The p53 protein was discovered in 1979 as cellular 53-kD nuclear phosphoprotein bound to the large transforming antigen of SV40 virus. $P21^{WAF1/CIP1}$, which has been described as the critical downstream mediator of p53, is known to suppress DNA replication and arrest the G1 cell cycle ...
The p53 protein was discovered in 1979 as cellular 53-kD nuclear phosphoprotein bound to the large transforming antigen of SV40 virus. $P21^{WAF1/CIP1}$, which has been described as the critical downstream mediator of p53, is known to suppress DNA replication and arrest the G1 cell cycle by quaternary complex with cyclin D, cyclin-dependent kinase(CDK) and proliferating cell nuclear antigen(PCNA). In these days, some studies shows that the p21 can be induced by independent pathways. There are various reports about the expression of p21 (67%.82.4%) in oral squamous cell carcinoma. But these studies are mostly done in malignant tumor not in benign tumor. So we decided to study the expression of p21 in ameloblastoma and the relationship between p53 and p21 as a downstream mediator of p53 in ameloblastoma. We investigated the expression of p21 and p53 with the method of immunohistochemistry. We selected 30 cases of ameloblastoma tissue blocks (acanthomatous type: 5 cases, follicular type: 8 cases, plexiform type: 17 cases) imbedded in paraffin. We used 30 cases of normal gingival tissues and 30 cases of squamous cell carcinoma tissues (SCC) respectively and compared their results with those of ameloblastoma. We made slides with the streptavidin-biotin methods and used monoclonal antibody DO-7 (Novocastra, Newcastle, United Kingdom) as p53 antibody and monoclonal antibody M7202 (DAKO, California, U.S.A.) as p21 antibody. We used Pearson's correlation coefficient to analyse the relationship. The results were as follows: 1. p21 was expressed in ameloblastoma about 30% and this is lower than that of normal gingiva and SCC. 2. In normal gingiva and ameloblastoma, p21 expression was correlated with p53 expression. 3. In SCC, p21 were expressed about 83.3% and this is more than that of p53. But there was no correlation between p21 and p53 expression. We confirmed p21 expression and relation with p53 in ameloblastoma. But, to confirm the function of p21, more studies about p21 expression in malignant ameloblastoma and ameloblastic carcinoma are needed.
The p53 protein was discovered in 1979 as cellular 53-kD nuclear phosphoprotein bound to the large transforming antigen of SV40 virus. $P21^{WAF1/CIP1}$, which has been described as the critical downstream mediator of p53, is known to suppress DNA replication and arrest the G1 cell cycle by quaternary complex with cyclin D, cyclin-dependent kinase(CDK) and proliferating cell nuclear antigen(PCNA). In these days, some studies shows that the p21 can be induced by independent pathways. There are various reports about the expression of p21 (67%.82.4%) in oral squamous cell carcinoma. But these studies are mostly done in malignant tumor not in benign tumor. So we decided to study the expression of p21 in ameloblastoma and the relationship between p53 and p21 as a downstream mediator of p53 in ameloblastoma. We investigated the expression of p21 and p53 with the method of immunohistochemistry. We selected 30 cases of ameloblastoma tissue blocks (acanthomatous type: 5 cases, follicular type: 8 cases, plexiform type: 17 cases) imbedded in paraffin. We used 30 cases of normal gingival tissues and 30 cases of squamous cell carcinoma tissues (SCC) respectively and compared their results with those of ameloblastoma. We made slides with the streptavidin-biotin methods and used monoclonal antibody DO-7 (Novocastra, Newcastle, United Kingdom) as p53 antibody and monoclonal antibody M7202 (DAKO, California, U.S.A.) as p21 antibody. We used Pearson's correlation coefficient to analyse the relationship. The results were as follows: 1. p21 was expressed in ameloblastoma about 30% and this is lower than that of normal gingiva and SCC. 2. In normal gingiva and ameloblastoma, p21 expression was correlated with p53 expression. 3. In SCC, p21 were expressed about 83.3% and this is more than that of p53. But there was no correlation between p21 and p53 expression. We confirmed p21 expression and relation with p53 in ameloblastoma. But, to confirm the function of p21, more studies about p21 expression in malignant ameloblastoma and ameloblastic carcinoma are needed.
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문제 정의
본 연구에서는 법랑아세포종에서 p21의 발현 정도를 관찰하고 p21의 p53과의 관계를 살펴보고자 정상 치은 조직, 편평세포암종과 비교, 연구하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
양성 종양에서의 p21의 발현여부와 그 정도를 알아보고 이를 악성 종양과 비교, 연구한 문헌이 매우 적은 현실이다. 이에 저자는 본 연구를 통하여, 병리학적으로는 양성이지만 임상적으로는 악성도를 보이는 법랑아세포종에서의 p21 발현 여부와, 발현되어 진다면 p53과 연관되어 발현되는 것인지를 면역조직화학적 연구를 통해 살펴보고, 법랑아세포 종이나 구강내 편평세포암종에의 진단에 있어, p21의 가치를 평가하고자 하였다.
