충치발생 원인균인 Streptococcus mutans에 대한 각종 천연물질의 항균효과와 GTase 저해활성을 조사한 결과, 미숙사과, 황련, 우롱차, 감초 등에서 항충치 효과를 나타내었으며, 그 중에서 감초를 열수추출한 다음 생성된 박을 75% 에탄올로 추출하여 얻어진 감초박 추출물이 가장 탁월한 생육저해 효과가 관찰되었다. 또한 이들 소재를 중심으로 충치균이 불용성 glucan을 생산하는 GTase 활성 저하에 미치는 영향을 살펴본 결과, 녹차, 오배자, 미숙사과 polyphenol 추출물 및 감초박 추출물이 GTase의 활성을 저해시키는 효과를 보였으며 특히 항충치 효과에서와 같이 감초박을 75% 에탄올로 추출한 감초박 추출물이 가장 뛰어난 GTase 활성억제 효과를 나타내었다. 감초박을 75% 이상의 에탄올로 추출한 추출물보다 chloroform으로 추출한 추출물에서 더욱 탁월한 항충치균 효과가 관찰되었다. 감초박을 75% 에탄올로 추출한 후, 각종 유기용매로 2차 분획하였을 때, chloroform으로 추출한 분획에서 가장 강한 항충치균 활성이 나타났다. 얻어진 추출물을 silicagel column상에서 4개의 분획으로 재차 분리하였고, 첫번째 분획에서 가장 강한 항충치균 활성을 나타내는 분획을 얻었으며, 이들 분획을 HPLC로 분석했을 때 항충치균에 대한 활성은 주로 소수성이 강한 물질에 의한 것이라고 추정되어졌다.
충치발생 원인균인 Streptococcus mutans에 대한 각종 천연물질의 항균효과와 GTase 저해활성을 조사한 결과, 미숙사과, 황련, 우롱차, 감초 등에서 항충치 효과를 나타내었으며, 그 중에서 감초를 열수추출한 다음 생성된 박을 75% 에탄올로 추출하여 얻어진 감초박 추출물이 가장 탁월한 생육저해 효과가 관찰되었다. 또한 이들 소재를 중심으로 충치균이 불용성 glucan을 생산하는 GTase 활성 저하에 미치는 영향을 살펴본 결과, 녹차, 오배자, 미숙사과 polyphenol 추출물 및 감초박 추출물이 GTase의 활성을 저해시키는 효과를 보였으며 특히 항충치 효과에서와 같이 감초박을 75% 에탄올로 추출한 감초박 추출물이 가장 뛰어난 GTase 활성억제 효과를 나타내었다. 감초박을 75% 이상의 에탄올로 추출한 추출물보다 chloroform으로 추출한 추출물에서 더욱 탁월한 항충치균 효과가 관찰되었다. 감초박을 75% 에탄올로 추출한 후, 각종 유기용매로 2차 분획하였을 때, chloroform으로 추출한 분획에서 가장 강한 항충치균 활성이 나타났다. 얻어진 추출물을 silicagel column상에서 4개의 분획으로 재차 분리하였고, 첫번째 분획에서 가장 강한 항충치균 활성을 나타내는 분획을 얻었으며, 이들 분획을 HPLC로 분석했을 때 항충치균에 대한 활성은 주로 소수성이 강한 물질에 의한 것이라고 추정되어졌다.
As an effort to select powerful anti-cariogenic materials from natural resources, various plant extracts were examined for their anti-S. mutans and anti-glucosyltransferase (GTase) activities. The ethanol extracts of licorice bark, which was produced after water extraction of licorice, showed the mo...
As an effort to select powerful anti-cariogenic materials from natural resources, various plant extracts were examined for their anti-S. mutans and anti-glucosyltransferase (GTase) activities. The ethanol extracts of licorice bark, which was produced after water extraction of licorice, showed the most powerful anti-S. mutans as well as anti-GTase activities. When licorice bark was consecutively fractionated with n-hexane, chloroform, ethylacetate, and butanol, the chloroform fraction exhibited the strongest anti-S. mutans activites. This fraction was further fractionated into 4 fractions through a silica gel column, and according to HPLC analysis, anti-S. mutant activities seemed to come mostly from relatively hydrophobic materials.
As an effort to select powerful anti-cariogenic materials from natural resources, various plant extracts were examined for their anti-S. mutans and anti-glucosyltransferase (GTase) activities. The ethanol extracts of licorice bark, which was produced after water extraction of licorice, showed the most powerful anti-S. mutans as well as anti-GTase activities. When licorice bark was consecutively fractionated with n-hexane, chloroform, ethylacetate, and butanol, the chloroform fraction exhibited the strongest anti-S. mutans activites. This fraction was further fractionated into 4 fractions through a silica gel column, and according to HPLC analysis, anti-S. mutant activities seemed to come mostly from relatively hydrophobic materials.
