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문제 정의
- 또한 본 연구에서 사용퇸 방법을 이용하면, 국내산 식물이 함유하고 있는 새로운 종류의 혈관신생 억제물질들을 찾아내어 자원화 할 수 있을 것이다. 본 연구는 emodin이 현재까지 보고된 여러 가지 생리활성 이외에 혈관신생 억제활성을 가지고 있다는 사실을 보여주는 것으로서, 혈관신생 관련 질환의 천연물 유래 치료제를 개발하는데, emodin을 함유하고 있는 호장근이 중요한 식물자원으로 활용될 수 있다는 점을 시사한다.
- 본 연구는 호장근으로부터 emodin을 분리하고, 분리된 emodin이 혈관내피세포의 이동과 혈관신생에 어떻게 작용하는지를 알고자 수행되었다. 호장근에서 분리한 emodin은 혈관내피세포의 이동과 혈관신생을 억제하였다.
- 현재까지 emodin에 의한 생리활성은 여러 가지로 보고되어있으나, emodin의 혈관신생에 대한 작용은 보고되지 않았기에, 본 연구에서는 혈관신생 관련 질환에 대한 천연물 유래 치료제의 개발을 위한 기초로 삼고자, 호장근에 함유된 emodin의 정제방법을 개선하고 이 emodin이 혈관내피세포의 이동과 혈관신생에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 이때 시료도 같이 처리해주었으며 gel의 위를 2% FBS첨가 DME배지로 덮어주었다. 48시간 동안 배양하고 MC bead에서 fibrin gel 속으로 뻗어 나온 sprout를 관찰하고 그 수를 측정하였다. MC-bead의 직경보다 더 길게 뻗어 나온 sprout만을 세어서 추출물의 처리 효과를 측정하였다.
- For CAM assay, emodin or vehicle containing cover slip was located on CAMs of 4-5 day chicken embryos as described in material and methods. After 48-72 hours, the formation of avascular zones was analyzed and photographed under stereomicroscope. Representative photographs of an example of control and emodin(l μgper cover-slip)- treated CAM.
- 혈관내피세포의 migration assay. HUVECs 의 이동은 Boyden chamber(Neuroprobe Inc.)를 이용하여 측정하였다.14) 시료가 첨가된 1% FBS-첨가 M199배지를 chamber의 아래 well 에 넣고 0.
- 48시간 동안 배양하고 MC bead에서 fibrin gel 속으로 뻗어 나온 sprout를 관찰하고 그 수를 측정하였다. MC-bead의 직경보다 더 길게 뻗어 나온 sprout만을 세어서 추출물의 처리 효과를 측정하였다.
- Preparative HPLC. Preparative HPLC(LKB2150 dual pump system)는 Delta BAK C18-100 A(3(X) X 78 mm) column을 이용하여 시행하였다. 용출은 A용액(0.
- Emodin 이 첨가된 10㎕의 methylcellulose을 plastic cover slip(Thermanox, Nunc) 에 올려놓고 건조시킨 후, 이를 발생 중인 닭 배아의 chorioallantoic membrane(CAM)에 위치시켜 48-72시간 더 배양하였다. 약물이 함유된 cover-slip을 올려놓은 부위를 stereoscope로 관찰하고 촬영하였다.
- Polycarbonate membrane은 윗면의 세포를 면봉으로 닦아낸 후, methanol로 고정하고 Diff-Quik 용액으로 염색하였다. 염색된 이동한 세포는 200배 시야의 현미경 하에서 관찰하고 그 수를 세었다.
- Preparative HPLC(LKB2150 dual pump system)는 Delta BAK C18-100 A(3(X) X 78 mm) column을 이용하여 시행하였다. 용출은 A용액(0.4% phosphoric acid) 에 대한 B용액(80% CH3CN in soln A)의 농도를 20% (10분), 40%(15분), 70%(20분), 75%(25분) , 0%(27분) 등의 5단계 구배로 변화시키면서 진행하였다. 이때의 유속조건은 0.
- 5 :1로 혼합한 전개용매에서 전개시킨 다음, 암소에서 건조하여 전개된 결과를 보았다. 이때 표준시약으로 구입한 emodin(Sigma)을 같이 전개시켜 Rf 값이 같은 부분의 band를 절단하여 모은 다음, 메탄올로 추출하여 HPLC에서 분석하였다. HPLC 분석에는 C18 Nova RMC(150 X 3.
- 4). 이러한 emodin의 혈관신생 억제효과가 in vivo에서도 나타나는지를 보기 위하여 발생 초기의 chorioallantoic membrane (CAM)에 emodin 1 pig을 처리하였다. 그 결과 emodin의 처리에 의해 정상적인 CAM에 형성되는 혈관들의 밀도가 감소하며, 이로 인해 형성되는 무혈관 지역이 나타나는 것을 볼 수 있었다(Fig.
