벤조피렌 유발 마우스에서 싸리버섯 메탄올 추출물의 간 독성 억제효과 및 사이토크롬 P-450 1A1 Isozyme의 발현에 미치는 영향 Effect of Ramaria botrytis Methanol Extract on Hepatotoxicity in Benzo(α) Pyrene-treated Mice and Expression of Cytochrome P-450 1A1 Isozyme원문보기
싸리버섯 메탄올 추출물이 간독성 물질인 B$({\alpha})$P을 투여한 마우스에서 간 손상 억제 효과 및 cytochrome P-450 1A1 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. B$({\alpha})$P 투여로 인한 혈청 ALT와 AST의 활성, 간 조직증의 lipid peroxide 함량, cytochrome P-450 함량, AD 및 AH 활성이 유의적으로 증가하였으며 싸리버섯 메탄올 추출물의 투여시 이들 활성 및 함량이 유의적으로 감소하였다. 반면, 간 조직중의 GSH 함량, GST, r-glutamylcysteine synthetase의 활성은 B$({\alpha})$P만 투여한 군에 비해 싸리버섯 메탄올 추출물을 투여시 증가하였다. 또한 immuno blotting 결과로부터 B$({\alpha})$P 투여에 의해 현저히 증가되었던 cytochrome P-450 1A1 isozyme 단백질 함량이 싸리버섯 메탄올 추출물의 투여로 감소됨을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터 싸리버섯 메탄올 추출물은 B$({\alpha})$P에 의한 간 손상에 대한 보호 효과가 있는 것으로 사료된다.
싸리버섯 메탄올 추출물이 간독성 물질인 B$({\alpha})$P을 투여한 마우스에서 간 손상 억제 효과 및 cytochrome P-450 1A1 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. B$({\alpha})$P 투여로 인한 혈청 ALT와 AST의 활성, 간 조직증의 lipid peroxide 함량, cytochrome P-450 함량, AD 및 AH 활성이 유의적으로 증가하였으며 싸리버섯 메탄올 추출물의 투여시 이들 활성 및 함량이 유의적으로 감소하였다. 반면, 간 조직중의 GSH 함량, GST, r-glutamylcysteine synthetase의 활성은 B$({\alpha})$P만 투여한 군에 비해 싸리버섯 메탄올 추출물을 투여시 증가하였다. 또한 immuno blotting 결과로부터 B$({\alpha})$P 투여에 의해 현저히 증가되었던 cytochrome P-450 1A1 isozyme 단백질 함량이 싸리버섯 메탄올 추출물의 투여로 감소됨을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터 싸리버섯 메탄올 추출물은 B$({\alpha})$P에 의한 간 손상에 대한 보호 효과가 있는 것으로 사료된다.
This study was conducted to investigate effects of Ramaria botrytis methanol extract on liver damage in benzo$({\alpha})$pyrene(B$({\alpha})$P)-treated mice. The activities of serum amminotransferase, cytochrome P-450, aminopyrine N-demethylase, aniline hydroxylase and hepatic ...
This study was conducted to investigate effects of Ramaria botrytis methanol extract on liver damage in benzo$({\alpha})$pyrene(B$({\alpha})$P)-treated mice. The activities of serum amminotransferase, cytochrome P-450, aminopyrine N-demethylase, aniline hydroxylase and hepatic content of lipid peroxide after B$({\alpha})$P-treatment were increased than control, but those levels were significantly decreased by the treatment of Ramaria botrytis methanol extract. Whereas, the hepatic glutathione content and activities of glutathionie S-transferase and r-glutamylcysteine syntherase were increased by the treatment of Ramaria botrytis methanol extract. In addition, cytochrome P-450 1A1 izozyme protein level, remarkably increased by B$({\alpha})$P-treatment was decreased by the treatment with methanol extract of Ramaria botrytis. These results suggest that the protective effect of methanol extract of Ramaria botrytis on liver injury in B$({\alpha})$P-treated mice may be due to reduction of oxygen free radical.
