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문제 정의
- 그리고 간과 골에서 합성이 촉진된 IGF-1은 동물실험을 통하여 장골 길이 성장의 중요한 척도가 되는 성장판 말단부의 증식층 및 비대층의 연골세포 활력을 증대시켜 성장판 두께를 증가시켰고, 또한 골무기질밀도를 증가시키는 효과를 보여주었다. 따라서 본 연구는 GSM의 지속적인 연구를 통하여 성장기 어린이에게 성장촉진 및 골강화에 응용할 수 있는 소재로 개발 가능성이 있음을 제시하였다.
- 따라서, 본 연구는 가시오가피를 포함한 조성물 GSM(Growth Stimulating Material)의 골성장촉진 작용기전을 IGF- 1과 관련하여 in 와 in vivo 연구를 병행하여 조사하였다.
- 본 연구는 가시오가피를 함유한 성장촉진용 조성물인 GSM의 성장촉진 효과를 관찰하기 위하여, 족경골 말단의 성장판증식과 골성장인자 IGF-1 유전자 발현에 미치는 영향, 골세포와 간세포에서 골성장인자 IGF-1 유전자 발현, 그리고 족경골의 생육 효과를 관찰하였다. GSMe 세포실험을 통하여 주요 성장 인자인 IGF-1 을 간에서 합성을 촉진시킬 뿐만 아니라, 골에서도 합성을 촉진시키는 효과를 나타내었다.
제안 방법
- GSM 투여가 성장판을 증가시켜 골성장을 촉진시키는 것으로 관찰되었으므로 3주간 GSM 투여한 흰쥐의 족경골 성장판내에서 in situ hybridization 방법을 이용하여 골 성장을 직접적으로 촉진하는 주요 성장인자로 알려진 IGF-1의 mRNA 발현 증가 여부를 확인하였다. Fig.
- GSM이 다양한 범위에서 효과가 있는지 알아보기 위하여, 실험동물을 mouse로 선택하여 족경골 생육 효과를 관찰하였다. 골성장촉진 효과를 측정하기 위하여, 마우스에 3주간 GSM을 경구투여 한후, 족경골의 길이, 두께 그리고, 골무 기질 밀도를 측정하였다(Table 2).
- PCRe 94℃, 5 min (94℃, 1 min — 60℃, 1 min — 72℃, 1 min)(40 cycle) — 72℃, 10 min 7 4<>C의 조건으로 수행 하였으며 , internal control로는 GAPDH gene specific primer를 이용하여 94℃, 5 min — (94℃, 1 min — 65℃, 1 min 72℃, 1 min) (25 cycle) t 72℃, 10 min — 4℃의 조건으로 수행하였다. IGF-1 gene 발현량은 Image Master YDS software(Amersham Pha- macia Biotech, UK)를 이용하여 측정하였다.
- MG-63 조골세포와 Hep-G2 간세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. MG-63 세포와 Hep-G2 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 6 well plate에 배양한 다음, FBS-free DMEM 배지에서 16시간 동안 방치하여 FBS의 효과를 제거하였다. 이후 각 well 에 GSM을 0, 25, 50, 100, 200, 400)ig/mL 농도별로 포함된 FBS-free DMEM 배지로 교체한 후 24시간 방치하여 세포 시료를 준비하였다.
- PCR에 사용된 IGF-1 특이적 primer는 각각 5, -CCAAATTATTTAAGTGCTG C-3'(left primer)과 5, -CAAATGTACTTCCTTCTGGG-3, (right primer)이며, PCR 산물의 크기는 396 bp이다. PCRe 94℃, 5 min (94℃, 1 min — 60℃, 1 min — 72℃, 1 min)(40 cycle) — 72℃, 10 min 7 4<>C의 조건으로 수행 하였으며 , internal control로는 GAPDH gene specific primer를 이용하여 94℃, 5 min — (94℃, 1 min — 65℃, 1 min 72℃, 1 min) (25 cycle) t 72℃, 10 min — 4℃의 조건으로 수행하였다. IGF-1 gene 발현량은 Image Master YDS software(Amersham Pha- macia Biotech, UK)를 이용하여 측정하였다.
- Total RNA 5 μg에 100 pmol의 Oligo dT primer를 부가한 다음, 65℃에 10분간 방치하고 RT premix(bioneer: K2044)를 이용하여 reverse transcription를 수행하였다. PCR에 사용된 IGF-1 특이적 primer는 각각 5, -CCAAATTATTTAAGTGCTG C-3'(left primer)과 5, -CAAATGTACTTCCTTCTGGG-3, (right primer)이며, PCR 산물의 크기는 396 bp이다.