- 세포배양. 인간탯줄정맥 내피세포(HUVECs)는 탯줄정맥을 collagenase로 처리하여 분리하였으며, 같은 방법으로 돼지 폐동맥으로부터 돼지폐동맥 내피세포(PRXECs)를 분리하였다.13) HUVECs과 PPAECs는 각각 20% FBS-첨가 M199배지 (Sigma) 와 10% FBS-첨가 DME배지 (Sigma)를 사용하여 배양하였으며, 실험에는 계대 수가 3-5인 세포를 사용하였다.
- 1). 조 추출물에서 emodin만을 정제하기 위하여, 조추출물을 TLC plate에 band상으로 전개시키고 표준 emodin과 Rf 값이 같은 band를 절단하여(Fig. 2), 메탄올로 용출시켰다. 이 용출액을 HPLC에서 분석한 결과, 표준 emodin을 기준으로 하여 retention time 23분 근처에서 나오는 peak가 emodin peak임을 알 수 있었다(Fig.
- Thin Layer Chromatography(TLC). 조추출액을 TLC plate(Silica gel, Merk) 에 band 상으로 spotting 한 후, chloroform과 methanol을 7.5 :1로 혼합한 전개용매에서 전개시킨 다음, 암소에서 건조하여 전개된 결과를 보았다. 이때 표준시약으로 구입한 emodin(Sigma)을 같이 전개시켜 Rf 값이 같은 부분의 band를 절단하여 모은 다음, 메탄올로 추출하여 HPLC에서 분석하였다.
- 한약재상으로부터 구입한 건조된 호장근 (Polygonum c*mn) spidat 을 분쇄하여, 메탄올을 주줄 용매로 하여 Soxhlet 추출장치에서 20시간 연속 추출하였다. 추출물을 여과하고 원심분리하여 고형물을 제거한 후, 조추출액으로 하였다.1,5)
- 조추출액의 제조. 한약재상으로부터 구입한 건조된 호장근 (Polygonum c*mn) spidat 을 분쇄하여, 메탄올을 주줄 용매로 하여 Soxhlet 추출장치에서 20시간 연속 추출하였다. 추출물을 여과하고 원심분리하여 고형물을 제거한 후, 조추출액으로 하였다.
- 혈관내피세포의 이동에 emodin이 어떤 영향을 주는지 알아보기 위하여, 혈관내피세포에 VEGF의 존재 하에서 또는 부재 하에서 호장근으로부터 추출한 emodin을 첨가하였다. Fig.
대상 데이터
- 인간탯줄정맥 내피세포(HUVECs)는 탯줄정맥을 collagenase로 처리하여 분리하였으며, 같은 방법으로 돼지 폐동맥으로부터 돼지폐동맥 내피세포(PRXECs)를 분리하였다.13) HUVECs과 PPAECs는 각각 20% FBS-첨가 M199배지 (Sigma) 와 10% FBS-첨가 DME배지 (Sigma)를 사용하여 배양하였으며, 실험에는 계대 수가 3-5인 세포를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CQ-incubator에서 배양하였다.
- 이때 표준시약으로 구입한 emodin(Sigma)을 같이 전개시켜 Rf 값이 같은 부분의 band를 절단하여 모은 다음, 메탄올로 추출하여 HPLC에서 분석하였다. HPLC 분석에는 C18 Nova RMC(150 X 3.9 mm) column0] 사용되었으며, UV detector(Shimazu UV 1601)의 파장은 303 nm였다.
- )을 그 위에 놓은 후, upper chambers 고정시켰다. HUVECs을 1% FBS-첨가 M199 배지에 부유 시켜 윗쪽 chamber의 각 well에 2 × 104개의 세포를 넣고 6시간 배양하였다. Polycarbonate membrane은 윗면의 세포를 면봉으로 닦아낸 후, methanol로 고정하고 Diff-Quik 용액으로 염색하였다.
데이터처리
- 통계처리. 유의성은 Student-Newman-Keuls test에 의한 1-way ANOVA를 사용하여 검사하였다. 통계적 유의성은 p<0.
이론/모형
- 생체내 혈관신생은 잘 알려진 CAM assay를 이용하여 측정하였다.17)요약하면, 부화 2-3일 경의 닭 수정란의 껍질을 제거하여 자체 제작한 100 mm의 오목 접시에 옮기고, 48시간 37℃ 배양기에서 더 배양하였다.
- 시험관 내 혈관신생과 생체 내 혈관신생 측정. 시험관 내 혈관신생은 fibrin gel을 이용한 PRXECs의 sprouting assay로 측정하였다15,16). Microcamer(MC) bead(직경 175|im) 에 PRkECs를 confluent한 상태로 자라게 한 다음, 이 MC bead를 fibrin 용액 (2.
