위질환 원인균으로 알려진 H. pylori 생육을 저해하는 물질을 탐색하기 위하여 호장근메탄을 추출물 및 분획물을 이용하여 H. pylori에 대한 항균실험 및 urease 활성 억제효과를 검토하였다. 호장근 메탄올 추출물의 항균실험을 실시한 결과 5mg/cylinder의 농도일 때 inhibition zone이 17mm 정도로 높은 항균성을 가지는 것으로 나타났으며, 분획물의 경우 1mg/cylinder의 농도일 때 hexane 분획과 chloroform 분획물에서 각각 24mm, 17mm로 높은 항균 활성을 보였다. H. pylori의 crude urease를 분리하여 urea broth에서 흡광도와 pH를 조사한 결과, 반응 2시간 후 pH가 8.35까지 증가하였고 $O.D._{560nm}$에서의 흡광도는 0.859까지 증가하였다. 호장근에 의한 urease 활성억제는 호장근의 메탄올 추출물의 농도가 0.5 mg/mL에서 대조구에 비해 35% 억제효과를 보였고, 2 mg/mL에서는 85% 이상으로 매우 높은 억제활성을 보였다. 또한. 각 분획물의 저해 효과를 10배 농도의 메탄올추출물과 비교하였을 때. $20\;{\mu}g/mL$의 농도에서 water 분획을 제외한 모든 분획물들이 반응 2시간 후 $30{\sim}40%$의 저해를 보여 $200\;{\mu}g/mL$ 농도의 메탄올추출물이 20% 이하의 저해를 보인 것과 비교해 높은 활성을 보였다. 호장근 메탄올 추출물 처리에 의한 H. pylori의 형태변화를 조사하기 위하여 주사 및 투과전자 현미경으로 균의 형태를 관찰하였다. 주사전자 현미경 관찰 시 대조구는 균체 표면이 깨끗하고 완전한 구형을 이루고 있는 반면, 호장근 처리구는 균체 표층 구조가 심하게 허물고 떨어져 나간 것을 볼 수 있었고 또한 세포가 팽대하였고 일부 세포벽은 완전히 파괴되어 균체내 성분이 모두 유출되어 균 형태가 없어져 버린 것도 관찰되었다.
위질환 원인균으로 알려진 H. pylori 생육을 저해하는 물질을 탐색하기 위하여 호장근 메탄을 추출물 및 분획물을 이용하여 H. pylori에 대한 항균실험 및 urease 활성 억제효과를 검토하였다. 호장근 메탄올 추출물의 항균실험을 실시한 결과 5mg/cylinder의 농도일 때 inhibition zone이 17mm 정도로 높은 항균성을 가지는 것으로 나타났으며, 분획물의 경우 1mg/cylinder의 농도일 때 hexane 분획과 chloroform 분획물에서 각각 24mm, 17mm로 높은 항균 활성을 보였다. H. pylori의 crude urease를 분리하여 urea broth에서 흡광도와 pH를 조사한 결과, 반응 2시간 후 pH가 8.35까지 증가하였고 $O.D._{560nm}$에서의 흡광도는 0.859까지 증가하였다. 호장근에 의한 urease 활성억제는 호장근의 메탄올 추출물의 농도가 0.5 mg/mL에서 대조구에 비해 35% 억제효과를 보였고, 2 mg/mL에서는 85% 이상으로 매우 높은 억제활성을 보였다. 또한. 각 분획물의 저해 효과를 10배 농도의 메탄올추출물과 비교하였을 때. $20\;{\mu}g/mL$의 농도에서 water 분획을 제외한 모든 분획물들이 반응 2시간 후 $30{\sim}40%$의 저해를 보여 $200\;{\mu}g/mL$ 농도의 메탄올추출물이 20% 이하의 저해를 보인 것과 비교해 높은 활성을 보였다. 호장근 메탄올 추출물 처리에 의한 H. pylori의 형태변화를 조사하기 위하여 주사 및 투과전자 현미경으로 균의 형태를 관찰하였다. 주사전자 현미경 관찰 시 대조구는 균체 표면이 깨끗하고 완전한 구형을 이루고 있는 반면, 호장근 처리구는 균체 표층 구조가 심하게 허물고 떨어져 나간 것을 볼 수 있었고 또한 세포가 팽대하였고 일부 세포벽은 완전히 파괴되어 균체내 성분이 모두 유출되어 균 형태가 없어져 버린 것도 관찰되었다.
This study was performed to evaluate the potentiality of Reynoutria elliptica Migo., being used as a folk remedy and a herb medicine for urethritis, cystitis, etc., on growth inhibition of Helicobacter pylori which is known as the ulcerogenic pathogen. The minimum inhibitory concentration (MIC) valu...
