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문제 정의
- 본 연구에서는 우선 국내외에서 수집 .재배한 23종류 유색미의 항산화 활성을 검정함으로서 항산화 효과가 우수한 유색미 품종을 선발하고, 아울러 유색미 함유 색소의 양을 측정하여 항산화 효과와 유색미 색소함량 간의 상관성을 검토함으로써, 건강 기능성 신소재로서의 유색미 이용을 위한 기본자료를 제시하고자 하였다.
제안 방법
- OH) 소거활성. 100 mM 인산완충액 (pH 7.4) 1.39 ml, 10 mM FeSO4 - EDTA 용액 0.2 mZ, 10 mM 2- deoxyribose 용액 0.2 mZ 시료 0.01 mZ를 cap tube에 넣은 뒤 10 mM H2O2 용액 (Buffer solution) 0.2 mZ를 첨가하여 371에서 4시간 동안 교반하면서 hydroxy radical( . OH) 생성 및 반응을 유도하였고, 2.8% TCA 용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 0.8% TBA 용액으로 100℃에서 10분간 발색을 유도, 532nm에서 흡광도를 측정하였다. 한편 4시간의 반응 없이 10 mM H2O2 용액으로 radical 생성을 유발하는 즉시 반응을 중단, 발색을 유도한 것을 미처리구로 하였다.
- 한편 4시간의 반응 없이 10 mM H2O2 용액으로 radical 생성을 유발하는 즉시 반응을 중단, 발색을 유도한 것을 미처리구로 하였다. 비색정량에서 유색미 추출물 색의 영향을 배제하고, radical 생성반응 없이 추출물 자체가 2-deoxyribose를 산화하는지 알아보기 위해 100 mM 인산완충액 1.79 m/, 10 mM 2-deoxyribose 용액 0.2 m/에 시료 0.01 ml를 첨가하고 4시간 반응시켰다가 상기와 같은 방법으로 발색을 유도, 흡광도를 측정하여 시료 대조 군의 흡광도로 하였다. 식 (2)에 의하여 hydroxy radical 소거능을 계산하였다.
- DPPH radical에 대한 전자공여 능. 에탄올 1 mL, 시료 0.01 ml, 100 mM 초산 완충액 (pH 5.5) 0.99 ml를 분주한 시험관에 0.5 mM DPPH 용액 (Abs. EtOH 용액) 0.5 m: 첨가하여 교반하고 30분간 정치한 후 517nm에서의 흡광도를 측정하였고, 유색미 추출물 자체의 색으로 인한 비색 정량 과정의 오류를 제거하기 위해 에탄올 Im/, 시료 0.01 ml, 100mM 초산완충액 1.49ml의 시료대조군을 만들어 흡광도를 측정, 그 값을 시료대조군의 흡광도라 하였고 식 (1)에 의해 전자공여능을 계산하였다.
- 색소체 함량 정량. 유색미 미강층에 함유되어 있는 색소는 (CH2CL2)로 지질을 제거한 미강층을 다시 3% TFA-70% MeOH, ethylacetate/HjOC 1: 1, v:v)로 순차적으로 분획한 후 물 분획을 MCI gel column으로 chromatography하여 분리, 정량하였다.
- 1)을 서울대학교 농학과에서 분양받았고, 대조군으로 일반미인 추청을 시중에서 구입하여 사용하였다. 품종별 시료의 미강에 70% 에탄올을 5배량 첨가하여 4UC에서 14시간 동안 진탕하면서 추출한 후 감압 건조하고, DMSO에 용해시켜 200mg/m/의 농도로 만들어 -20℃에서 냉동 보관하면서 사용하였다. DPPH(l, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl), 2-deoxyribose, linoleic acid, ?-BuOOH, TBA(thiobarbituric acid), FeSO4, K3Fe(CN)6, ascorbic acid, oc-tocopherol, BHT(butylated hydroxytoluene) 등은 Sigma 사 (St.
- 생산자원의">℃에서 10분간 발색을 유도, 532nm에서 흡광도를 측정하였다. 한편 4시간의 반응 없이 10 mM H2O2 용액으로 radical 생성을 유발하는 즉시 반응을 중단, 발색을 유도한 것을 미처리구로 하였다. 비색정량에서 유색미 추출물 색의 영향을 배제하고, radical 생성반응 없이 추출물 자체가 2-deoxyribose를 산화하는지 알아보기 위해 100 mM 인산완충액 1.
