선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 그러므로, 본 실험에서는 식품 가공산업에 많이 활용되는 농산물중의 하나인 콩의 유전자재조합기술 사용 여부를 PCR을 이용하여 모니터링 하는 방법을 확립하고자 하였다. 표준물질로는 상품화되어 시중에 유통가능성이 있는 유전자재조합 콩들에 삽입된 epsps와 pat 유전자를 표준물질로 이용하였다.
제안 방법
- 2001년 7월 유전자재조합 가공식품의 표시제 이전과 이후의 국내 식품시장에서 콩 가공식품들의 GM 여부를 모니터링하기 위해 표시제 이전에 생산된 제품과 이후에 생산된 제품을 각각 수거하여 GM 여부를 확인하였다. Fig.
- PCR 조건으로 첫 cycle에서 3분간 95℃에서 수행을 한 후, 95℃에서 30 초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간 40 cycle을 수행하였으며, 마지막 단계로 72℃에서 8분간 수행한 후, 4℃에서 PCR 산물을 보존하였다. PCR 산물은 3% agarose gel상에서 전기영동 후, Image analysis system(Bioneer, Korea)을 사용16)하여 산물의 크기 및 양을 확인하였다.
- PCR 산물의 DNA 염기서열 비교 PCR 산물의 DNA 염기서열을 확인하기 위해 agarose gel에서 PCR 산물을 Gel extraction kit(Qiagen, USA)를 이용하여 추출한 후, DNA sequencing에 이용하였다. DNA 염기배열은 ABI PRISM 377 model(Perkin Elmer, USA)을 사용하여 염기서열을 결정하였다.
- 2μl), template DNA는 농도에 따라 1μl 부피로 희석하여 thermocycler(MJ Research, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로 첫 cycle에서 3분간 95℃에서 수행을 한 후, 95℃에서 30 초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간 40 cycle을 수행하였으며, 마지막 단계로 72℃에서 8분간 수행한 후, 4℃에서 PCR 산물을 보존하였다. PCR 산물은 3% agarose gel상에서 전기영동 후, Image analysis system(Bioneer, Korea)을 사용16)하여 산물의 크기 및 양을 확인하였다.
- 실험에 이용된 건조시료는 액체질소를 이용하여 파쇄한 후 이용하였고, 수분이 포함된 시료는 냉동건조 후 오염되지 않게 마쇄하여 잘 혼합하여 사용하였다. 각각의 시료는 0.1 g씩 3개의 tube로 나누어 각각 DNA 추출에 이용하였다. 추출된 DNA들은 UV-spectrophotometer(220S, Hitachi, Japan)를 이용하여 260nm에서 정량하여 사용하였다.
- Primer를 이용한 PCR 산물 분석. 두 종류의 GM 콩을 검출하기 위하여 Monsanto사의 GMS는 EPSPS 5', EPSPS 3', Aventis 사의 GMS는 EAT 5', PAT 3' primer들과 콩의 내재유전자인 ferritin gene을 기초로 하여 제작된 primer set를 하나의 tube에 넣어 한번의 반응으로 동시에 여러 유전자를 확인할 수 있는 multiplex-PCR을 수행하였다. Fig.
- 그러므로, 본 실험에서 사용한 검색용 primer들은 유전자 재조합된 GMS에 특이적으로 반응함을 관찰할 수 있었으며 GMS의 검출이 PCR을 통하여 가능함을 입증하였다. 또한, 제작한 primer의 특이성을 확인하기 위하여 EPSPS 5'와 EPSPS 3'를 사용하여 얻은 PCR 산물과 PAT 5', PAT 3를 사용하여 얻은 PCR 산물은 DNA 염기서열분석을 수행하였다. 이러한 PCR 산물의 염기서열은 기존에 보고된 epsps,8)pat 유전자의 염기서열과 비교하여 일치함을 확인하였다.
