[논문]유비퀴틴 단백질의 부분적으로 폴딩된 구조에 대한 분광학적 분석

박순호

유비퀴틴 단백질의 부분적으로 폴딩된 구조에 대한 분광학적 분석
Spectroscopic Analysis of Partially Folded State of Ubiquitin 원문보기

한국농화학회지 = Journal of the Korean society of Agricultural Chemistry and Biotechnology, v.46 no.4, 2003년, pp.305 - 310

박순호 (강릉대학교 치과대학 치의학과)

초록
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Hydrophobic core가 변이된 유비퀴틴 단백질이 pH 2 용액에서 보이는 구조적인 특성을 여러 분광학적 방법으로 측정하였다. 낮은 pH값을 갖는 용액에서 이 변이 유비퀴틴의 intrinsic tryptophan fluorescence emission spectrum은 unfolded 상태보다 약간 blue shift되어 있고 또한 그 intensity도 상당히 낮게 나타났다. 이는 이 용액 조건에서 이 변이 유비퀴틴의 삼차구조가 약간 남아 있는 것을 의미한다. 같은 용액에서 이 변이 유비쥐틴의 far-UV circular dichroic spectrum은 native 상태나 unfolded 상태의 spectrum과 현저히 달랐으며 220 nm 에서의 molar ellipticity 값을 통하여 볼 때 pH 2인 용액에서 상당량의 이차구조를 지니고 있었다. 또한 같은 용액에서 이 변이 유비퀴틴은 hydrophobic dye인 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid(ANS)외 fluorescence emission intensity를 증가시키고 fluorescence emission maximum이 짧은 파장에서 나타나게 하였다(blue shift). 이러한 현상은 pH 2 용액에서 이 변이 유비퀴틴의 hydrophobic core가 느슨하여져서 hydrophobic dye인 ANS가 결합할 수 있는 구조를 띠고 있음을 나타낸다. 이러한 분광학적인 관찰은 이 변이 유비귀틴이 pH 2인 용액에서 상당량의 이차구조를 지니고 있지만 hydrophobic core는 느슨하게 형성된 molten globule과 같은 형태를 지니고 있음을 나타낸다. 이 변이 유비퀴틴의 molten 히obule 형태는 단백질 폴딩 반응의 경로를 연구할 수 있는 좋은 모델이 될 수 있을 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Hydrophobic core variant of ubiquitin appeared to have partially folded structure at pH around 2. The intrinsic tryptophan fluorescence emission maximum of this ubiquitin variant at pH 2 showed slight blue shift compare to that of unfolded state, suggesting that some residual tertiary structures remain in this solvent condition. At the same solvent condition, this ubiquitin variant binds with hydrophobic dye, 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid(AMS), which is known to bind to exposed hydrophobic surface. Furthermore, far-UV circular dichroic spectrum of this ubiquitin variant in the diminished pH was remarkably different from the far-UV CD spectrum of the native state or unfolded state. Based on the molar ellipticity at 220 nm, this ubiquitin variant at pH 2 appeared to have significant amount of secondary structures. All these observations suggest that this ubiquitin variant in the diminished solvent pH has loosely folded hydrophobic core with some secondary structures, which are key features of molten globule conformation. Since molten globule has long been considered as a protein folding intermediate, it is considered that this hydrophobic core variant ubiquitin will serve as a valuable model to study protein folding process.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