대상 데이터
- 재료 및 시약. 국내외에서 수집하고 재배한 유색미 23 품종(Fig. 1)을 서울대학교 농학과에서 분양받았고, 대조군으로 일반미인 추청을 시중에서 구입하여 사용하였다. 품종별 시료의 미강에 70% 에탄올을 5배량 첨가하여 4UC에서 14시간 동안 진탕하면서 추출한 후 감압 건조하고, DMSO에 용해시켜 200mg/m/의 농도로 만들어 -20℃에서 냉동 보관하면서 사용하였다.
- DPPH(l, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl), 2-deoxyribose, linoleic acid, ?-BuOOH, TBA(thiobarbituric acid), FeSO4, K3Fe(CN)6, ascorbic acid, oc-tocopherol, BHT(butylated hydroxytoluene) 등은 Sigma 사 (St. Louis, USA), TCA (trichloroacetic acid), HQ?는 Junsei사(Tokyo, Japan)에서 그리고 MCI gele Mitsubishi사(Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
- 14)건강 기능성 쌀가공식품 소재로서의 유색미이용에 대해서 활발하게 연구되고 있지는 않은 실정이다. 본 연구에서는 우선 국내외에서 수집 .재배한 23종류 유색미의 항산화 활성을 검정함으로서 항산화 효과가 우수한 유색미 품종을 선발하고, 아울러 유색미 함유 색소의 양을 측정하여 항산화 효과와 유색미 색소함량 간의 상관성을 검토함으로써, 건강 기능성 신소재로서의 유색미 이용을 위한 기본자료를 제시하고자 하였다.
데이터처리
- 통계분석. 여러가지 항산화 활성 측정결과와 유색미 미강층의 색소체 함량과의 상관관계를 알아보기 위해 SPSS PC + (SPSS Inc., Chicago, USA)프로그램으로 correlation coefficient 를 구하였다.
이론/모형
- 억제효과. 0.13% Hnoleic acicVEtOH 용액 5 ml, 탈이온수 2.4 m2, 50 mM 인산완충액 (pH 7.0) 5 m/, 시료 0.1 ml를 cap tube에 넣고 40℃ incubator에 보관하면서 지질 과산화 정도를 thiocyanate법16)에 의해서 측정하였다. 즉, 8일 경과 후 반응액 0.
성능/효과
- 본 실험에 사용한 hydroxy radical 소거활성 측정 방법은 과산화수소와 철이온과의 반응, 즉 Fenton 반응에 의해 생성되는 hydroxy radical에 의해 반응계의 기질로 사용된 2-deoxyribose가 산화되면서 생성되는 과산화물인 malondialdehyde의 양을 비색정량하는 방법으로 과산화물 생성의 억제정도를 평가하여 hydroxy radical 소거활성을 검정할 수 있다. Table 2에서도 알 수 있듯이 전자공여능의 경우와는 달리 hydroxy radical 소거활성은 품종에 따라 상당한 차이가 있었는데 DK-1, IR 1544-38-2-2-1-2-2, SC-5, SC-45, 추청, wx 124-163-45-7-1-1 등의 품종이 합성 항산화제인 BHT 보다 높은 radical 소거 활성을 보였다. 반면 LK 2-7-12-1-1 은 radical 생성을 억제하거나 그 활성을 억제하지 못하고 과산화물의 생성을 촉진하는 산화효과를 나타내고 있었고, DV 85 및 DZ 78 등의 유색미는 아주 미약한 hydroxy radical 소거활성을 나타내는 품종임을 알 수 있었다.
- 각각의 항산화 활성 측정 결과를 살펴보면 유색미 에탄올 추출물의 환원력은 모든 유색미 품종이 일반미 품종인 추청에 비해서 높은 활성을 나타났으며, 특히 환원력이 우수한 품종은 LK 1-3-6-12-1-1, Elwee, DZ 78, Jumlalocal-1, SC-45 등이었고 DPPH radical에 대한 전자공여능이 높은 품종들은 HP 883- 1-1-1-B-l-l, HP 833-1-3-1-1-1, LK-2-7-12-1-1, DZ 78 등이었다. Hydroxy radical 소거활성이 큰 품종은 DK-1, IR 1544- 38-2-2-1-2-2, SC-5, SC-45 등이었는데 LK 2-7-12-1-1은 기질인 2-deoxyribose에 대해 미약하나마 산화촉진효과를 보이고 있었다.