- 골성장촉진 효과를 측정하기 위하여, 마우스에 3주간 GSM을 경구투여 한후, 족경골의 길이, 두께 그리고, 골무 기질 밀도를 측정하였다(Table 2). 족경골의 길이는 대조군과 GSM 투여군에서 각각 16.
- 알려져 있다(23). 따라서 GSM의 성장촉진효과가 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 주요 골성장인자인 IGF- 1의 발현 양상을 in vitro 세포 배양을 이용하여 인간 조골세포 MG-63과 간세포 Hep-G2에서 RT-PCR 방법을 이용하여 관찰하였으며, IGF-1 발현양상은 GAPDH 발현량 대비로 % 비율로 표시하였다.
- 분리하여 길이와 두께를 캘리퍼스로 측정하였다.또한 X-ray 골밀도측정기(PIXImus densitometer, LUNAR,USA)를 이용하여 경골의 골무기질밀도를 측정하였다.
- 먼저 GSM이 장골 길이 성장에 어떤 영향을 미치는지 관찰하기, 위하여, GSM을 3주간 투여한 SD 흰쥐의 족경골 근위부의 성장판을 관찰하였다. GSM 투여군에서 성장판 두께의 증가를 보였고, 또한 증식층 길이가 96% 증가함을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 마우스는 족경골(tibia)의 생장을 측정하기 위하여 사용되었고, SD 흰쥐는 족경골의 조직을 관찰하는데 이용되었다. 모든 동물실험설계는 증류수를 투여하는 대조군(n= 10)과 GSM을 투여한 실험군(n= 10)으로 분류하였고, 매일 1회 각각 증류수와 시료를 경구투여 하였다. 동물사육의 환경은 온도 23 + 1℃, 습도 50±5%로 조정하였고, 12시간 명암주기를 유지하였다.
- 1 %의 Tween 20이 함유된 PBS로 세척하고 biotinylated anti-fluorescein으로 20분간 반응시킨 뒤, Strepto- avidin Horseradish peroxidase conjugate로 다시 20분간 반응시켰다. 반응정도는 DAB(diamhiobenzidine, USA)에 의해 갈색으로 반응된 정도를 알아보았으며, IGF-1 probe의 sequence 는 5'-TCCACCAGCTCAGCCCCGCAAAGGGTCTCTGGTCC3와 같다.
- 실험동물 C57BL/6에 3주간 증류수와 GSM을 경구투여한 후, diethylether(Showa, Japan)로 마취를 시킨 후, 좌우 족경골(tibia)을 분리하여 길이와 두께를 캘리퍼스로 측정하였다.또한 X-ray 골밀도측정기(PIXImus densitometer, LUNAR,USA)를 이용하여 경골의 골무기질밀도를 측정하였다.
- 및 증식영역의 길이를 측정하였다. 실험동물SD 흰쥐에 3주간 증류수와 GSM을 투여하고, diethylether (Showa, Japan)로 마취를 시킨 후, 개흉한 다음 needle을 좌심실에 주입한 후 헤파린 처리된 PBS를 심장에 관류시켰다.이어서 0.
- MG-63 세포와 Hep-G2 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 6 well plate에 배양한 다음, FBS-free DMEM 배지에서 16시간 동안 방치하여 FBS의 효과를 제거하였다. 이후 각 well 에 GSM을 0, 25, 50, 100, 200, 400)ig/mL 농도별로 포함된 FBS-free DMEM 배지로 교체한 후 24시간 방치하여 세포 시료를 준비하였다.
- 조골세포 및 간세포에서 IGF-1 발현 촉진을 관찰하기 위하여 Marinaro 등에 의한 방법(18)을 변형하여 total RNA 분리 및 RT-PCR을 수행하였다. MG-63 조골세포와 Hep-G2 간세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다.
- 1 M phosphate buffered formalin 고정액에 고정시킨다음, 고정된 골조직을 paraffin 절편으로 제작하였다. 조직절편을 H&E staining(16)하여 광학현미경으로 관찰하고 형상분석프로그램 (IMT(VT)-Morphology, USA)으로 성장판내에 증식영역의 길이를)im 단위로 측정하였다.
대상 데이터
- 및 RT-PCR을 수행하였다. MG-63 조골세포와 Hep-G2 간세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. MG-63 세포와 Hep-G2 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 6 well plate에 배양한 다음, FBS-free DMEM 배지에서 16시간 동안 방치하여 FBS의 효과를 제거하였다.