18)이는 site-directed mutagenesis를 통하여 hydrophobicity를 낮추어 준다면 유비퀴틴과 같이 매우 cooperative한 폴딩 반응을 하는 단백질에서도 molten globule과 같은 구조를 관찰할 수 있다는 가능성을 제시한다. 본 연구는 이러한 가능성을 시험해보기 위하여 유비퀴틴 삼차구조의 소수성 내부(hydrophobic core)에 위치한 valine 26이 alanine으로 치환되어 mean net charge에 대한 mean hydrophobicity의 비가 wild type 유비퀴틴에 비하여 떨어지는 변종 유비퀴틴에서 molten globule과 유사한 구조가 나타나는 가 관찰하였다.
따라서 폴딩 반응의 transition state에서 형성되는 구조와 molten globule구조를 비교할 수 있는 two-state folding kinetics를 보이면서 평형상태에서 molten globule 형태도 될 수 있는 모델 단백질의 개발이 시급하다. 본연구에서는 낮은 pH값을 갖는 용액에서 보이는 여러 가지 분광학적 결과를 토대로 하여 hydrophobic core에 위치한 valine이 alanine으로 치환된 변이 유비퀴틴이 molten globule을 형성함을 보이며 따라서 평형상태에서 형성되는 molten globule의 구조와 폴딩 kinetics실험을 통하여 얻어지는 transition state의 구조를 비교 분석하기에 적합한 모델 단백질임을 보이고자 한다.

제안 방법

유비퀴틴의 intrinsic tryptophan fluorescence spectrum 은 tryptophan side-chain을 295 nm의 광으로 여기 시켜 나오는 fluorescence emission spectrum을 300nm에서 450nm까지 측정하였으며 단백질의 농도는 3~6jiM이었다. ANS의 fluorescence emission spectra는 350nm에서 여기 시켜 400nm에서 650 nm까지에서 나오는 fluorescence emission spectrum을 측정하였으며 단백질의 농도는 3~6pM이었고 ANS는 단백질보다 열 배 높은 농도로 가하였다. Fluorescence spectrum 측정 시 Jeiolbch DTRC-620 circulating water bath를 사용하여 cuvette 내의 용액의 온도가 25℃로 유지되게 하였다.
평형 상태에서의 단백질 unfolding 실험은 25 mM acetate, pH 5 용액에 유비퀴틴을 가한 native solution과25mM acetate, 6M guanidinium chloride (pH 5) 용액에 native solutkm과 같은 농도가 되도록 유비퀴틴을 가하여 제조한 unfolded solution을 준비한 다음, 먼저 native solution에서 일정 부피의 용액을 제거하고 제거한 부피만큼 unfolded solution을 가하여서 3분 이상 섞어주어 완전히 평형에 도달한 다음 spectrum을 측정하는 방법으로 denaturant의 농도를 점차 높여주면서 측정하고 또한 그 반대인 unfolded solution부터 시작하여 denaturant^ 농도를 점차 낮주어주는 방향으로도 같은 실험을 실시하였으며 두 실험에서의 결과는 일치하였다. Denaturant의 농도는 용액의 refractive index를 측정하여 결정하였다.23) Fluorescence emission spectrum은 Jasco FP-6500 spectrofluorometer^ 사용하여 측정하였다.