- 준비하여 사용하였다. 반응용액 조성은 10×PCR buffer 2.5 μl(TaKaRa, Japan), sense primer 1μl(10pM), antisense primer 1μl(10pM), dNTP 0.5μl(10 pM, Gibco-BRL, USA), Taq DNA polymerase(TaKaRa, Japan) 1 unit(0.2μl), template DNA는 농도에 따라 1μl 부피로 희석하여 thermocycler(MJ Research, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로 첫 cycle에서 3분간 95℃에서 수행을 한 후, 95℃에서 30 초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간 40 cycle을 수행하였으며, 마지막 단계로 72℃에서 8분간 수행한 후, 4℃에서 PCR 산물을 보존하였다.
- 표준물질로는 상품화되어 시중에 유통가능성이 있는 유전자재조합 콩들에 삽입된 epsps와 pat 유전자를 표준물질로 이용하였다. 삽입된 유전자와 대조구 유전자들을 기본으로 하여 한번의 반응으로 두 종류의 GMS를 구별할 수 있는 multiplex PCR 검출법에 적용가능한 oligonucleotide primer를 제작하여 시중에 유통 중인 원료콩과 가공식품들을 표시제가 시행된 2001년 7월을 기준으로 표시제 전과 표시제 후의 GM 콩 여부를 모니터링 하였다.
- 1과 같다. 이와 같이 primer들은 GMS에 인위적으로 삽입된 glyphosate(N-phosphono-methylglycine) 에 강한 저항성을 갖는 Agmbacterium tumefaciens CP4의 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase(epsps) gene4-5)과 glufosinate ammonium 에 저항을 갖는 Streptomyces viridochromogenes의 Phosphinothricin acetyltransferase(pat) 유전자6-7)를 근거로 제작하였으며, 대조구 유전자를 확인하는 primer로는 콩에 존재하고 있는 ferritin gene14)을 이용하여 제작하였고, 이들 각각에 대한 유전자 배열은 Table 1에 나타내었다.
- 추출된 DNA들은 UV-spectrophotometer(220S, Hitachi, Japan)를 이용하여 260nm에서 정량하여 사용하였다. 한편 추출한 DNA는 0.8%의 agarose gel상에서 50 volt로 30분 동안 전기영동하여 추출된 DNA의 상태를 확인 하였으며, marker로는 λ-Hind Ⅲ(Gibco-BRL, USA)를 사용하였다.
대상 데이터
- 재료. PCR을 통한 epsps 유전자가 삽입된 GM soybean(GMS)와 non-GMS의 검출법에 사용한 시료는 Huka(Munich, Germany)사로부터 구입하였고, pat 유전자가 포함된 시료는 Aventis 사의 GMS 와 동일한 pat 유전자가 삽입된 T25 옥수수 표준시료13)를 일본총합연구소의 Hino 박사로부터 분말형태로제공받아 이용하였다. 콩 가공식품류의 경우 2001년 이전 제품은 본 연구실에서 냉동건조하여 보관중인 시료를 사용하였고, 최신제품은 식품매장에서 구입하였으며 수분이 있는 시료는 냉동건조하여 분말형태로 제조한 후 사용하였다.
- 원료콩과 콩 가공식품들에서 DNA의 추출은 기존에 보고된 Hexadecyl-trimethyl-animonium-broinide(CIAB) 방법15)과 Qiagen 사의 DNeasy Plant Mini kit를 이용하였다. 실험에 이용된 건조시료는 액체질소를 이용하여 파쇄한 후 이용하였고, 수분이 포함된 시료는 냉동건조 후 오염되지 않게 마쇄하여 잘 혼합하여 사용하였다. 각각의 시료는 0.
- PCR을 통한 epsps 유전자가 삽입된 GM soybean(GMS)와 non-GMS의 검출법에 사용한 시료는 Huka(Munich, Germany)사로부터 구입하였고, pat 유전자가 포함된 시료는 Aventis 사의 GMS 와 동일한 pat 유전자가 삽입된 T25 옥수수 표준시료13)를 일본총합연구소의 Hino 박사로부터 분말형태로제공받아 이용하였다. 콩 가공식품류의 경우 2001년 이전 제품은 본 연구실에서 냉동건조하여 보관중인 시료를 사용하였고, 최신제품은 식품매장에서 구입하였으며 수분이 있는 시료는 냉동건조하여 분말형태로 제조한 후 사용하였다.