- 행하였다. 가시오가피는 (주)그린케어에서 수입한 북한산 가시오가피 농죽액을 동결건조(freeze dryer, Bondiro, Korea)하여 가시오가피 추출물을 제조하였고, 각종 비타민, 미네랄 등과 조합하여 가시오가피가 함유된 성장촉진용 조성물을 제조하였다.이 조성물을 GSM(Growth Stimulating Material)이라 명명하였다 (Table 1).
- 증가시키는 방법이 필요하다. 따라서 본 실험은 가시오가피를 포함한 성장촉진용 조성물(GSM)이 성장인자의 체내 발현을 증가시키는지 알아보기 위하여 수컷 SD 흰쥐를 공시동물로 선정하였고, 주령은 수컷 SD 흰쥐의 계속적인 성장 증가를 보이지만 5주에서 6주사이에 가장 많은 성장증가를 보인다는 연구결과에 의해 성장이 둔화되기 시작하여 성장인자의 발현이 감소될 수 있는 시점인 7주령을 채택하였다 (20).
- 생후 4주령의 수컷 C57BL/6 마우스(20.5 ± 1.4 g)와 7주령 수컷 Sprague-Dawley(SD) 흰쥐(238±2 g)를 각각 20마리씩 대한 바이오 링크에서 구입하여 1주일간 고형배합사료(삼양배합사료)와 물로 예비 사육시킨 후에 실험을 수행하였다. 마우스는 족경골(tibia)의 생장을 측정하기 위하여 사용되었고, SD 흰쥐는 족경골의 조직을 관찰하는데 이용되었다.
데이터처리
- 모든 data는 mean土SEM으로 나타내었으며, 통계분석은 약물 투여군을 대조군과 비교한 Student's t-test"50를 행하였다.
이론/모형
- In situ hybridizatione Zimmermann 등의 방법"*)을 이용하여 조직내의 IGF-1 mRNA 발현양상을 관찰하였다. 상기와 같이 준비된 조직절편을 사용하였다.
- 가시오가피 추출물 제조는 AOAC방법(15)에 의해 행하였다. 가시오가피는 (주)그린케어에서 수입한 북한산 가시오가피 농죽액을 동결건조(freeze dryer, Bondiro, Korea)하여 가시오가피 추출물을 제조하였고, 각종 비타민, 미네랄 등과 조합하여 가시오가피가 함유된 성장촉진용 조성물을 제조하였다.
- 성장판의 증식영역 관찰을 위해서 박 등의 방법에 따라 조직표본제작 및 증식영역의 길이를 측정하였다. 실험동물SD 흰쥐에 3주간 증류수와 GSM을 투여하고, diethylether (Showa, Japan)로 마취를 시킨 후, 개흉한 다음 needle을 좌심실에 주입한 후 헤파린 처리된 PBS를 심장에 관류시켰다.
성능/효과
- 200 [ig/mL, lane 6: 400 μg/mL (b) Expression ratio of IGF-1 mRNA compared with non-treated control cell, emeans significant difference compared with GSM non-treated control group (P<0.05).
- 증가 여부를 확인하였다. Fig. 2에서 IGF-1 mRNA 발현 부분은 검은색을 띄고 있는 부분으로, 대조군에 비해 GSM 투여군에서, IGF-1 mRNA 발현량의 급격한 증가를 확인 할 수 있었다(Fig. 2). 성장판내의 IGF-1 mRNA 발현 면적은 대조군(4712|im2)에 비해 GSM 투여군(7260 ㎛2)이 54% 증가하였고, IGF-1 mRNA 발현 세포수에서 대조군 93개, GSM 투여군 168개로 역시 81%의 유의적 증가를 보였다(Fig.
- 성장판을 관찰하였다. GSM 투여군에서 성장판 두께의 증가를 보였고, 또한 증식층 길이가 96% 증가함을 관찰할 수 있었다(Fig. l)(P<0.001). 성장판은 연골세포의 형태, 크기, 대사능력에 따라 증식층, 성숙층, 비대층으로 분류되며, 골성장은 증식층의 연골세포 분열이 활발히 이루어진 후에 성숙과정을 거쳐 비대층에서 비대가 이루어지고 무기질로 이루어진 연골 조직으로 대체되면서 성장이 일어난다.