이는 평형 상태에서의 결과는 반응의 initial state와 final state에만 의존하지 경로에 대한 정보는 포함하지 않는다는 열역학법칙에 의거한다. Fersht와 그 colleague는 two-state 폴딩 단백질에 site-directed mutagenesis와 kinetics 실험을 연계하여 단백질 폴딩 반응의 transition state의 구조를 탐색하는 실험 방법을 제안하였고 그 후 여러 실험실에서 이 방법을 여러 two-state 폴딩 단백질에 적용하여 단백질의 native 상태를 안정시키는 결합의 폴딩 반응의 경로에 끼치는 영향을 연구하였다?-9)이러한 점에서 볼 때 two-state 폴딩 메커니즘을 보이면서 molten globule형태도 띨 수 있는 V26A 유비퀴틴은 평형상태에서의 실험과 kinetics 실험을 모두 적용하여 폴딩 반응의 경로에 대한 전체적인 정보를 줄 수 있는 좋은 모델 단백질로 생각되어 진다.
V26A 유비퀴틴의 pH 2 용액에서 이차구조의 특성을 far-UV CD spectroscopy로 관찰하였다. Fig.
23) Fluorescence emission spectrum은 Jasco FP-6500 spectrofluorometer^ 사용하여 측정하였다. 유비퀴틴의 intrinsic tryptophan fluorescence spectrum 은 tryptophan side-chain을 295 nm의 광으로 여기 시켜 나오는 fluorescence emission spectrum을 300nm에서 450nm까지 측정하였으며 단백질의 농도는 3~6jiM이었다. ANS의 fluorescence emission spectra는 350nm에서 여기 시켜 400nm에서 650 nm까지에서 나오는 fluorescence emission spectrum을 측정하였으며 단백질의 농도는 3~6pM이었고 ANS는 단백질보다 열 배 높은 농도로 가하였다.
V26A 유비퀴틴은 wild type 유비퀴틴과 일치하는 far-UV Circular Dichroic(CD) spectrum 을 보이는 것으로 보아 mutation이 peptide backbone의 native 구조에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 재조합 유비퀴틴 단백질은 Khorasanizadeh 등19)이 기술한 방법에 최종적으로 Sephacryl S-100 column chromatography 과정을 더하여서 정제하였다. 정제된 유비퀴틴은 SDS-PAGE후 coommassie brilliant blue로 염색하여 densitometer로 분석하여 98% 이상 순수한 것으로 판명되었다.
Unfolded 상태의 spectrum는 25 mM acetate, 6 M guanidinium chloride (pH 5)용액에서 측정하였다. 평형 상태에서의 단백질 unfolding 실험은 25 mM acetate, pH 5 용액에 유비퀴틴을 가한 native solution과25mM acetate, 6M guanidinium chloride (pH 5) 용액에 native solutkm과 같은 농도가 되도록 유비퀴틴을 가하여 제조한 unfolded solution을 준비한 다음, 먼저 native solution에서 일정 부피의 용액을 제거하고 제거한 부피만큼 unfolded solution을 가하여서 3분 이상 섞어주어 완전히 평형에 도달한 다음 spectrum을 측정하는 방법으로 denaturant의 농도를 점차 높여주면서 측정하고 또한 그 반대인 unfolded solution부터 시작하여 denaturant^ 농도를 점차 낮주어주는 방향으로도 같은 실험을 실시하였으며 두 실험에서의 결과는 일치하였다. Denaturant의 농도는 용액의 refractive index를 측정하여 결정하였다.