- 이외에도 여러가지 항산화 활성측정 결과에서 일관된 상관성 없이 반응계에 따라 각기 다른 활성을 보인 유색미 품종이 있었는데 DZ 78의 경우 환원력과 DPPH radical 소거 능은 우수하였으나 hydroxy radical에 대해서는 소거활성이 매우 낮았고 linoleic acid 자동산화반응은 오히려 촉진하고 있었다. 또한 LK 2-7-12-1-1은 hydroxy radical 활성을 억제하거나 소거하지 못하고 반응계에서 미약하나마 산화적인 영향을 미치고 있었으나 환원력과 DPPH radical 소거능은 우수하였고 Unoleic acid 자동산화 반응계에서도 항산화 활성을 나타내고 있었다. 한편 본 연구에서 실시한 모든 항산화 활성 측정 결과에서 대체적으로 비교적 높은 항산화 활성을 나타낸 유색미 품종은 SC-5 이었다.
- 유색미추출물의 색소체 함량과 앞서 측정하였던 환원력, DPPH radical 에 대한 전자공여능, hydroxy radical 소거능, 지질과산화 억제 효과 등과의 상관관계를 검토한 결과 Table 4에 나타낸 바와 같이 색소체 함량과 전자공여능, hydroxy radical 소거능, 지질과산화 억제효과와는 상관성이 없었으며, 환원력에 있어서는 어떤 농도의 결과와도 정의 상관성이 있었다. 또한 유색미 추출물의 항산화 활성을 측정하기 위해서 사용한 여러가지 항산화 활성 측정방법의 결과간에는 별다른 상관성이 없었으나, 추출물의 고농도 처리 시에 발현된 환원력과 지질 과산화 억제 효과와는 부의 상관성이 있었다. 즉, 고농도에서 우수한 환원력을 나타내는 유색미 품종이 linoleic acid의 자동산화 반응계에서는 오히려 산화촉진효과를 나타낼 수 있었고 따라서 유색미 추출물의 독성에 대한 검정도 시도하여야 할 필요가 있음을 시사하는 결과라고 생각되었다.
- Table 2에서도 알 수 있듯이 전자공여능의 경우와는 달리 hydroxy radical 소거활성은 품종에 따라 상당한 차이가 있었는데 DK-1, IR 1544-38-2-2-1-2-2, SC-5, SC-45, 추청, wx 124-163-45-7-1-1 등의 품종이 합성 항산화제인 BHT 보다 높은 radical 소거 활성을 보였다. 반면 LK 2-7-12-1-1 은 radical 생성을 억제하거나 그 활성을 억제하지 못하고 과산화물의 생성을 촉진하는 산화효과를 나타내고 있었고, DV 85 및 DZ 78 등의 유색미는 아주 미약한 hydroxy radical 소거활성을 나타내는 품종임을 알 수 있었다.
- 유색미추출물의 색소체 함량과 앞서 측정하였던 환원력, DPPH radical 에 대한 전자공여능, hydroxy radical 소거능, 지질과산화 억제 효과 등과의 상관관계를 검토한 결과 Table 4에 나타낸 바와 같이 색소체 함량과 전자공여능, hydroxy radical 소거능, 지질과산화 억제효과와는 상관성이 없었으며, 환원력에 있어서는 어떤 농도의 결과와도 정의 상관성이 있었다. 또한 유색미 추출물의 항산화 활성을 측정하기 위해서 사용한 여러가지 항산화 활성 측정방법의 결과간에는 별다른 상관성이 없었으나, 추출물의 고농도 처리 시에 발현된 환원력과 지질 과산화 억제 효과와는 부의 상관성이 있었다.
- Linoleic acid를 가열 처리하여 자동산화반응을 유도한 후 시료를 첨가하여 40℃에서 보관하면서 유색미 추출물에 의한 linoleic acid의 산화억제정도를 측정한 하였는데 Elwee, Jumlalocal-1, SC-45, Pankahari 203, DV 85, Muthumanikam, DZ 78, B-89-11-2, 길림흑미 등의 품종들은 Unoleic acid의 자동산화 과정에서 지질 산화물의 형성을 촉진하는 산화효과를 가지고 있었다. 이에 비해서 RGS No. 336, LK IB-2-1-1, LK IB-4-12-1-1 등은 BHH보다 높은 항산화 활성을 보여 50% 이상 지질 과산화를 억제하였으며 LK 1A-2-12-1-1, LK 2-7-12- 1-1, HP 883-1-1-1-B-l-l, SC-5, HP 833-1-3-1-1-1, LK 1D-2- 12-1, IR 1544-38-2-2-1-2-2 등의 품종이 비교적 높은 항산화 활성을 보였다.