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문제 정의
본 연구에서는 충치 예방 및 진행중단의 방법으로부터 지 금까지 보고되어 있거나 민간에서 효과가 있다고 여겨지는 천연물로부터 치아우식증의 원인이 되는 S. mutans의 생장 및 GTase 활성 등의 억제에 대한 효과를 지닌 소재의 발굴을 통해 항충치 효과를 지닌 성분을 구명하고자 하였다.
제안 방법
S. mutans균이 생성하는 GTase가 sucrose로부터 점착성이고 불용성인 glucan을 합성하므로 21시간 배양된 S. mutans 균에서 조효소액을 분리하여 각 추출물이 GTase 활성에 미치는 영향에 대하여 조사하였다(Table 3). 대부분의 시료들에서 어느 정도 GTase의 활성을 저해하는 것으로 나타났으며 녹차인 경우는 항충치 효과는 약했지만 싱대적으로 GTase 저해능은 우수하였다.
Silica gel column으로부터 분리된 4개 분획의 구성물질에 대한 정보를 얻기 위하여 HPLC를 이용하였으며 이때의 분석 조건은 Table 1에 나타내었다.
감초에는 flavonoids, isoflavonoids, chalcons 및 coumarins등 페놀성물질 이 다량 분포하고 있으며(19~21), 이런 성분들이 강력한 항충치 효과를 보일 것으로 추정된다. 가장 항균력이 강한 chlo-roform 분획물을 silicagel column에서 4개의 분획으로 분리 하였으며(Fig. 1). 이들 각 분획의 S.
각 시료의 GTase에 의한 glucan의 합성을 저해하는 정도를 비교하기 위하여 Miyoshi 등(13)의 방법에 따라 충치균 배 양액을 4℃에서 8, 000rpm, 5분간 원심분리시킨 후 그 상등 액을 취하여 toyo filter paper No. 101로 여과하고, 그 여액을 1 N NaOH를 이용하여 pH를 7.0으로 조정한 다음 sodium azide 0.02% 첨가하여 제조한 GTase 조효소액에 1% sucrose와 시료를 농도별로 첨가하고 37℃, 24시간 반응시킨 후 표면에 부착된 glucan을 sonicator를 이용하여 최대한 현탁한 후 660nm에서 탁도를 측정하여 sucrose 무첨가군과 비교한 상 대치로 glucan 생성 억제 정도를 측정하였다.
대표적인 충치 원인균인 Streptococcus mutant 대하여 항균효과가 있는 소재를 선정하기 위하여 각 추출물의 충치균에 대한 생육 저해효과를 plate count법을 통하여 1차 선별을 하였다(Table 2). 전반적으로 열수추출물 보다 75% 에탄올 추출물에서 좀 더 높은 효과를 보였다.
따라서 열수추출후 폐기되는 잔사물을 활용한다는 측면에서 항충치 효과를 지닌 유효성분의 분리와 이를 이용한 항충치 가공품의 개발은 큰 의의가 있다고 생각된다. 본 결과에서는 감초박의 chloroform 분획에서 가장 강한 항균효과가 관찰되었지만 식품공전 상에 식품첨가물 제조를 위한 추 출용매로는 ethanol로 제한되어 있기 때문에 75% ethanol로 추출하는 것을 원칙으로 하였다.
가장 활성이 뛰어난 chloroform 분획물을 silica gel 60G가충진된 column(2X20cm)에서 분리하였다. 용매는 chloroform과 메탄올 혼합용매를 이용하여 메탄올 농도를 0%에서 100%로 단계적으로 증가시키는 용출 방법으로 분획하였다.
5 mL를 가하여 잘 혼합한 후 BHI agar 위에 붓는다. 표면이 굳으면 paper disc(직경 8 nun)를 놓아 시료 추출물을 50uL씩 흡수시키고 37P의 incubator에서 24시간 배양한 후 clear zone의 지름을 측정, 비교하였다.
항충치 효과가 뛰어난 75% 에탄올로 추출된 감초추출물을 n-hexane, chloroform, ethylacetate, butanol로 극성 차이에 따라 순차 분획하였다. 각 분획의 항균력을 paper disc법으로 측정하였다.
대상 데이터
Streptococcus mutans(KFRl 1171, 1172, 1175)을 brain heart infusion(BHI) broth에 접종하여 37℃ shaking incubator에서 3회 계대 배양함으로서 활성을 회복시키고, 활성이 회복된 균주를 한천평판배지에 분주하여 37℃에서 24시간 혐 기 배양하여 사용하였다.
녹차 polyphenol, 미숙사과 polyphenol 분말은 물에 용해시켜 사용하였고, 우롱차, 황련, 감잎, 떫은감, 오배자, 미숙사과, 육두구 및 계피는 9(rc에서 1시간동안 열수추출 또는 75% 에탄올로 85P에서 1시간동안 추출한 뒤 동결건조를 하였으며, 감초인 경우는 열수추출 후 얻어진 잔사에 75% ethanol로 추출한 시료를 사용하였다.