This study was performed to evaluate the potentiality of Reynoutria elliptica Migo., being used as a folk remedy and a herb medicine for urethritis, cystitis, etc., on growth inhibition of Helicobacter pylori which is known as the ulcerogenic pathogen. The minimum inhibitory concentration (MIC) value of methanol extract from Reynoutria elliptica Migo, was determined to be 120 ppm for H. pylori and urease activity derived from H. pylori was inhibited over 80% by the extract at 2 mg/mL in urea broth. Among various solvent fraction of the methanol extract, the hexane fraction showed a significant inhibitory effect on the growth of H. pylori reducing both its growth and urease activity. Scanning and transmission electron micrographs of H. pylori treated with the methanol extract at 2 mg/mL for 3 hr showed that the cell walls and membranes were disrupted so that the cytoplasmic components were leaked from the body. These results suggest that Reynoutria elliptica Migo. possesses a therapeutic potential on the gastric disease caused by H. pylori.
This study was performed to evaluate the potentiality of Reynoutria elliptica Migo., being used as a folk remedy and a herb medicine for urethritis, cystitis, etc., on growth inhibition of Helicobacter pylori which is known as the ulcerogenic pathogen. The minimum inhibitory concentration (MIC) value of methanol extract from Reynoutria elliptica Migo, was determined to be 120 ppm for H. pylori and urease activity derived from H. pylori was inhibited over 80% by the extract at 2 mg/mL in urea broth. Among various solvent fraction of the methanol extract, the hexane fraction showed a significant inhibitory effect on the growth of H. pylori reducing both its growth and urease activity. Scanning and transmission electron micrographs of H. pylori treated with the methanol extract at 2 mg/mL for 3 hr showed that the cell walls and membranes were disrupted so that the cytoplasmic components were leaked from the body. These results suggest that Reynoutria elliptica Migo. possesses a therapeutic potential on the gastric disease caused by H. pylori.
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문제 정의
pylori의 생육억제물질을 검색하기 위한 하나의 방법이 될 수 있다. 따라서, 우선 H. pylori 균체로부터 crude urease를 추출한 후 호장근 추출물이 urease 활성에 미치는 영향을 조사하였다.
본 연구에서는 한방에서 위질환 치료에 사용되고 있거나 항균성을 가지는 것으로 알려진 약용식물들 중 기존에 보고되지 않은 28종을 토대로 하여 H. pylori에 대한 항균활성을 탐색한 후 가장 우수한 항균활성을 보인 호장근을 이용하여 메탄올 주줄물과 다양한 용매 분획물을 제조하여 H. pylori 에 대한 생육 저해 효과 및 urease 활성 억제 효과를 확인하였다.
제안 방법
H. pylori에 대한 호장근 추출물의 항균효과는 agar discdiffusion으로 조사하였다. H.
1 M phosphate buffer로 4℃에서 4시간 전고정시킨 후 동일한 bufi&로 3~4회 세척하고 다시 1% osmium tetraoxide(OsQi)를 함유한 bufi&에서 90분간 후고정을 하였다. 다음에 동일한 buffer로 세척한 후 2% agar로 block을 만들어 30-100% 시cohol로 순차적으로 탈수하였으며, epoxy와 propylene oxide를 섞은 용액으로 치환시킨 후 silicon capsule을 제조하였다, 이렇게 제조된 block sample을 Ultratome(MT-X, USA)을 사용하여 diamond knife로 절취하고, uranyl acetate와 Lead citrate로 염색을 한 후 투과전자 현미경 (H-7600, HITACHI, Japan) 으로 관찰하였다.
1 M phosphate buffer로 4℃에서 4시간 전고정시킨후 동일한 buffer로 3~4회 세척하고 다시 1% osmium tet- raoxide(OsO4)를 함유한 buffer에서 90분간 후고정을 하였다. 다음에 동일한 buffer로 세척한 후 30-100% alcoho로 순차적으로 탈수하였으며, 이를 isoamyl acetate 에 1시간 정도 치환을 시킨 후 critical point dryer(HCP-2, HTIACHI, Japan)로 건조하고, Ion coaterCIB-5, EIKO, Japan)를 이용하여 백금 coming 시킨 다음 주사전자 현미경 (S-4100, HI1ACHI, Jan-pan)으로 관찰하였다.
먼저 H. pylori로부터 crude urease의 분리는 하(23)의 방법을 변형하여 사용하였다. 즉 brucella broth에 3일간 배양한 H.
것을 구입하여 사용하였다. 먼저 호장근을 10배 용량의 80% methan이과 혼합하여 24시간 동안 정치 추출하고, 이를 총 3회 반복 추출하였다. 추출액은 여과지 (batman No.