- 생육 효과를 관찰하였다. GSMe 세포실험을 통하여 주요 성장 인자인 IGF-1 을 간에서 합성을 촉진시킬 뿐만 아니라, 골에서도 합성을 촉진시키는 효과를 나타내었다. 그리고 간과 골에서 합성이 촉진된 IGF-1은 동물실험을 통하여 장골 길이 성장의 중요한 척도가 되는 성장판 말단부의 증식층 및 비대층의 연골세포 활력을 증대시켜 성장판 두께를 증가시켰고, 또한 골무기질밀도를 증가시키는 효과를 보여주었다.
- MG-63 조골세포에 GSM을 0, 25, 50, 100, 200, 400 gg/mL 농도로 처리한 결과 농도 의존적으로 IGF-1 발현량이 증가하였고, 특히 400|ig/mL 농도에서는 GSM 무처리군보다IGF-1 발현량이 2.3배 증가함을 보였다(Fig. 3)(P<0.05). 또한 간세포 Hep-G2 에서는 200ug/mL 농도에서 GSM 무처리군보다 IGF-1 발현량이 3.
- GSMe 세포실험을 통하여 주요 성장 인자인 IGF-1 을 간에서 합성을 촉진시킬 뿐만 아니라, 골에서도 합성을 촉진시키는 효과를 나타내었다. 그리고 간과 골에서 합성이 촉진된 IGF-1은 동물실험을 통하여 장골 길이 성장의 중요한 척도가 되는 성장판 말단부의 증식층 및 비대층의 연골세포 활력을 증대시켜 성장판 두께를 증가시켰고, 또한 골무기질밀도를 증가시키는 효과를 보여주었다. 따라서 본 연구는 GSM의 지속적인 연구를 통하여 성장기 어린이에게 성장촉진 및 골강화에 응용할 수 있는 소재로 개발 가능성이 있음을 제시하였다.
- 세포실험에서는 GSM 농도에 따라 MG-63세포와 Hep-G2세포에서 IGF-1 유전자의 발현 양상은 각기 다르게 나타냈지만, 결론적으로 GSM이 간과 골조직에서 IGF-1 유전자 발현을 촉진시킨다는 것을 뒷받침하고 있다. 따라서, 동물실험에서의 성장판내의 IGF-1 mRNA 발현량 증가와 세포실험에서의 간과 골세포에서의 IGF-1 mRNA 발현량 증가는 GSM이 성장인자의 체내 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었고, 이는 곧 IGF-1 이 골형성에 관여하는 조골세포의 분화와 증식을 촉진시킨다는 많은 연구결과에 의해(4,24,25), igF-1 발현을 촉진시키는 GSM이 장골길이성장에 크게 관여 할 것으로 생각된다.
- 실험동물에 IGF-1 투여시 장골길이와 근위부 두께가 증가한다는 연구 결과가 많이 보고되고 있지만(26,27), GSM 투여군에서 IGF-1 분비가 증가함에도 불구하고 족경골 길이에서 통계적으로 유의적인 차이를 보이지 않은 것eGSM의 처리기간이 짧았던 때문으로 추정된다. 또한 골의 외부 충격에 대한 저항력의 척도가 되는 골무기질 밀도에서는GSM 투여군(43.0mg/cm2)이 대조군(41.2 mg/cn?)보다 증가를 보였고 유의적인 차이를 나타내었다(P<0.05). 이 결과는 에스트로젠과 더불어 IGF-1 도 골무기질 밀도를 조절한다는 최근의 보고와 일치한다(28).
- 2). 성장판내의 IGF-1 mRNA 발현 면적은 대조군(4712|im2)에 비해 GSM 투여군(7260 ㎛2)이 54% 증가하였고, IGF-1 mRNA 발현 세포수에서 대조군 93개, GSM 투여군 168개로 역시 81%의 유의적 증가를 보였다(Fig.2)(P<0.01).
- 01). 세포실험에서는 GSM 농도에 따라 MG-63세포와 Hep-G2세포에서 IGF-1 유전자의 발현 양상은 각기 다르게 나타냈지만, 결론적으로 GSM이 간과 골조직에서 IGF-1 유전자 발현을 촉진시킨다는 것을 뒷받침하고 있다. 따라서, 동물실험에서의 성장판내의 IGF-1 mRNA 발현량 증가와 세포실험에서의 간과 골세포에서의 IGF-1 mRNA 발현량 증가는 GSM이 성장인자의 체내 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었고, 이는 곧 IGF-1 이 골형성에 관여하는 조골세포의 분화와 증식을 촉진시킨다는 많은 연구결과에 의해(4,24,25), igF-1 발현을 촉진시키는 GSM이 장골길이성장에 크게 관여 할 것으로 생각된다.
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