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문제 정의
- 본 연구에서는 단위동물 밀집 사육지역 하천의 미생물의 분포를 조사하는 과정에서 분리된 미생물 중 phytase 생산능이 우수한 균주를 동정하였으며, 분리균주가 갖는 phytase 생산 특성에 대하여 조사하였다.
제안 방법
- 배양배지는 phytase 생산배지를 사용하였으며, " 용량의 삼각 진탕 flask에 배지를 각각 100 m/, 200 m/, 400 m/씩 충진한 후 120시간 동안 배양하면서 phytase의 생산량을 측정하였다(Fig. 5). 배양용량이 100ml인 경우에는 균주의 생육이 가장 양호하였으나, 배양용량에 따른 생육도의 차이는 크지 않았다.
- 5mZ 을 첨가하여. 10분 발색시킨 후 분광광도계를 이용하여 700 nm 에서 흡광도를 측정하여 활성도를 계산하였다. 발색시약은 5.
- 0)에 도말 하였다. 3이에서 48시 간 동안 배양 후 콜로니 주위에 투명환이 형성된 균주를 선별하였다. 선별된 균주들을 PSM broth에 접종한 후 30℃에서 48시간 동안 진탕 배양한 후 배양 상징액에서 phytase의 활성을 분석하여 효소활성이 가장 우수한 균주를 분리하였다.
- PCR 반응은 miriicycler(MJ Research)를 이용하였고, PCR 반응물은 1% agarose gel, TAE bufifer(40 mM tris acetate, ImM ED1A)에서 100 V 30 mA로 40분간 전기영동 하였다. EtBr 용액에서 10분간 염색시켜 확인하고, PCR purification kit(Nucleogen Inc.)를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 pGEM-T easy vecter(Promega) 에 ligation 한 후 E.
- KHzPQ와 phytate를 인산원으로 사용하였으며, 각각의 농도를 0.01-0.10% 의 범위로 첨가한 배지에서 phytate의 생산에 대한 인산원의 종류와 농도에 따른 영향을 조사하였다. Fig.
- 반응액은 template DNA 400ng, BigDye 1 µl (ABI), buffer 2gZ, T7 및 SP6 primer를 각각 5pmol 첨가하여 최종적으로 20 µl로 조절하였다. PCR cycle 에서 10 초, 5UC에서 5초, 6(FC에서 4분, 50 cycles 수행하였디^ PCR 반응물의 정제는 HV filter plat(Millpore)에서 Sephadex G- 50-50(Sigma)을 이용하여 dye, 미 반응 dNTP, primer와 template를 제거하였다. 염기분석기 투입시료는 PCfi 정제 시료와 formamide를 1:1로 섞어서 10 µl로 만들어 사용하였다.
- 다음, 94P에서 denaturation 1분, 60P에서 annealing 1분 30초; 72P에서 extension 1분을 30회 반복하였고, 최종적으로 72℃에서 30분간 extensiori을 실시하였다. PCR 반응은 miriicycler(MJ Research)를 이용하였고, PCR 반응물은 1% agarose gel, TAE bufifer(40 mM tris acetate, ImM ED1A)에서 100 V 30 mA로 40분간 전기영동 하였다. EtBr 용액에서 10분간 염색시켜 확인하고, PCR purification kit(Nucleogen Inc.
- Phytase 생산배지에 MgSQ과 CaCl2를 0.025-0.20% 범위의 농도에서 첨가하여 배양한 후 이들 무기염이 phytase 생산에 미치는 영향을 조사하였다';. Table 6에서 보는 바와 같이 무기염을 첨가하지 않은 배지에서의 phytase 생산량에 비하여 MgSQ와 CaClj를 첨가한 배지에서는 첨가농도에 관계없이 phytase 생산량이 현저히 줄었다.
- Phytase의 생산에 영향을 미치는 통 기교 반의 효과는 일정용량의 flask에서 배지용량을 달리하여 조사하였다. 배양배지는 phytase 생산배지를 사용하였으며, " 용량의 삼각 진탕 flask에 배지를 각각 100 m/, 200 m/, 400 m/씩 충진한 후 120시간 동안 배양하면서 phytase의 생산량을 측정하였다(Fig.