먼저, urease 활성에 대한 억제효과를 검색하기에 앞서 분리한 crude urease의 활성을 urea broth를 이용하여 시간에 따른 pH와 흡광도(O.D560nm) 변화로 확인하였다. 그 결과, PH 변화는 초기 pH 7.
1, England)를 사용하여 2회 여과하고 회전감압 농축기 (R-3000, Buchi, Switzerland)로 농축하여 동결건조를 한 후 분말화 하여 본 실험의 시료로 사용하였다. 메탄올 추출물을 물에 녹인 후 극성이 서로 다른 용매 (hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol)를 이용하여 순차 분획 후 각각 농축하고 동결건조 함으로써 각 용매에 대한 분획물을 얻었다.
이 때 단백질 농도는 Lowry 방법(24)에 따라 측정하였다. 분리된 urease 활성은 이 등의 방법으로urea broth(Difco, USA) 1 mL에 urease 300μL를 첨가하여 22℃에서 2시간 동안 반응시키며 20분 간격으로 pH 및 흡광도(Q.D560nm) 변화를 측정하였다.
45 μm membrane filter로 제균하여 2-fold dilution을 실시하였다. 여기에 H. pylori를 CFU/mL의 농도로 접종하여 CO2 incubatoi에서 18시간 배양 후, 100 μL 씩을 취하여 bru cella 한천 배지에 도말하고 동 조건으로 배양시켜 colony 생성유무를 확인하여 해당 추출물에 대한 MIC를 측정하였다. 이상의 실험들은 항균효과가 초기 pH에 의해 나타나는 것을 방지하기 위해 추출물의 pH를 7.
호장근 추출물 처리에 의한 균체 내부의 손상 여부를 관찰하기 위하여, 위와 같은 조건으로 배양한 시험균의 균체를 2.5% glutaraldehyde를 함유한 0.1 M phosphate buffer로 4℃에서 4시간 전고정시킨 후 동일한 bufi&로 3~4회 세척하고 다시 1% osmium tetraoxide(OsQi)를 함유한 bufi&에서 90분간 후고정을 하였다. 다음에 동일한 buffer로 세척한 후 2% agar로 block을 만들어 30-100% 시cohol로 순차적으로 탈수하였으며, epoxy와 propylene oxide를 섞은 용액으로 치환시킨 후 silicon capsule을 제조하였다, 이렇게 제조된 block sample을 Ultratome(MT-X, USA)을 사용하여 diamond knife로 절취하고, uranyl acetate와 Lead citrate로 염색을 한 후 투과전자 현미경 (H-7600, HITACHI, Japan) 으로 관찰하였다.
pylori를 108~109 CFU/mL의 농도로 brucella 한천배지에 도말 한 후 멸균된 cylinder(inner diameter 6 mm)를 올려 놓았다. 호장근 추출물은 membrane filter(0.45 μm)로 제균하고 cylinder에 각각의 농도로 첨가하여 37℃의 CO2 incubator에서 48시간 배양 후 cylinder 주위에 생성된 inhibition zone의 유무 확인 및 직경을 측정하여 항균 활성을 측정하였다.
호장근 추출물의 urease 억제효과는 이 등(20)의 방법으로 4.2 mL urea broth에 각종 농도의 추출물을 500 μL 첨가한 후 pH를 7.0으로 보정 한 다음 300μL의 urease를 첨가하여 22℃에서 2시간 반응시키면서 20분 간격으로 pH변화를 측정하였다. Urease 활성억제율은 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 pH 변화값을 1로 기준하여 각 농도에 따른 추출물의 pH 변화를 백분율로 환산하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 호장근은 대구광역시 약령시장에서 건조상태인 것을 구입하여 사용하였다. 먼저 호장근을 10배 용량의 80% methan이과 혼합하여 24시간 동안 정치 추출하고, 이를 총 3회 반복 추출하였다.
실험에 사용한 균주는 위십이지장 궤양 원인균으로 알려진 H. pylori로서 표준균주인 KCTC 2948을 유전자은행으로부터 분양 받아 사용하였다. 배양은 10%(v/v)의 calf serum(Gibco BRL, USA)을 함유하는 brucella broth(Difco, USA)를 사용하여 10% CO2 incubator에서 microaerobic condition을 유지시켜 주고, 습도는 항상 95% 이상 유지하면서 37℃에서 18시간 간격으로 3회 계대 배양하여 사용하였다.
이론/모형
2)로 2회 세척 한 후 4℃에서 6분간 sonication(U200S control, Ika, Germany) 시키고, 15,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 crude urease로 사용하였다. 이 때 단백질 농도는 Lowry 방법(24)에 따라 측정하였다. 분리된 urease 활성은 이 등의 방법으로urea broth(Difco, USA) 1 mL에 urease 300μL를 첨가하여 22℃에서 2시간 동안 반응시키며 20분 간격으로 pH 및 흡광도(Q.
