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문제 정의
- 본 연구에서는 단순 PGR의 사용으로 인한 false positive의 문제점을 해결하기 위하여 Y. 仑ntemcoliticQ균에 특이적인 ail, yst 및 sTF를 병원성 marker.로 사용하였고 Yersinia 속균을 구별하는 subgenus-specific Y16S primer■를 도입하여 multiplex PCR을 수행함으로써 Y.
제안 방법
- Multiplex-PCR법으로 검출 가능한 최소 세균수를 알아보기 위하여 primer의 특이성 시험에서 특이적 DNA 절편을 가장 잘 나타내는 K enterocolitica ATCC 27729균을 표준균주로 사용하였으며 초기 농도를 7x IO" CFL7mL로부터 시작하여 연속적인 10진 희석법으로 7 CFU/mL까지 희석한 배양액을 주형으로 직접 사용하여multiplex-PCR을 실시하였다.
- PCR 조건은 denaturation 94℃ 1분, annealing 56(, C 1 분, extention 72℃ 1 분 30초를 1 cy曲로 하여 35 cycled 반응시켰다.든 최초의 cyclee denaturation 94℃ 4분, 최종 cycle후 7분간 72"C에서 extention중}여 잔여 DNA 증폭을 마무리한 후 4℃에서 보관하였고, 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose g인로 100 V에서 50분 동안 전기영동하였으며 ethidium bromide 용액에 30분간 염색한 후 목적 DNA의 증폭여 부를 UV transilluminatoreL 밴드를 분석하였다.
- 병원성 F.。간erocoliticQ 균주를 검출하기 위하여 cliromo* some에 위치한 병원성 관련 유전자로 356 bp 크기의 az7(attachment invasion locus)과 134 bp 크기의 y財(heat stable enterotoxin)유전자 및 plasmid에 위치한 병원성 유전자인 231 bp 크기의 iM* 유전자를 사용하였으며 마지막으로 厂sinia 속을 감별할 수 있는 subgenus-specific primer로 200 bp 크기의 Y16S 유전자를 multiplex-PCR primer로 사용하였다
- enterocolitica ATCC 27729균이 ail, yst 및 Y16S유전자에 모두 특이적인 증폭을 나타내었기 때문에 민감도 실험 을 위한 지표 세균으로 사용하였다. 또한, 본 실험에서 는 mutiplex PCR을 수행하였기 때문에 사용된 각 primer들의 PCR특성이 달라 혼합 사용 시 민감도가 다르기 때문에 동일한 조건에서 두 종 또는 세 종류의 primer를 혼합하여 민감도를 조사하였다.
- 仑ntemcoliticQ균에 특이적인 ail, yst 및 sTF를 병원성 marker.로 사용하였고 Yersinia 속균을 구별하는 subgenus-specific Y16S primer■를 도입하여 multiplex PCR을 수행함으로써 Y. entemcolitica균의 검출 민감도와 특이도를 높이고자 하였다.
- enterocolitica의 병원성 관련 유전자 3종과 비병원성 유전자 1종의 primere] 대한 특이성을 확인하기 위하여 E enterocolitica 분리균주 및 표준균주, Yersinia spp. 및 기타 세균 을 동일한 조건에서 multiplex PCR로 증폭한 다음 1.5% agarose g이로 전기영동하여 Y. enterocolitica의 특이적 DNA 절편을 확인하였다.
- 세균DNA의 PCR증폭은 Harnett 등(13)의 방법을 변형하여 사용하였다. 즉 단순 열처리한 균액 3 UL를 주형 DNA로 하여multiplex-PCR을 실시하였으며, reaction mixture는 10× reaction buffer 3 uL, 각각의 50 pM primer 0.
- 세균DNA의 PCR증폭은 Harnett 등(13)의 방법을 변형하여 사용하였다. 즉 단순 열처리한 균액 3 UL를 주형 DNA로 하여multiplex-PCR을 실시하였으며, reaction mixture는 10× reaction buffer 3 uL, 각각의 50 pM primer 0.6 UL dNTP(2.5 mM) 1.6 μL, Taq DNA 匸Qlyme「ase(5 unit/μL) 0.25 ML와 증류수로 27 μL되 게 조성하였으며, 여기에 template DNA 3 rL를 가하여 총 30 虬가 되도록 한 후 Biometra(UNO-Thermoblock, Germany, Biotron)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 denaturation 94℃ 1분, annealing 56(, C 1 분, extention 72℃ 1 분 30초를 1 cy曲로 하여 35 cycled 반응시켰다.