- coli DH5a에 형질전환 시켰다. X-gal 함유 배지에 도말한 후 흰색의 colony를 분리하여 Wzard plus SV miniprep DNA purification sysetem을 이용하여 recombinant 클론을 선별하였다. Sequencing 반응은 PCR법에 기초한 dye-terminator 반응을 이용하였다.
- glucose, arabinose, mannose, gluconate, caprate, malate, citrate 와 같은 화합물을 탄소원으로 이용하였다. Y9451 균주의 세포막을 구성하는 주요 지방산 조성과 함유율(Table 2)을 조사하여 동정의 참고자료로 활용하였으며, 최종적으로는 rDNA의 염기서열을 분석하여 동정하였다. 분리균주인 Y9451의 genomic DNA를 template 로 증폭한 PCR 산물을 cloning하여 염기서열을 결정하고 Blast program을 이용하여 Genbank database에 등록된 16S rDNA 염기서열 정보와 상동성의 검색으로 동정하여 Pseudomonas fragi의 16S rDNA 염기서열과 99% 상동성을 보이는 것으로 나타났다.
- 균주의 생화학적 특성은 API 20 NE kit(Biomerieux, France)를 이용하여 조사하였고, 균주의 지방산 조성을 확인하기 위하여 다음과 같은 방법을 수행하였다. 표준 지방산으로는 Calibration standard kit을 사용하였으며, 균주를 Sabouraud's agar 배지를 사용하여 3CFC에서 24시간 동안 배양하였다.
- 94, C에서 5분간 반응시킨 .다음, 94P에서 denaturation 1분, 60P에서 annealing 1분 30초; 72P에서 extension 1분을 30회 반복하였고, 최종적으로 72℃에서 30분간 extensiori을 실시하였다. PCR 반응은 miriicycler(MJ Research)를 이용하였고, PCR 반응물은 1% agarose gel, TAE bufifer(40 mM tris acetate, ImM ED1A)에서 100 V 30 mA로 40분간 전기영동 하였다.
- 10)을 통하여 동정하였다. 또한, 분리균주는 16S rDNA 유전자 단편을 중합효소 연쇄반웅(PCR)에 의해 증폭하기 위해 세균의 16S rDNA 유전자의 염기서열이 각각 5, -AGAGTTTGAT CMTGGCTCAG인 27F와 5'-TACGTACCTTGTTACGACTT인 1492R primer를 사용하였으며, Wizard genomic DNA prep kit(Promega, USA)를 이용하여 DNA 주형을 얻었다^PCR 조건은 2 W template DNA, 2, 5 B 27F(10 pmol/gO, 2.5 g/ 1492R(10 pmol/p/), 4µl dNTPs(2.5 mM each), 10 pi 10 × PCR buffer, 1µl Taq DNA polymerase(4 units/gZ, Bioneer, Korea), 78 증류수를 넣고 최종 반응 부피를 100µl로 조절하였다. 94, C에서 5분간 반응시킨 .
- Sequencing 반응은 PCR법에 기초한 dye-terminator 반응을 이용하였다. 반응액은 template DNA 400ng, BigDye 1 µl (ABI), buffer 2gZ, T7 및 SP6 primer를 각각 5pmol 첨가하여 최종적으로 20 µl로 조절하였다. PCR cycle 에서 10 초, 5UC에서 5초, 6(FC에서 4분, 50 cycles 수행하였디^ PCR 반응물의 정제는 HV filter plat(Millpore)에서 Sephadex G- 50-50(Sigma)을 이용하여 dye, 미 반응 dNTP, primer와 template를 제거하였다.
- 표준 지방산으로는 Calibration standard kit을 사용하였으며, 균주를 Sabouraud's agar 배지를 사용하여 3CFC에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 균체를 시험관에 취한 다음 saponification, methylation, extraction, washing 과정을 거친 후 NaCl 용액 500µl를 첨가하여 중분리를 하여 gas chromatography 로 분석하였으며, MIDI사의 동정 프로그램인 Sherlock(Version 3.10)을 통하여 동정하였다. 또한, 분리균주는 16S rDNA 유전자 단편을 중합효소 연쇄반웅(PCR)에 의해 증폭하기 위해 세균의 16S rDNA 유전자의 염기서열이 각각 5, -AGAGTTTGAT CMTGGCTCAG인 27F와 5'-TACGTACCTTGTTACGACTT인 1492R primer를 사용하였으며, Wizard genomic DNA prep kit(Promega, USA)를 이용하여 DNA 주형을 얻었다^PCR 조건은 2 W template DNA, 2, 5 B 27F(10 pmol/gO, 2.