대상 데이터

정제된 유비퀴틴은 SDS-PAGE후 coommassie brilliant blue로 염색하여 densitometer로 분석하여 98% 이상 순수한 것으로 판명되었다. 단백질 unfolding 실험에 사용된 초 순수 grade guanidinium chloride는 ICN에서 구입하였으며 기타 시약들은 reagent grade이거나 더 높은 grade를 사용하였다.

이론/모형

방향으로 진행되고 있다. 첫째, two-state 폴딩 메커니즘을 따르는 단백질에 대하여 단백질 공학기법 (protein engineering)과 폴딩 kinetics 실험을 연계하여 폴딩 반응의 transition-state의 구조를 탐색하는 방법이 Fersht와 그의 colleague 에 의하여서 제안되었고, 2)여러 two-state 폴딩 단백질에 대하여서 적용되었다.3-9)둘째, 단백질에 따라 native 상태의 안정성을 감소시키는 낮은 pH값을 갖는 용액이나 저 농도의 화학변성제(chemical denaturant)를 함유하는 용액에서 native 상태도 unfolded 상태도 아닌 부분적으로 폴딩이 되어있는 molten globuk형태를 띠고 았음이 알려져 있다.

성능/효과

5이하인 용액에서의 tryptophan side-chain이 수용액에 완전히 노출되지는 않았음을 나타낸다. 따라서 그림 2의 결과를 보면 V26A 유비퀴틴의 삼차구조는 용액의 pH가 낮아짐에 따라 unfolded 상태에 가깝게 변화되다가 pH값이 2.5 이하에서 unfolded 상태도 아니고 native 상태도 아닌 어떤 특정한 구조를 이룬다고 사료된다.
유비퀴틴이 unfolded 상태에 있는 6 M guanidinium chloride 용액에서는 fluorescence emission maximum이 355 nm에서 나타나며 tryptophan side-chain이 수용액에 완전히 노출되어 있을 때 나타나는 전형적인 fluorescence emission maximum을 보인다. 또한 fluorescence emission intensity는 unfolded 상태의 유비퀴틴이 native 상태의 유비퀴틴보다 현저히 크게 나타났다. Fig.
5 근처에서 일정한 fluorescence emission spectrum을 보인다. 또한 pH가 김-소함에 따라 fluorescence emission maximum에서의 파장도 증가하다가 pH 값이 2.5 이하에서는 emission maximum의 파장이 일정하게 350nm로 나타났다. 즉 낮은 pH 값에서의 V26A 유비퀴틴의 fluorescence emission intensity는 unfolded 상태의 fluorescence emission intensity 에 비하여 상당히 작은 값을 보이며 maximum fluorescence emission에서의 파장은 unfolded 상태 (355 nm)보다는 약간 작은 값을 보인다.
찗은 파장에서 나타난다. 이것은 V26A 유비퀴틴이 native 상태에서는 hydrophobic core가 견고하게 보존되어서 hydrophobic dye가 결합할 hydrophobic 표면이 존재하지 않고 unfolded 상태에서는 hydrophobic core/} 완전히 와해되어서 ANS가 결합할 수 있는 hydrophobic 부분이 없음을 보여주는 반면에 pH 값이 낮은 용액에서는 hydrophobic dye가 결합할 수 있는 느슨한 hydrophobic core 구조:를 가지고 있음을 시사한다, 이상의 실험결과를 볼 때 mean net charge는 유지하면서 mean hydrophobicity를 감소시킨 V26A 유비퀴틴은 native구조를 약화시키는 낮은 pH값을 갖는 용액에서 molten globule형태를 형성하고 있다고 할 수 있다. Mean hydrophobicity가감소한 변이 단백질인 V26A 유비퀴틴이 낮은 pH 값을 갖는 용액에서 native 상태도 아니고 unfolded 상태도 아닌 molten 이obule상태를 보이는 것은 단백질의 삼차구조를 안정시키는 noncovalenl결합과 단백질의 삼차구조를 약화시키는 charge repulsion이 molten globule 상태에서 적절히 균형을 이루기 때문으로 여겨진다.
아닌 그러나 상당한 양의 이차구조를 지니고 있다는 것을 의미한다. 이상의 fluorescence emission spectra와 CD spectra의 결과에서 보면 낮은 J)H값을 갖는 용핵에서 V26A 유비퀴틴이 소수성 내부는 찰 packing되어지지 않았지만 상당량의 이차구조는 가지고 있는 molten globule과 유사한 성질을 띠고 있다고 생각할 수 있다.
재조합 유비퀴틴 단백질은 Khorasanizadeh 등19)이 기술한 방법에 최종적으로 Sephacryl S-100 column chromatography 과정을 더하여서 정제하였다. 정제된 유비퀴틴은 SDS-PAGE후 coommassie brilliant blue로 염색하여 densitometer로 분석하여 98% 이상 순수한 것으로 판명되었다. 단백질 unfolding 실험에 사용된 초 순수 grade guanidinium chloride는 ICN에서 구입하였으며 기타 시약들은 reagent grade이거나 더 높은 grade를 사용하였다.

후속연구

그런데 근래에 mean hydrophobicity에 대한 mean net charge의 겁]가 낮은 단백질들에서 molten globule 형태가 많이 나타난다고 보고 되어있다.18) 이는 site-directed mutagenesis를 통하여 단백질의 mean hydrophobicity를 떨어뜨리면 유비퀴틴과 같은 폴딩 반응이 cooperative한 단백질도 molten globule을 형성할 수 있음을 시사하며 molten globule의 구조에 대한 연구를 유기용매의 성격이 강한 용액이 아닌 수용액에서 실시해 볼 수 있는 가능성을 제시한다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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