항충치소재 선정을 위해 본 연구에서 사용된 시료는 상업용 식품첨가물인 녹차 polyphenol No. 201와 polyphenol CBFK(foodmate, Korea), 미숙사과 polyphenol(Applephenon, Japan), 키토산(한국키토산연구원)과 우롱차(Oolong tea), 황련 (Coptidis rhizoma), 감잎 (persimmon leaf), 떫은 감(Persimmon), 오배자 (Nutgall), 육두구 (Nutmeg), 미숙사과 (Unripe apple polyphenol), 둥글레 (Polygodoratum Ohwi), 계피 (Cassia cortex), 쑥(Artemisia) 및 감초 (Licorice) 등을 사용하였다. 한약재는 경동시장에서 구입하였으며 10℃에서 보관하였다.
이론/모형
항충치 효과가 뛰어난 75% 에탄올로 추출된 감초추출물을 n-hexane, chloroform, ethylacetate, butanol로 극성 차이에 따라 순차 분획하였다. 각 분획의 항균력을 paper disc법으로 측정하였다.
성능/효과
1)The antimicrobial activities against S. mutans are represented as follows; ++++: The growth of S. mutans was decreased 103~104 CFU/mL; +++: ditto, 102~103; ++: ditto, 101~102, +: ditto, 100~ 101; No inhibition. The concentration of all samples was adjusted 0.
mutans IV기에 대한 생육저해 효과는 Table 6과 같다. S mutans 1171 에 대한 항균력은 분획 I (chlorofdrm: methanol = 100:0)에서 거의 대부분 나타났으며, 이들 분획물을 HPLC상에서 YMC-pack column 을 이용하여 각 분획의 구성성분을 비교해본 결과(Fig. 2), 분획 I 은 다른 분획들에 비해 다소 소수성이 강한 구성성분이 차지하는 비율이 월등히 높은 것으로 나타나 이들 성분들이 감초 특유의 충치균 생장억제능 발현에 중요한 역할을 하리라 추정된다. 현재 이들 성분의 분리와 동정을 위한 실험을 진행 중에 있다.
mutans 균에서 조효소액을 분리하여 각 추출물이 GTase 활성에 미치는 영향에 대하여 조사하였다(Table 3). 대부분의 시료들에서 어느 정도 GTase의 활성을 저해하는 것으로 나타났으며 녹차인 경우는 항충치 효과는 약했지만 싱대적으로 GTase 저해능은 우수하였다. 특히 감초인 경우는 감초박(Licorice bark) 에탄올추출물의 첨가가 GTase 활성을 강력하게 저해하여 불용성 glucan의 형성을 억제하였다.
감초의 항충치 효과를 나타내는 원인물질을 분리 . 동정하기 위하여 75% ethanol 추출물에 n-hexane, chloroform, ethylacetate, butanol 및 물로 순차적으로 분획하여 항충치효과 (S. mutans 1171, 1172, 1175)를 조사한 결과, chloroform 분 획물에서 가장 강한 항균력을 나타내었다(Table 5). 감초에는 flavonoids, isoflavonoids, chalcons 및 coumarins등 페놀성물질 이 다량 분포하고 있으며(19~21), 이런 성분들이 강력한 항충치 효과를 보일 것으로 추정된다.
대표적인 충치 원인균인 Streptococcus mutant 대하여 항균효과가 있는 소재를 선정하기 위하여 각 추출물의 충치균에 대한 생육 저해효과를 plate count법을 통하여 1차 선별을 하였다(Table 2). 전반적으로 열수추출물 보다 75% 에탄올 추출물에서 좀 더 높은 효과를 보였다. 항충치 효과가 있다고 보고된 육두구, 계피(8)와 녹차 추출분말(14)은 상대적으로 약한 효과를 나타내었으며, 미숙사과, 감잎, 황련, 우롱차 에탄올 추출물이 효과가 뛰어났다.
항충치 효과가 있다고 보고된 육두구, 계피(8)와 녹차 추출분말(14)은 상대적으로 약한 효과를 나타내었으며, 미숙사과, 감잎, 황련, 우롱차 에탄올 추출물이 효과가 뛰어났다. 특히 감초(Licorice)를 열 수추출하고 남은 잔사를 75% 에탄올로 추출하여 얻어진 감초추출물에서 가장 높은 항균력을 나타내었으며 이러한 결과는 감초 잔사 추출물을 이용한 새로운 항충치균 소재의 개 발의 가능성을 보여주고 있다.
항충치효과와 GTase 활성 억제가 가장 뛰어난 감초를 이용하여 항충치 기능을 가진 성분을 분리하기 위하여 열수추출물과 추출 후 남은 잔사에 100, 75, 50% ethanol, chloroform, hexane으로 주출한 주줄물의 중치균에 대한(S. mutans KFRI 1171) 생육 억제 효과를 측정한 결과, 감초 열수추출물은 항충치 효과가 없었으며 감초박 n-hexane 추출물인 경우도 미미한 효과를 보인 반면, 감초박을 chloroform으로 추출하였을 경우 가장 강력한 항충치 효과를 나타내었으며 50% 이상의 에탄올 추출물에서도 강한 항충치 효과를 관찰할 수 있었다(Table 4). 에탄올 추출온도는 항충치균 활성에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다.
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