- 3이에서 48시 간 동안 배양 후 콜로니 주위에 투명환이 형성된 균주를 선별하였다. 선별된 균주들을 PSM broth에 접종한 후 30℃에서 48시간 동안 진탕 배양한 후 배양 상징액에서 phytase의 활성을 분석하여 효소활성이 가장 우수한 균주를 분리하였다.
- 염기분석기 투입시료는 PCfi 정제 시료와 formamide를 1:1로 섞어서 10 µl로 만들어 사용하였다. 염기서열은 자동염기분석기 (ABI3700, AppUed Biosystems Inc., USA)를 사용하여 분석했으며 벡터에 있는 M13 forward, reverse 그.리고, 530F(5'-GT(GCCAdCMGCCGCGG), 1100R(5' -OiGGTTGCGCTCGTTG) primed 4곳에서 읽어서 전체 약 1500bp의 염기서열을 결정하였다.
- Phytase 활성측정은 Shdmizi?의 방법을 변형하여 이용하였다. 미생물 기원의 phytase 활성 측정을 위한 반응용액은 보통 CaCl?를 포함하지만, 본 연구의 phytase는 CaCL를 첨가하는 경우 오히려 효소활성을 저해(미발표 논문) 하기 때문에 반응용액에 CaCL를 제외시켰다.
- 수 있다. 이러한 환경의 하천수를 분리원으로 하여 phytase 생산도가 가장 높은 균주를 선발하고 동정하였다. 우선 시료를 PSM 고체배지에 도말한 후 콜로니 주변에 생기는 투명환의 크기로 phytase 생산능이 우수한 균주를 최종적으로 1 주 분리하여 Y9451로 명명하였다.
- 8%)에 1 백금이 접종하여 30℃, 150rpiii에서 12시간동안 진탕 배양하였다. 증균된 종균은 탄소원, 질소원, 인산원, 무기염류 등의 영양원을 달리한 배지에 2%(v/v) 접종하여 30℃, 150rpm으로 120시간 동안 진탕 배양하면서 phgse의 활성을 측정하였다.
- 질소원의 종류를 달리하여 균주를 배양한 후 생육도와 phytase 생산량을 조사하였다(Eble 5). 질소원으로 nutrient broth(NB)를 사용한 경우가 phytase 생산량이 가장 많았으며, NB배지에 비교하여 beef extract를 사용한 경우는 약 40%, beef extract와 peptone을 혼용한 경우는 48% 정도의 생산량을 보였다.
- 탄소원의 종류 및 첨가농도가 phytase의 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여 단당류인 glucose, , fructose, galactose, mannose, inositol 과 이당류인 sucrose, maltose, lactose, 다당류인 starch를 각각 1%가 되도록 phytase 생산배지에 첨가하여 균주의 생육과 phytase의 생산량을 조사하였다(Table 4). Fructose를 첨가한 경우에 효소 생산량이 173 mU/mZ로 phytase 생산에 가장 우수한 탄소원이었다.
- 7%(w/v) ferrous sulfate를 4:1로 혼합 시켜 제조하였다. 표준시약인 KH2PO4를 각 농도별로 제조한 후동일한 방법으로 수행하여 얻은 표준곡선의 흡광도와 비교하여 유리된 인산량을 구하였다. Phytase 효소 1 unit는 1분 동안 유리된 1 μmole의 phosphorus의 양으로 정의하였다.
대상 데이터
- 분리된 Y9451 균주의 형태적 특징과 생화학적 반응 특칭은 Table 1과 같으며, arginine dihydrolase, urease에 대해서 양성반응을 보인 반면, 질산염 환원: indole기 생산, g-glucosidase, protease, β-galactosidase, cytochrome oxydase는 음성반응을 보였다. glucose, arabinose, mannose, gluconate, caprate, malate, citrate 와 같은 화합물을 탄소원으로 이용하였다. Y9451 균주의 세포막을 구성하는 주요 지방산 조성과 함유율(Table 2)을 조사하여 동정의 참고자료로 활용하였으며, 최종적으로는 rDNA의 염기서열을 분석하여 동정하였다.