제안 방법
Peroxidase가 표지된 streptavidin으로 15분간 부란시키고 PBS로 충분히 세척하였다. 3,3´-diaminobenzidine(DAB)으로 5분간 발색시킨 후 증류수로 충분히 세척하였고 Meyer’s hematoxylin으로 대조염색한 후 permount로 봉입하였다. 각 슬라이드에서 무작위로 3군데의 대표부위를 선정, 광학현미경으로 400배로 관찰하여, 전체 세포수중 염색된 세포수의 백분율을 구하였다.
내인성 peroxidase의 활성을 억제시키기 위하여 3% 과산화수소수 용액으로 10분간 처리한 후 증류수와 PBS로 세척하였다. DAKO LSAB kit(DAKO, California,U.S.A.)의 blocking 시약으로 20분간 부란시켜 비특이적 IgG 결합을 방지하였다. 그리고 상온에서 각각 p53과 p21의 일차 항체로 1시간 이상 부란한 뒤 PBS로 3회 세척하였다.
3,3´-diaminobenzidine(DAB)으로 5분간 발색시킨 후 증류수로 충분히 세척하였고 Meyer’s hematoxylin으로 대조염색한 후 permount로 봉입하였다. 각 슬라이드에서 무작위로 3군데의 대표부위를 선정, 광학현미경으로 400배로 관찰하여, 전체 세포수중 염색된 세포수의 백분율을 구하였다. 핵이 염색된 세포만을 양성으로 판정였으며, p53과 p21 모두에서 10%이상 발현된 것을 양성으로 판정하였다2,9,13,14).
법랑아세포 종은 병리학적으로는 양성이나 임상적으로 악성도를 보이는 종양으로 유명하다. 이에 저자등은 양성종양 중에서도 악성에 가까운 법랑아세포종에서 먼저 p21의 발현을 살펴보기로 하고 본 연구를 계획하여 실행하였다.
대상 데이터
1997년에서부터 2001년까지 서울대학병원에서 법랑아세포종으로 진단된 30증례를 대상으로 하였다. 이 조직은 적출 후 모두 10% 중성 포르말린 용액에 고정하였다가 통법의 탈수과정을 거쳐 파라핀에 포매하여 보관하였다.
그리고 상온에서 각각 p53과 p21의 일차 항체로 1시간 이상 부란한 뒤 PBS로 3회 세척하였다. p53에 대한 일차 항체로는 monoclonal antibody DO-7(Novocastra, Newcastle,United Kingdom)을 이용하였으며, p21에 대한 일차항체로는 monoclonal antibody M7202(DAKO,California, U.S.A.)를 각각 50 : 1로 희석하여 사용하였다. 이 후 biotin이 표지된 이차 항체로 15분간 부란한 후 PBS로 3회 세척하였다.
85세였으며, 상악에서 발생한 증례가 3증례, 하악이 27증례였다. 대조군으로는 정상치은 30증례와 편평세포암종(well differentiated type) 30증례를 이용하였다. 이 조직들도 모두 위에서처럼 파라핀에 포매시켜 보관하였다가 사용하였다.
그리고 본 연구와는 달리 p53보다 p21이 더 많이 발현된 사실을 말하면서, 이 사실만으로 통계처리 없이 p53과 p21의 연관관계가 없었다고 말하고 있다. 본 연구에서는 여러 문헌에서 임상적으로나 병리학적 자료들에 관련하여 의미있는 차이를 보인다고 하고있는 수치인 10% 이상 p21과 p53이 발현된 것을 양성으로 판정하였다2,9,13,14). 법랑아세포종에서의 p21 발현율은 30%로 p53의 63.
이 조직은 적출 후 모두 10% 중성 포르말린 용액에 고정하였다가 통법의 탈수과정을 거쳐 파라핀에 포매하여 보관하였다. 이 중 acanthomatous type이 5증례, follicular type이 8증례, plexiform type이 17증례였으며, 남자가 21명, 여자가 9명이었다. 연령은 5세에서 61세로 평균 34.
데이터처리
Table 2. Grading of immunoreactivities of p53 and p2153 and p21 expression in normal gingiva with Pearson correlation coefficient.
Table 3. Statistical analysis of relationship between p53 and p21 expression in ameloblastoma with Pearson correlation coefficient.
Table 4. Statistical analysis of relationship between p53 and p21 expression in nomal gingiva with Pearson correlation coefficient.