- 특이성 실험에서 가장 좋은 특이밴드를 형성 하는y財 유전자와 Y16S 유전자 2종의 primer-t- 사용하여 먹는샘물로부터 병원성 Y. enterocolitica의 검출을 알아보기 위하여 일반세균 수가 3600 CFU/mL되는 먹는샘물 시료에 Y. enterocolitica ATCC 27729균의 초기 농도를 7 x 108 CFU/m也로부터 시작하여 연속적인 10진 희석법으로 7 CFU/mL까지 접종시킨 후 100℃ 15분간 열처리한 균액 을 주형으로 직접 사용하여 mul tiplex-PCR을 실시하였다.
- 특이성 실험에서 가장 좋은 특이밴드를 형성하는 yst 유전 자와 Y16S 유전자 2종의 primer를 사용하여 신선한 상추와 양송이 버섯으로부터 병원성 Y. enterocolitica의 검출을 알아보기 위하여 각각 10 g에 Y. enterocolitica ATCC 27729균을 사용하여 초기 농도를 7X1S CFU/g로부터 시작하여 연속적인 10진 희석법으로 7 CFU/g까지 접종시킨 후 살균 증류수 90 mL를 가하여 균질화시킨 현탁액을 1 m止씩을 100℃에서 15분간 가열 처리한 균액 3 UL를 주형으로 직접 사용하여multiplex-PCR을 실시하였다.
대상 데이터
- Multiplex-PCR을 사용하여 병원성이 있는 Y. enterocolitica 균주를 신속히 검출하는 방법을 모색하기 위하여 Y. enterocolitica ATCC 27729 표준균주를 사용하였다. Chromosome0!] 위치한 a;7(attachment invasion locus), yst(heat stable enterotoxin) 유전자와 plasmid에 위치한 virF 유전자를 사용하였으며, Yersinia 속을 감별할 수 있는 Y16S(subgenus- specific primer) 유전자를 사용하여 각각의 primer 특이성을 조사한 결과는 Fig.
- enterocolitica ATCC 27729 표준균주를 사용하였다. Chromosome0!] 위치한 a;7(attachment invasion locus), yst(heat stable enterotoxin) 유전자와 plasmid에 위치한 virF 유전자를 사용하였으며, Yersinia 속을 감별할 수 있는 Y16S(subgenus- specific primer) 유전자를 사용하여 각각의 primer 특이성을 조사한 결과는 Fig. 1과 같다. Y.
- enterocolitica에 대하여 yst 유전자가 가장 높은 민감도를 나타내었다. 따라서 먹는 샘물이나 야채류에 대한 병원성 Yersinia균의 지표 유전자로서 속을 대표하는 Y16S유전 자와 종을 대표하는 yst 유전자를 선정하였다.
- 시험 균주로는 1999년부터 2001년 사이에 강원도 내 전역에 산재한 먹는 샘물에서 분리된 Y. enterocolitica 2주와 춘천지역에서 시판되고 있는 야채류로부터 분리된 Y. enterocolitica 2 주가 사용되었다. 양성대조균주로는 Y.
- enterocolitica 2 주가 사용되었다. 양성대조균주로는 Y. enterocolitica ATCC 9610, ATCC 27729 및 ATCC 23715, 기타 Y. frederikseni, Y. intermedia, Y. kristenseni, Y. pseudotuberculosis 등을 시-용하였고, 음성 대조균으로는 E. coll ATCC 25392, Shigella dysenteric Staphylococcus aureus ATCC 25923, Listeria monocytogenes ATCC 19111 균을 사용하였으며 이들을 Table 1에 나타내었다.
성능/효과
- enteroco成ica의 검출 한계 를 측정한 결과이다. Yst 유전자와 Y16S 유전자 모두 각각 7 CFU/mL의 검출 한계를 나타내었으나, ail 유전자와 Y16S 유전자를 혼합한 B에서는 " 106 CFU/mL 수준까지만 DNA 밴드 증폭을 보여 낮은 민감도를 나타내었다. 한편, 园과 yst 유전자를 혼합한 C의 경우에서도 yst 유전자는 7 CFU/mL의 검출 한계를 보였으나 ail 유전자 는 5X 伊 CFU/mL의 낮은 민감도를 나타내었다.
- 1과 같다. Y. enterocolitica ATCC 27729균은 356 bp(a;7), 134 bp(yst) 및 200 bp(Y16S) 3종의 유전자에 대한 DNA 증폭 밴드를 나타내었으며 , Y. enterocolitica ATCC 9610 및 ATCC 23715는 ysf와 Y16S 2종에만 밴드 증폭을 보였다. 한편, 기타 비병원성 Yersinia균인 Y.