This study was conducted to investigate effects of Ramaria botrytis methanol extract on liver damage in benzo$({\alpha})$pyrene(B$({\alpha})$P)-treated mice. The activities of serum amminotransferase, cytochrome P-450, aminopyrine N-demethylase, aniline hydroxylase and hepatic content of lipid peroxide after B$({\alpha})$P-treatment were increased than control, but those levels were significantly decreased by the treatment of Ramaria botrytis methanol extract. Whereas, the hepatic glutathione content and activities of glutathionie S-transferase and r-glutamylcysteine syntherase were increased by the treatment of Ramaria botrytis methanol extract. In addition, cytochrome P-450 1A1 izozyme protein level, remarkably increased by B$({\alpha})$P-treatment was decreased by the treatment with methanol extract of Ramaria botrytis. These results suggest that the protective effect of methanol extract of Ramaria botrytis on liver injury in B$({\alpha})$P-treated mice may be due to reduction of oxygen free radical.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 싸리버섯이 간 독성 물질로 알려진 benzo(a)pyrene 처리에 의한 간손상에 대해 미치는 영향을 살펴보기 위하여, 먼저 마우스에 싸리버섯 메탄올 추출물을 전 처리한 다음 benzo(a)pyrene을 투여하여 급성간 독성을 유발시킨 후 마우스의 간 조직에서의 효소학적인 변화와 함께 cytochrome P-450 1 Al isozyme 단백질의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다.
제안 방법
구분하여 사육하였다. 각 실험군은 대조군(C), 싸리버섯 메탄올 추출물 처리군(M), 벤조피렌 단독 처리군(B) 및 싸리버섯 메탄올 추출물을 전 처리한 다음 벤조피렌을처리한 군(MB)으로 하였다. 싸리버섯 메탄올 추출물의 투여는 마우스 kg당 50 mg으로 하여 5일간 1일 1회 일정시간에 복강 주사하였고, 이때 대조군의 경우 시료 대신 생리식염수를 동일하게 주사하였으며, 벤조피렌 투여는 시료 투여한 다음 5일째에 benzo(a)pyrene(B(α)P)을 체중 kg당 0.
그리고 간은 생리식염수로 관류하여 간 조직에 남은 혈액을 제거하여 적출하였다. 적출한 간 조직 1g당 4배량의 0.
각 실험군은 대조군(C), 싸리버섯 메탄올 추출물 처리군(M), 벤조피렌 단독 처리군(B) 및 싸리버섯 메탄올 추출물을 전 처리한 다음 벤조피렌을처리한 군(MB)으로 하였다. 싸리버섯 메탄올 추출물의 투여는 마우스 kg당 50 mg으로 하여 5일간 1일 1회 일정시간에 복강 주사하였고, 이때 대조군의 경우 시료 대신 생리식염수를 동일하게 주사하였으며, 벤조피렌 투여는 시료 투여한 다음 5일째에 benzo(a)pyrene(B(α)P)을 체중 kg당 0.3 mg으로 1회 복강주사한 다음 24시간 후 처치하였다.
싸리버섯 메탄올 추출물이 간독성 물질인 B(α)P을 투여한 마우스에서 간 손상 억제 효과및 cytochrome P-450 1A1 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. B(α)P 투여로 인한 혈청 ALT와 AST의 활성, 간 조직중의 lipid peroxide 함량, cytochrome P-450 함량, AD 및 AH 활성이 유의적으로 증가하였으며 싸리버섯 메탄올 추출물의 투여시 이들 활성 및 함량이 유의적으로 감소하였다.
이때 1차 항체는 Anti-rat CYP1A1 (goat, DAIICHI Pure Chemicals.), 2차 항체로는 peroxidase rabit Anti-goat IgG(H+L)를 사용한 후 HRP-발색시약(Bio-Rad Co.)으로 발색시킨 다음 관찰하였다. 그리고 단백질 정량은 Lowry 등(1951)의 방법에 준하여 소혈청 알부민을 표준품으로 하여 결정하였다.
대상 데이터
Each lane was loaded with 20 µg mice liver microsomes. Polyclonal Anti-Rat CYPlAl(goat) antibody (diluted 1:1000) was used. Lane 1: Control.
본 실험에 사용한 시료는 싸리버섯(Ramaria botrytis (Fr.) Ricken)으로 충청북도 속리산에서 채취하여 음건한 후 사용하였다. 건조된 버섯은 먼저 waring blender로 3, 000 rpm에서 5분 동안 분쇄하여 분말화 하였다.
실험 동물은 평균 체중이 25~30g인 ICR계 마우스 (male)* 사용하여 온도(18土 2℃), 습도(65土2%)와 명암주기(12시간)가 자동적으로 조절되는 사육실에서 7일 간 환경에 적응시킨 후, 난괴법에 따라 군당 10마리씩 4군으로 구분하여 사육하였다. 각 실험군은 대조군(C), 싸리버섯 메탄올 추출물 처리군(M), 벤조피렌 단독 처리군(B) 및 싸리버섯 메탄올 추출물을 전 처리한 다음 벤조피렌을처리한 군(MB)으로 하였다.