- Emodin에 의한 혈관형성 억제. 혈관내피세포의 이동을 억제하는 emodin이 혈관신생도 억제하는지를 시험관내 혈관신생시험법인 sprout formation assay와 생체 내 혈관신생 모델을 이용하여 알아보았다. 시험관내 혈관신생 모델에서, emodin은 혈관내피세포 성장인자인 VEGF(10ng/mZ)에 의해 증가된 혈관신생을 억제하였다(Fig.
성능/효과
- 1,2) 천연물로부터 생리활성 물질을 검색하고 분리하는 최근까지의 추세에 더불어 호장근에도 resveratrol, lignan sulfate, piceid, emodin 등 중요한 생리활성을 지닌 많은 종류의 물질이 함유되어 있음이 밝혀졌다.3-6) 특히, emodin은 TNF에 의해 유도되는 NF-kB의활성를 억제하며, tyrosine kinase의 억제물질로 작용한다고 보고되어 있다.
- 혈관내피세포의 이동에 emodin이 어떤 영향을 주는지 알아보기 위하여, 혈관내피세포에 VEGF의 존재 하에서 또는 부재 하에서 호장근으로부터 추출한 emodin을 첨가하였다. Fig. 3에서 보는 바와 같이 혈관내피세포에 특이적으로 작용하는 성장인자인 VEGF 는 내피세포의 이동을 무처리군에 비해 10배 정도 증가시켰으며, 이와 같은 VEGF에 의한 혈관내피세포 이동의 증가를 emodin은 0.1 (ig/m/ 처리시 75.4 % 억제하였고, 1 처리 시 90% 이상으로 억제하였다. 따라서 호장근에서 추출된 emodin은 혈관신생의 주요 과정인 혈관내피세포의 이동을 강하게 차단하는 활성을 가졌다고 추정된다.
- Emodin의 분리. 건조된 호장근(15 g)을 Soxhlet 추출장치에서 연속 추출하여 얻은 조추출액을 분석하여 표준 시료의 peak 와 비교한 결과, resveratrol, emodin 등 호장근에 함유된 것으로 알려진 주요 물질들의 존재를 확인할 수 있었다(Fig. 1). 조 추출물에서 emodin만을 정제하기 위하여, 조추출물을 TLC plate에 band상으로 전개시키고 표준 emodin과 Rf 값이 같은 band를 절단하여(Fig.
- 이러한 emodin의 혈관신생 억제효과가 in vivo에서도 나타나는지를 보기 위하여 발생 초기의 chorioallantoic membrane (CAM)에 emodin 1 pig을 처리하였다. 그 결과 emodin의 처리에 의해 정상적인 CAM에 형성되는 혈관들의 밀도가 감소하며, 이로 인해 형성되는 무혈관 지역이 나타나는 것을 볼 수 있었다(Fig. 5). 이러한 결과들은 emodin이 시험관 내의 혈관신생은 물론 생체 내에서의 혈관신생도 강하게 억제한다는 점을 보여주는 것이다.
- 하지만, 이러한 형태의 항암작용은 기촌에 보고된 emodin의 활성만으로는 충분히 설명될 수 없는 것이며, 본 연구 결과에서 제시된 emodin의 혈관신생 억제활성과 같은 또 다른 활성이 관여하고 있다고 추정할 수 있다. 따라서 , 본 연구 결과는 emodin의 항암작용 메커니즘을 보다 잘 이해하는 데에 도움을 주는 것이라 생각된다. 또한 본 연구에서 사용퇸 방법을 이용하면, 국내산 식물이 함유하고 있는 새로운 종류의 혈관신생 억제물질들을 찾아내어 자원화 할 수 있을 것이다.
- 2), 메탄올로 용출시켰다. 이 용출액을 HPLC에서 분석한 결과, 표준 emodin을 기준으로 하여 retention time 23분 근처에서 나오는 peak가 emodin peak임을 알 수 있었다(Fig. 2). 동일한 용출 조건에서 반복적으로 preparative HPLC를 시행하여 이후 시험에 사용할 emo din을 수집할 수 있었다.
후속연구
- 따라서 , 본 연구 결과는 emodin의 항암작용 메커니즘을 보다 잘 이해하는 데에 도움을 주는 것이라 생각된다. 또한 본 연구에서 사용퇸 방법을 이용하면, 국내산 식물이 함유하고 있는 새로운 종류의 혈관신생 억제물질들을 찾아내어 자원화 할 수 있을 것이다. 본 연구는 emodin이 현재까지 보고된 여러 가지 생리활성 이외에 혈관신생 억제활성을 가지고 있다는 사실을 보여주는 것으로서, 혈관신생 관련 질환의 천연물 유래 치료제를 개발하는데, emodin을 함유하고 있는 호장근이 중요한 식물자원으로 활용될 수 있다는 점을 시사한다.
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