- 따라서, phytase를 생산하는 Y9451 균주는 Pseudomonas fragiS. 동정 되었고 Pseudomonas fragi Y9451로 명명하여 본 연구의 실험 균주로 사용하였다.
- , USA)를 사용하여 분석했으며 벡터에 있는 M13 forward, reverse 그.리고, 530F(5'-GT(GCCAdCMGCCGCGG), 1100R(5' -OiGGTTGCGCTCGTTG) primed 4곳에서 읽어서 전체 약 1500bp의 염기서열을 결정하였다. 분석된 염기서열은 Advanced blast program(http://www.
- 본 연구에 사용된 균주는 단위 동물 밀집 사육지역 인근인 경기도 포천군 영평천 인근의 하천수에서 분리하였다. 균주 분리는 본 하천수 시료를 0.
데이터처리
- 리고, 530F(5'-GT(GCCAdCMGCCGCGG), 1100R(5' -OiGGTTGCGCTCGTTG) primed 4곳에서 읽어서 전체 약 1500bp의 염기서열을 결정하였다. 분석된 염기서열은 Advanced blast program(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 를 통하여 Genbank database에 등록된 염기서열과 비교하여 동정하였다.
이론/모형
- X-gal 함유 배지에 도말한 후 흰색의 colony를 분리하여 Wzard plus SV miniprep DNA purification sysetem을 이용하여 recombinant 클론을 선별하였다. Sequencing 반응은 PCR법에 기초한 dye-terminator 반응을 이용하였다. 반응액은 template DNA 400ng, BigDye 1 µl (ABI), buffer 2gZ, T7 및 SP6 primer를 각각 5pmol 첨가하여 최종적으로 20 µl로 조절하였다.
성능/효과
- 10% 의 범위로 첨가한 배지에서 phytate의 생산에 대한 인산원의 종류와 농도에 따른 영향을 조사하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 KH2PO4 또는 Phytate의 첨가농도가 높을수록 phytase 생산은 억제되었으며, 인산 원을 첨가하지 않은 phytase 생산배지에서 가장 높은 효소생산량을잉보였다. 이러한 결과는 배양액 중 인산원의 농도를 증가시킬 경우에 생육은 잘 이루어지나 phytase의 생산은 억제된다는 보고11,12,18) 와 유사한 경향을 보였다 그러나, 본 연구의 사용 균주와 동종인 Pseudomonas sp.
- Sucrose는 균주의 생육에는 효과적이었으나, 효소 생산량은 fhictose의 57%밖에 되지 않았다. Fructose의 농도에 따른 효소생산은 Fig. 2에서 보는 바와 같이 fructose 농도에 비례하여 증가하였으며, fructose를 7% 사용한 배지에서 72시간 배양한 결과 효소 활성이 1, 078mU/m/까지 증가하였고, 이후 활성이 서서히 감소되는경향을 보였다. 그러나, fructose를 고농도로 첨가하는 경우에는 균주 생육이 불량(자료 미제시)하였으며, 효소생산도 억제되었다.
- 그 외의 질소원인 경우는 균주의 생육과 상관없이 phytase의 생산은 거의 이루어지지 않거나 10% 이하의 낮은 생산량을 나타내어, phytase 생산을 위한 질소원으로 NB가 가장 우수한 것으로 판단되었다. NB 첨가농도에 따른 phytase 생산을 비교한 결과(Fig. 3), 생육은 배양 24 시간 이내에 정지기에 도달하였으며, phytase의 생산은 생육이 정지기에 도달된 24시간 후에 시작되었다. 균주의 생육과 효소의 생산은 NB의 농도에 비례적으로 증가하였으며 , NB를 3.