데이터처리
실험결과는 통계처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 각 실험군 간의 유의성 검정은 α =0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 이용하여 통계분석 하였다.
이론/모형
그 단위는 간 조직 1 g당 µmole로 나타내었다. Cytosolic fraction 중 glutathione S-transferase(GST) 활성은 Habig 등(1974)의 방법에 준하여 기질인 2, 4-dinitrochlorobenzene과 환원형 glutathione을 기질로 하여 생성된 GSH-DNCB 공액의 분자흡광계수 9.6nM-1Cm-1를 이용하여 산정하였고, al dehyde oxidase의 활성은 Rajagopalan 등의 방법(1962), xanthine oxidase의 활성은 Stirpe과 Della의 방법(1969) 으로, r-glutamylcysteine synthetase의 활성은 Meister와 Richman의 방법 (1975) 그리고 glutathione reductase의 활성은 Mize와 Langdon의 방법(1962)에 준하여 즉정하였다. Microsomal fraction중 cytochrome P-450의 활성은 Omura와 Sato(1964)의 방법, aminopyrine N-demethylase의 활성은 Nash의 방법(1953), aniline hydroxylase의 활성은 Bidlack과 Lowry의 방법(1982)으로 측정하였다.
그리고 cytochrome P-450 1A1 isozyme의 immunoblot 분석은 microsomal fraction을 10~20µg의 단백질 농도로 준비하여 Laemmli법(1970)에 의해 전기영동한 후 western blotting(1984)하였다. 이때 1차 항체는 Anti-rat CYP1A1 (goat, DAIICHI Pure Chemicals.
)으로 발색시킨 다음 관찰하였다. 그리고 단백질 정량은 Lowry 등(1951)의 방법에 준하여 소혈청 알부민을 표준품으로 하여 결정하였다.
혈청중 aminotransferase의 활성도는 Reitman과 Frankel(1957)의 방법으로 측정하였으며, 간 조직의 lipid peroxide 함량은 Ohakawa 등(1979)의 방법에 의한 TBA 법을 이용하여 생성된 malondialdehyde 양을 측정하여 간 조직 1 g당 생성된 malondialdehyde nmole로 표시하였고, glutathione(GSH) 함량은 Ellman의 방법(1959)에 의하여 비단백성 sulfhydryl group를 5, 5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid로 발색시켜 412nm에서 비색정량 하였다. 그 단위는 간 조직 1 g당 µmole로 나타내었다.
성능/효과
발현에 미치는 영향을 살펴보았다. B(α)P 투여로 인한 혈청 ALT와 AST의 활성, 간 조직중의 lipid peroxide 함량, cytochrome P-450 함량, AD 및 AH 활성이 유의적으로 증가하였으며 싸리버섯 메탄올 추출물의 투여시 이들 활성 및 함량이 유의적으로 감소하였다. 반면, 간 조직중의 GSH 함량, GST, r-glutamylcysteine synthetase의 활성은 B(α)P만 투여한 군에 비해 싸리버섯 메탄올 추출물을 투여시 증가하였다.
B(α)P만 투여한 군은 lipid peroxide의 함량이 대조군에 비하여 유의적인 증가를 보였으나, 싸리버섯 메탄올 추출물과 B(α)P을 투여한 군은 B(a)P만 투여한 군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었다. 이는 B(a)P과 같은 생체 이물질의 대사 시 약물대사 효소계로부터 생성된 여러 자유라디칼들이 지질과산화를 증가시켰다는 보고(Gelboin, 1980)와 일치하였고, B(a)P과 싸리버섯 메탄올 추출물의 투여시 간 조직의 지질과산화물이 감소되는 것은 생체내에서 지질과산화물 생성 반응이 자유라디칼 제거능을 가진 싸리버섯 메탄올 추출물의 항산화적 방어계의 작용에 의해 억제된 것으로 생각된다.
1997). Cytochrome P-450 1A1은 polycyclic aromatic hydro- carbone(PAH)과 반응하여 유도되는 효소로, B(α)P 투여시 cytochrome P-450 1A1 의 단백질 함량이 대조군에 비해 현저히 증가하였으며 싸리버섯 메탄올 추출물을 투여함으로써 감소되는 경향을 보였다(Fig. 1). 이는 싸리버섯메탄올 추출물이 B(α)P에 의해 유도된 간 독성을 해독시키기 위해 cytochrome P-450 1A1 의 protein level을 감소시키는데 관여한 것으로 사료된다.