Table 5. Statistical analysis of relationship between p53 and p21 expression in squamous cell carcinoma with Pearson correlation coefficient.
[10%: negative(-), 10~20%: +1, 20~50%: +2, ]50%: +3. p53과 p21 발현의 연관성 여부는 Pearson’s correlation coefficient를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
면역조직화학 염색과 슬라이드 제작을 위하여 streptavidinbiotin법을 이용하였다. 먼저 박절편을 xylene으로 탈파라핀하고 각 단계의 알코올을 거쳐 함수시켰다.
성능/효과
2. 정상치은과 법랑아세포종에서 p21의 발현은 p53의 발현과 연관되어 나타났다.
3. 편평세포암종에서 p21은 83.33%의 발현율을 보여 p53에서보다 높게 나타났다. 그러나 p21의 발현은 p53과 서로 연관성을 보이지 않았다.
p53과 p21의 연관관계를 알아본 통계분석의 결과, 법랑아세포종과 정상 치은에서는 p53과 p21의 발현이 서로 연관성이 있는 것으로 나타났다(Table 3, 4). 그러나 편평세포암종에서는 서로 연관관계를 보이지 않고 독립적으로 발현되는 것으로 나타났다(Table 5).
2A, 2B). 각 type별로 보면, p53은 plexiform type 17증례 중 12증례 (70.59%),follicular type 8증례 중 2증례 (25%), acanthomatous type 5증례 중 4증례 (80%) 에서 발현이 나타났다. p21은 plexiform type에서 6증례 (35.
이와는 달리 편평세포암종에 근접한 이형성 점막에서는 기저 세포층을 포함한 전체층에서 p21이 발현이 강하게 나타났다고 하였다. 이 결과로그들은 p21의 증가된 발현이 구강내 발암 과정의 초기 과정에서 나타난다고 하였으며 구강내 발생한 편평세포암종에서는 p21이 p53과는 독립적인 과정을 통하여 발현된다고 하였다. 같은 해 van Oijen 등도10) 구강내 발생한 편평세포암종에서 67%의 p21 발현을 보였다고 하였으며, 상피이형성에서는 60%에서 p21의 발현이 보였다고 하였다.
4A, 4B). 편평세포암종에서의 결과를 보면, p53과 p21이 모두 종양조직에서 강하게 발현되는 것을 볼 수 있었다 (Fig. 5A, 5B, Fig. 6A, 6B).
후속연구
p21과 p53의 발현은 법랑아세포종에서도 정상 치은조직에서와 같이 서로 연관되어 발현되는 것으로 나타났다. 그러나 다른 양성종양에서도 p21이 p53과 관련되어 나타나는지를 파악하고 악성종양과의 비교를 위해서는 다른 여러 양성종양에서의 p21 발현에 관한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 정상 치은조직에서는 73.
그러나 p21의 발현은 p53과 서로 연관성을 보이지 않았다. 그러나 더 정확한 p21의 기능과 작용을 확인 하기 위해서는 좀 더 많은 양성종양 및 법랑아세포종에서 발전한 악성 법랑아세포종 및 법랑아세포암종에서의 p21 발현에 관한 비교, 연구가 이루어져야 할 것으로 보인다
이러한 추론은 전암병소에서는 p21이 기저 세포층을 포함하여 높게 발현되었다는 앞의 여러 문헌들의 결과를 볼 때 더욱 확실해 보인다5,6,10,20). 그러나 더 정확한 결과를 도출해 내기 위해서는, 법랑아세포종에서 진행된 법랑아세포암종에 대한 연구 및 법랑아 세포종과의 결과 비교가 필요할 것으로 보인다.
조직학적 형태별로 보면 folliular type에서는 p53과 p21 모두가 25%로 비교적 낮은 수치를 보였다. 그러나 형태별에 따른 발현의 정도를 비교하기 위하여는 좀 더 많은 증례들에 관한 연구가 필요할 것으로 보인다. p21과 p53의 발현은 법랑아세포종에서도 정상 치은조직에서와 같이 서로 연관되어 발현되는 것으로 나타났다.
다른 문헌들에서와 마찬가지로 구강내 편평세포암종에서 p53과 p21의 발현은 서로 연관성이 없는 것으로 나타났다. 이 결과로 볼 때 기존의 p53을 이용한 혈청 검사에 대한 연구가 진행되고 있는 것처럼, p21을 이용한 진단법도 구강내 발생한 편평세포암종에서 연구할 가치가 있을 것으로 보인다. p21이 정상세포에서는 세포분화가 일어나는 상피에서만 발현되고 양성종양인 법랑아세포종에서는 낮은 발현을 보이다가 악성 종양인 편평세포암종에서는 높은 발현을 보이는 것으로 볼 때, p21의 발현이 발암과정과 연관되어 있는 것으로 추론되어진다.
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