- 분리균주인 Y9451의 genomic DNA를 template 로 증폭한 PCR 산물을 cloning하여 염기서열을 결정하고 Blast program을 이용하여 Genbank database에 등록된 16S rDNA 염기서열 정보와 상동성의 검색으로 동정하여 Pseudomonas fragi의 16S rDNA 염기서열과 99% 상동성을 보이는 것으로 나타났다. Y9451 의 16S rDNA 염기서열을 이용한 phylogenetic tree(Fig. 1)로부터 Y9451은 Pseudomonas fragi^[ 유연관계가 상당히 가깝다는 것을 알 수 있었다. 따라서, phytase를 생산하는 Y9451 균주는 Pseudomonas fragiS.
- 3), 생육은 배양 24 시간 이내에 정지기에 도달하였으며, phytase의 생산은 생육이 정지기에 도달된 24시간 후에 시작되었다. 균주의 생육과 효소의 생산은 NB의 농도에 비례적으로 증가하였으며 , NB를 3.0% 사용한 경우에 배양 96시간에서 l, 425mU/mZ로 최대의 효소생산량을 보였고, 이후 효소 활성이 감소하였다.
- 한편, yeast extract는 균주의 생육에는 효율적이었으나, 효소 생산량은 NB배지를 질소원으로 사용한 경우에 비해 24% 밖에 되지 않았다. 그 외의 질소원인 경우는 균주의 생육과 상관없이 phytase의 생산은 거의 이루어지지 않거나 10% 이하의 낮은 생산량을 나타내어, phytase 생산을 위한 질소원으로 NB가 가장 우수한 것으로 판단되었다. NB 첨가농도에 따른 phytase 생산을 비교한 결과(Fig.
- 2에서 보는 바와 같이 fructose 농도에 비례하여 증가하였으며, fructose를 7% 사용한 배지에서 72시간 배양한 결과 효소 활성이 1, 078mU/m/까지 증가하였고, 이후 활성이 서서히 감소되는경향을 보였다. 그러나, fructose를 고농도로 첨가하는 경우에는 균주 생육이 불량(자료 미제시)하였으며, 효소생산도 억제되었다. 이러한 결과는 기질농도가 높은 배지에서 세균을 회분식으로 배양할 때 일어나는 일반적인 현상이며, 곰팡이 기원의 phytase 생산에 관한 연구12)에서도 탄소원의 첨가 농도가 높아질수록 효소생산량은 증가하나, 그 농도가 5% 이상인 경우에는 오히려 생산량이 저하됨을 볼 수 있다.
- Y9451 균주의 세포막을 구성하는 주요 지방산 조성과 함유율(Table 2)을 조사하여 동정의 참고자료로 활용하였으며, 최종적으로는 rDNA의 염기서열을 분석하여 동정하였다. 분리균주인 Y9451의 genomic DNA를 template 로 증폭한 PCR 산물을 cloning하여 염기서열을 결정하고 Blast program을 이용하여 Genbank database에 등록된 16S rDNA 염기서열 정보와 상동성의 검색으로 동정하여 Pseudomonas fragi의 16S rDNA 염기서열과 99% 상동성을 보이는 것으로 나타났다. Y9451 의 16S rDNA 염기서열을 이용한 phylogenetic tree(Fig.
- 우선 시료를 PSM 고체배지에 도말한 후 콜로니 주변에 생기는 투명환의 크기로 phytase 생산능이 우수한 균주를 최종적으로 1 주 분리하여 Y9451로 명명하였다. 분리된 Y9451 균주의 형태적 특징과 생화학적 반응 특칭은 Table 1과 같으며, arginine dihydrolase, urease에 대해서 양성반응을 보인 반면, 질산염 환원: indole기 생산, g-glucosidase, protease, β-galactosidase, cytochrome oxydase는 음성반응을 보였다. glucose, arabinose, mannose, gluconate, caprate, malate, citrate 와 같은 화합물을 탄소원으로 이용하였다.
- 질소원으로 nutrient broth(NB)를 사용한 경우가 phytase 생산량이 가장 많았으며, NB배지에 비교하여 beef extract를 사용한 경우는 약 40%, beef extract와 peptone을 혼용한 경우는 48% 정도의 생산량을 보였다. 한편, yeast extract는 균주의 생육에는 효율적이었으나, 효소 생산량은 NB배지를 질소원으로 사용한 경우에 비해 24% 밖에 되지 않았다.
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