, 1980). GSH 함량은 B(α)P만 투여한 군이 대조군에 비해 현저히 감소되었으며, 싸리버섯 메탄올 추출물 처리후 B(α)P을 투여한 군은 B(α)P만 투여한 군에 비하여 증가하는 경향을 나타내었다(Table 2). 이것은 B(α)P과 같은 독성물질이 투여되었을 경우에는 GSH이 독성물질을 대사시켜 체외로 배출되는데 이용되므로(Burk et al.
관여한다(Meister, 1985). r-Glutamylcysteine synthe-tase의 활성은 대조군에 비해 B(α)P 투여시 감소되었다가 싸리버섯 메탄올 추출물 처리 후 B(α)P 투여군에서는 그 활성이 증가되었다(Table 3). 그러나 glutathione reductase의 경우는 각 군별에서 유의적 차이가 나타나지 않았다.
, 1990). 간 조직 중 GST 활성의 변화는 Table 2와 같이, 대조군에 비하여 B(α)P 투여군에서는 유의적으로 감소하였고, 싸리버섯 메탄올 추출물과 B(α)P 투여군은 B(α)P 단독 투여군에 비해 유의성 있게 증가하였다. 이것은 발암원인 B(α)P 투여시 생성된 free radical을 GSH이 대사시켜 체외로 배출하는데 이용되므로 GSH 함량이 저하되고 해독기구에 관여하는 효소인 GST의 활성도 감소되지만, B(α)P과 싸리버섯 메탄올 추출물 투여시에는 B(α)P 투여로 감소되던 GST의 활성을 대조군 수준으로 회복시킨 것으로 보여진다.
그리고 싸리버섯 메탄올 추출물이 B(α)P 처리에 의한 cytochrome P-450의 활성은 Table 4와 같이 , 대조군에 비하여 B(α)P 투여군은 P-450의 활성이 유의적으로 증가하였으며, 싸리버섯 메탄올 추출물과 B(α)P 투여시 활성이 유의적으로 감소되었다. 이것은 B(α)P 투여로 mouse microsome 내 존재하는 cytochrome P-450의 활성 증가로 생성된 H2O2나 유리기를 GSH이 대사시켜 체외로 배출되는 데(Astrom et al.
따라서 B(α)P 투여로 microsome을 통한 유리기 생성효소계들 즉 cytochrome P-450, AD 및 AH 등의 활성 증가로 생성되는 활성 산소에 의한 간 손상이 싸리버섯 추출물의 투여시 이들 효소계가 억제되어 간 손상이 회복되는 것으로 보여진다.
반면, 간 조직중의 GSH 함량, GST, r-glutamylcysteine synthetase의 활성은 B(α)P만 투여한 군에 비해 싸리버섯 메탄올 추출물을 투여시 증가하였다. 또한 immuno blotting 결과로부터 B(α)P 투여에 의해 현저히 증가되었던 cytochrome P- 450 1A1 isozyme 단백질 함량이 싸리버섯 메탄올 추출물의 투여로 감소됨을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터 싸리버섯 메탄올 추출물은 B(α)P에 의한 간 손상에 대한 보호 효과가 있는 것으로 사료된다.
, 2001) 와 일치하였다. 이러한 결과로 싸리버섯 메탄올 추출물은 B(α)P에 의한 간 손상에 대한 보호 효과가 있는 것으로 사료된다.
1982). 혈청내 ALT 및 AST의 활성은 B(α)P 투여시 증가하다가, 싸리버섯 메탄올 추출물을 투여 시 이들 활성이 유의적으로 감소하였다(Table 1). 이는 B(α)P 투여시 혈청내 ALT와 AST의 활성 증가는 급성간 손상시 그 활성도가 혈청 중에서 증가한다는 보고와 일치하였다(Yoon et al.
후속연구
, 1970)에 따라 버섯에 대한 관심은 더욱 높아졌다. 버섯은 자연계에 수천 종 이상 존재하며 다양한 기능성과 그에 관련된 여러 가지 성분을 함유하고 있어고 부가가치 건강식품으로 취급되고 있으며 또한 새로운 의약품 소재로의 개발 가능성도 높다고 하겠다. 그 중에서 싸리버섯 (Ramaria botrytis (Fr.
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