- 또한 유색미 추출물의 항산화 활성을 측정하기 위해서 사용한 여러가지 항산화 활성 측정방법의 결과간에는 별다른 상관성이 없었으나, 추출물의 고농도 처리 시에 발현된 환원력과 지질 과산화 억제 효과와는 부의 상관성이 있었다. 즉, 고농도에서 우수한 환원력을 나타내는 유색미 품종이 linoleic acid의 자동산화 반응계에서는 오히려 산화촉진효과를 나타낼 수 있었고 따라서 유색미 추출물의 독성에 대한 검정도 시도하여야 할 필요가 있음을 시사하는 결과라고 생각되었다.
- 이런 작용의 여러 가지 기전 중에서 활성산소종 및 유리기에 전자를 공여하는 능력이 환원력이므로 이를 측정하여 항산화 활성을 검정하는 수단으로 이용할 수 있으며 환원력이 클수록 녹색에 가깝게 발색되므로 항산화 활성이 큰 품종일수록 높은 흡광도 값을 나타낸다. 품종별 유색미 에탄올 추출물들의 환원력을 측정한 결과(Table 1), 일반미 품종인 추청에 비해 모든 유색미 품종이 높은 환원력을 나타내었다. 특히 LK 1-3-6-12-1-1, Elwee, DZ 78, Jumlalocal-1, SC-45, LK 1A-2-12-1-1, Pamkhari 203 등의 품종이 강한 항산화 활성을 보였다.
- 또한 LK 2-7-12-1-1은 hydroxy radical 활성을 억제하거나 소거하지 못하고 반응계에서 미약하나마 산화적인 영향을 미치고 있었으나 환원력과 DPPH radical 소거능은 우수하였고 Unoleic acid 자동산화 반응계에서도 항산화 활성을 나타내고 있었다. 한편 본 연구에서 실시한 모든 항산화 활성 측정 결과에서 대체적으로 비교적 높은 항산화 활성을 나타낸 유색미 품종은 SC-5 이었다.
- 항산화 활성 측정 결과와 색소체 함량간의 상관성 검정에서 색소체 함량은 환원력과 정의 상관성이 있었으며, 항산화 활성결과 간의 뚜렷한 상관성은 나타나지 않았으나 지질 과산화 억제 활성과 환원력간에는 부의 상관성이 나타나 추출물이 고농도로 처리되었을 때 높은 환원력을 보인 유색미 품종은 linoleic acid 자동산화반응에서 지질 과산화를 촉진하는 경향이 있었다. Elwee, Jumlalocal-1, SC-45, Pamkhari 203 등의 품종에서 볼 수 있듯이 이들은 환원력이 우수하였고 DPPH radical과 hydroxy radical에 대해서도 우수한 소거능을 나타내었으나 linoleic acid 자동산화 반응계에서 20% 이상 산화를 촉진하고 있었다.
후속연구
- 시료에 함유된 복잡하고 다양한 성분들의 상호작용이나 항산화 활성의 발현이 여러 반응계의 서로 다른 조건의 영향에 따라 상당히 변화되리라 예상되며, 또한 정제 항산화제를 사용한 경우에도 실험방법에 따라 항산화 활성의 정도가 상당히 달라지는 것을 볼 때 동일 성분이라도 실험 반응계에 따라 용해도, 친화성, 반응성 등이 변화되어 각기 다른 결과를 가져올 수 있기 때문이다. 실제로 본 연구에서 실시한 환원력, DPPH radical에 대한 전자공여능력, hydroxy radical 소거활성, 지질 과산화 억제효과 등 4가지 항산화 활성 측정법에 의한 결과간에는 서로 상관성이 나타나지 않았고 따라서 여러가지 실험 방법을 병행하여 평가함으로서 항산화 활성 측정 방법상의 오류를 보정할 필요가 있다고 할 수 있다.
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