucose를 첨가시킨 배지에서는 배양 12시간 이후 첨가하여준 아질산성 질소를 거의 소모하였다. 아질 산성 질소의 산화 경향은 모든 아질산성 질소가 소모된 배양 12시간 전에 질산성 질소의 증가가 최대치를 보였다가 급격히 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 남[7] 등이 분리한 질소산화 균주는 아질산성 질소 산화시에 4일 후에는 아질산성 질소가 거의 제거되면서 상대적으로 질산성 질소가 증가되는 균주였으나 본 실험에서의 균주는 질산성 질소가 일시적으로 증가하다가 감소함으로서 질소 제거 효과가 뛰어난 것으로 생각되어질소 제거용 균주로서는 더욱 적합하다고 할 수 있겠다.
- A8-8을 처리한 경우 62% 정도의 감소를 관찰하였으며, 이러한 암모니아성 질소의 급속한 감소로 악취가 제거됨을 관찰할 수 있었다. 아질산성 질소는 배양 48시간 이후 최 고치가 되었다가 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같이 질소산화 능력이 우수한 Bacillus sp.
- 아질 산성 질소의 산화 경향은 모든 아질산성 질소가 소모된 배양 12시간 전에 질산성 질소의 증가가 최대치를 보였다가 급격히 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 남[7] 등이 분리한 질소산화 균주는 아질산성 질소 산화시에 4일 후에는 아질산성 질소가 거의 제거되면서 상대적으로 질산성 질소가 증가되는 균주였으나 본 실험에서의 균주는 질산성 질소가 일시적으로 증가하다가 감소함으로서 질소 제거 효과가 뛰어난 것으로 생각되어질소 제거용 균주로서는 더욱 적합하다고 할 수 있겠다.
후속연구
- 질산성 질소는 반응 초기부터 높은 수치를 보이다가 배양 24시간 이후부터 급격히 감소하여 glucose를 처리한 경우와는 상이한 결과를 보였는데, 이는 탄소원으로 사용한 폐당밀의 성분에 의한 것으로 생각되어진다. 따라서 이 균주를 생물학적 처리용 미생물 제재로서 개발 할 때에는 저농도 탄소원에서의 균주 생육조건 확립과 저렴한 탄소원을 이용한 배양시험을 실시하여 보다 더 경제적이며 적합한 배양 조건과 질소 제거 효과의 확립을 위한 실험이 더욱 요망되어진다.
- 다양한 배양 온도에서의 생육도를 실험한 결과 28℃, 37℃ 그리고 42E에서 생육이 양호하였 으며 비교적 양호한 생육 활성을 나타내 보이는 생육 가능 온도 범위는 4℃에서 45℃로 넓게 나타났다. 본 결과는 미생물을 이용한 생물학적 처리의 문제점인 겨울철 처리 효율에 있어서도 안정적인 처리 효율을 유지할 수 있는 균주로서 이용이 가능할 것으로 예상된다.
- 이러한 암모니아성 질소의 제거에는 세라믹 담체에 고정된 균주의 질소산화 효과를 액체 배양한 균주의 처리구와 비교해 보면, 담체에 고정된 균주의 처리구가 더 효율적이었다. 앞으로 다양한 방법의 미생물 고정 담체를 이용한 담체 고정 효과 실험을 수행하여 더욱 더 좋은 효과를 가진 미생물 고정용 담체 개발이 요구되어진다.
- 그러나 배양시간이 길어짐에 따라 암모니아성질소 제거 효율이 거의 변화가 없는 것은 폐수 중의 영양원이 고갈된 것이 원인으로 생각된다. 이러한 결과는 생물학적 처리시스템에 이용하기 위하여 미생물을 고정시킨 담체를 폭기조내로 보충함으로서 폐수내의 질소 제거 처리가 가능할 것으로 예상되어서 혐기적 배양 및 호기적 배양에 따른 확인실험이 더 요구되어진다.
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