성능/효과
D560nm) 변화로 확인하였다. 그 결과, PH 변화는 초기 pH 7.0에서 반응 2시간 후 pH 8.35로 계속적인 증가를 보였고 흡광도는 2시간동안 0.85의 증가를 보였다. 이때의 단백질 함량은 Lowry(24) 방법으로 정량한 결과 4.
2). 그중 hexane 분획물이 항균실험 결과와 같은 경향으로 가장 높은 활성을 나타냈으며, 그와는 달리 항균효과를 보이지 않았던 butanol 분획물이 hexane 다음으로 높은 urease 저해활성을 보였다. 그리고 분획물의 종류에 따른 활성의 차이는 크게 보이지 않았다.
이는 thyme 열수추추물이 3 mg/mL의 처 리농도에서 urease 활성을 약 45% 감소시킨다는 Tabak 등(16)의 보고와 저령 메탄올 추추물이 10 mg/mL에서 약 55% 억제시킨다는 하(23)의 보고 그리고 소목, 소엽 및 황련이 10mg/mL에서 80% 이상의 억제 효과를 보였다는 이 등(20)의 보고와 우수한 저해 효과이다. 또한, 각 분획물의 urease에 대한 저해 효과를 1C배 농도의 메탄올 추출물과 비교하였을 때, 20μg/mL의 농도에서 water 분획을 제외한 모든 분획물들이 반응 2시간 후 대조군에 비해 30~40%의 저해를 보여 200pig/mL 농도의 메탄올 추출물이 20% 이하의 저해를 보인 것과 비교해 높은 활성을 보였다(Fig. 2). 그중 hexane 분획물이 항균실험 결과와 같은 경향으로 가장 높은 활성을 나타냈으며, 그와는 달리 항균효과를 보이지 않았던 butanol 분획물이 hexane 다음으로 높은 urease 저해활성을 보였다.
pylori에 대한 항균활성을 측정한 결과는 Table 1~2와 같다. 메탄올 추출물의 각 농도별inhibition zone은 로 처리농도에 비례하여 H. pylori에 대한 항균효과가 증가하였으며, 최소저해농도(MIC)는 120 ppm으로 측정되었다. 한편, 호장근의 hexane과 chloroform 분획물에서만 항균효과가 나타났으며, 그 밖의 분획물에서는 항균효과를 거의 보이지 않았다.
이 등(20)의 보고에 따르면 소엽의 경우 butanol 분획물에서, 소목은 ethyl acetate 분획물에서 황련의 경우는 butanol 분획물에서 가장 높은 효과를 보인 것으로 보고하였는데, 본 실험에서는 다소 다른 결과를 보여 hexane . 분획물에서 가장 우수한 효과를 보였다. 이는 호장근에 존재하는 항균물질이 소엽, 소목 및 황련에 존재하는 활성물질들보다는 극성지수가 극히 낮은 물질임을 시사하며, 호장근의 hexane 분획물로부터 활성물질의 분리및 구조규명에 대한 연구를 수행중에 있다.
그 중 hexane 분획물이 1 mg/cylinder의 농도에서 24mm로 가장 높은 효과를 보여, positve controls. 쓰인 ampicillin과 H. py/ori에 대한 저해효과를 비교한 결과 hexane(l mg/cylinder) 분획물은 ampicillin(0.5 mg/ cylinder)과 유사한 항균효과가 있음을 확인하였다.
pylori를 CFU/mL의 농도로 접종하여 CO2 incubatoi에서 18시간 배양 후, 100 μL 씩을 취하여 bru cella 한천 배지에 도말하고 동 조건으로 배양시켜 colony 생성유무를 확인하여 해당 추출물에 대한 MIC를 측정하였다. 이상의 실험들은 항균효과가 초기 pH에 의해 나타나는 것을 방지하기 위해 추출물의 pH를 7.0으로 보정한 후 실시하였으며, 최초 호장근 추출물의 pH는 5.45이었다.
호장근의 urease 활성 저해능을 확인한 결과, 반응 2시간 후 메탄올 추출물은 0.5 mg/mL의 농도에서 35%를 2 mg/mL의 농도에서 85%를 저해하는 것으로 나타났으며, 처리 농도가 증가 할 수록 저해 효과 또한 증가하였다(Fig. 1). 이는 thyme 열수추추물이 3 mg/mL의 처 리농도에서 urease 활성을 약 45% 감소시킨다는 Tabak 등(16)의 보고와 저령 메탄올 추추물이 10 mg/mL에서 약 55% 억제시킨다는 하(23)의 보고 그리고 소목, 소엽 및 황련이 10mg/mL에서 80% 이상의 억제 효과를 보였다는 이 등(20)의 보고와 우수한 저해 효과이다.
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