- 표준물질로는 상품화되어 시중에 유통가능성이 있는 유전자재조합 콩들에 삽입된 epsps와 pat 유전자를 표준물질로 이용하였다. 삽입된 유전자와 대조구 유전자들을 기본으로 하여 한번의 반응으로 두 종류의 GMS를 구별할 수 있는 multiplex PCR 검출법에 적용가능한 oligonucleotide primer를 제작하여 시중에 유통 중인 원료콩과 가공식품들을 표시제가 시행된 2001년 7월을 기준으로 표시제 전과 표시제 후의 GM 콩 여부를 모니터링 하였다.
이론/모형
- 이용하였다. DNA 염기배열은 ABI PRISM 377 model(Perkin Elmer, USA)을 사용하여 염기서열을 결정하였다. Cyclic sequencing 반응의 조성으로는 추출된 PCR 산물 10ng, primer 3 pM, Dye terminator kit 용액 1 μl, 1 ×PCR buffer 2μl을 사용하였으며, 온도 조건으로는 96℃에서 10초간 반응시킨 뒤에 96℃에서 10초, 56℃에서 5초, 60℃에서 25초의 조건으로 25 cycle을 수행하였으며 마지막 반응은 60℃에서 4분간 수행하였다.
- DNA의 추출. 원료콩과 콩 가공식품들에서 DNA의 추출은 기존에 보고된 Hexadecyl-trimethyl-animonium-broinide(CIAB) 방법15)과 Qiagen 사의 DNeasy Plant Mini kit를 이용하였다. 실험에 이용된 건조시료는 액체질소를 이용하여 파쇄한 후 이용하였고, 수분이 포함된 시료는 냉동건조 후 오염되지 않게 마쇄하여 잘 혼합하여 사용하였다.
성능/효과
- 2001년 7월 유전자재조합 가공식품의 표시제 이전과 이후의 국내 식품시장에서 콩 가공식품들의 GM 여부를 모니터링하기 위해 표시제 이전에 생산된 제품과 이후에 생산된 제품을 각각 수거하여 GM 여부를 확인하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 표시제이전에 생산된 제품에서는 PCR을 통하여 대부분의 콩가공식품에서 epsps 유전자가 포함된 Monsanto사의 GMS가 포함된 결과를 얻었으나, pat 유전자가 포함된 Aventis사의 유전자재조합 콩은 확인되지 않았다. 이러한 결과는 표시제이전 규제가 없었을 때는 미국산 수입콩이 epsps 유전자가 삽입된 Monsanto 사의 GMS가 혼입되어 대부분의 콩가공식품의 원료로 사용되었기 때문에 검출된 것으로 사려된다.
- 또한, 실험에 사용한 국내산 콩에서는 ferritin 유전자들만이 확인되었다. 그러므로, 본 실험에서 사용한 검색용 primer들은 유전자 재조합된 GMS에 특이적으로 반응함을 관찰할 수 있었으며 GMS의 검출이 PCR을 통하여 가능함을 입증하였다. 또한, 제작한 primer의 특이성을 확인하기 위하여 EPSPS 5'와 EPSPS 3'를 사용하여 얻은 PCR 산물과 PAT 5', PAT 3를 사용하여 얻은 PCR 산물은 DNA 염기서열분석을 수행하였다.
- Genomic DNA의 추출. 콩과 가공식품에서 추출한 DNA를 0.8%의 agarose gel에서 50 volt로 30분간 전기영동한 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 원료 콩에서는 genomic DNA가 거대분자로 존재하나, 두부, 콩국가루, 두유, 이유식, 된장 등의 가공식품에서의 DNA는 분해되어 다양한 작은 크기로 존재하는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 DNA 분포들은 콩의 가공공정 중에 DNA가 파괴되는 것으로 상대적으로 두부와 두유에 비해 발효과정이 포함된 된장에서 보다 작은 형태의 DNA가 관찰되었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.