- monocytogenes ATCC 19111균에서는 어떤 primer에서도 특이 DNA밴드를 확인할 수 없었기 때문에 본 연구에 사용된 ail, yst 및 Y16S primer는Y. enterocolitica 및 Yersinia 속을 감별할 수 있는 것으로 나타났다.
- 지금까지 식품 중에 존재하는 PCR 저해제를 제거하기 위하여 여과, 세척, 희석, 페놀 추출, 친화성 크로마토그라피 등 많은 방법이 효과적으로 알려졌지만 DNA의 유실이 많고 직접 PCR을 수행하였을 때에 비하여 DNA를 추출해야 하는 번거로움이 있다 (17-19). 따라서, 이러한 DNA 추출 방법 보다는 false positive반응을 줄이기 위하여 증균 시간을 아주 단축하거나 1차 PCR 후에 nested 또는 2차 PCR을 수행하는 것이 민감도를 높이는 것이 식품안전성의 관점에서 바람직할 것으로 생각된다.
- enterocolitica ATCC 27729균에 존재하였으며 u计F 유전자는 존재하지 않았다는 보고와 유사한 것으로 나타났다. 또한 팽 이 버섯 에서 분리한 병원성 Y. enterocolitica 0:8(Lane 8) 균주는 yst유전자를 소유하고 있었으나, 양배추, 미나리 및 콩나물에서 분리한 Y. enterocolitica (Lane5~7) 균주들은 이들 병원성 유전자를 소유하지 않는 것으로 나타났다. Y.
- 1x1。' CFU/g정도 함유된 양송이 버섯에 적용하였을 때에도 비슷한 결과를 나타내었다. 버섯의 경우, 1차 multiplex PCR 결과는 식품 성분과 오염된 세균들에 의해 Y16S와 ysf 유전자 모두에서 7X1S CFU/g까지 명확한 밴드가 확인되었으며 (Fig. 5A), 2차 PCR 을 수행하였을 때는 Y16S 유전자는 7X 10’ CFU/g까지 현저하게 민감도가 증진되었으며 yst 유전자는 7X101 CFU/g 수준까지 민감도가 증진되었다 (Fig. 5B).
- 본 연구에서 나타난 바와 같이 수질이나 야채류에서 Y16S 와 yst 유전자를 혼합하여 Y. enterocolitica를 검출할 경우, DNA를 분리하지 않고 직접 whole cell을 lysate하여 DNA주 형으로 사용하여도 2차 PCR을 수행할 경우에는 증균과정을 하지 않고 도 민감도를 증진시키면서 신속하게 효율적으로 원하는 대상균을 검출할 수 있었다. 향후 좀 더 신속하고 효율적인 검출을 위해서는 각각의 식품 특성에 맞는 PCR방법이 개발되어야 하겠다.
- 4A와 4B에 나타내었다. 상치의 경우, 1차mul- tiplex-PCR 결과는 식품 성분과 오염된 세균들에 의해 PCR증 폭이 억제되어 Y16S와 yst 유전자 모두 7X 10’ CFU/g까지 검출할 수 있었으나 (Fig. 4A), 1차 PCR products# DNA 주형으로 하여 다시 2차 PCR-4- 수행하였을 때 Y16S와 yst 유전자는 7 및 7X10’ CFU/g 수준까지 민감도가 현저하게 증진되었다(Fig. 4B).이러한 양상은 일반 세균이 7.
- 또한, ail, yst 및 Y16S 유전자를 혼합한 D의 경우 ail 유전자와 yst 유전자 두 종을 혼합하였을 때보다 민감도가 더 떨어졌다. 이러한 문제점은 1차 PCR product를 주형으로 사용하여 같은 조건으로 2차 PCR을수행하였을 때 밴드의 형성이 더 선명하게 나타나거나 민감도가 약간 증가함을 나타내었으나(data not shown), 전반적으로 Y. enterocolitica에 대하여 yst 유전자가 가장 높은 민감도를 나타내었다. 따라서 먹는 샘물이나 야채류에 대한 병원성 Yersinia균의 지표 유전자로서 속을 대표하는 Y16S유전 자와 종을 대표하는 yst 유전자를 선정하였다.
- enterocolitica ATCC 9610 및 ATCC 23715는 ysf와 Y16S 2종에만 밴드 증폭을 보였다. 한편, 기타 비병원성 Yersinia균인 Y. frederikseni, Y. intermedia, Y. kristenseni, Y. pseudotuberculosis Y16S 에만 DNA밴드를 나타내었으나 plasmid 유래 virF primer는 사용된 어떤 균에도 특이적인 밴드를 나타내지 않아 Y. enterocolitica 균주를 검출하는 primer로는 바람직하지 않는 것으로 나타났다. 한편, 기타 세균인 E.
후속연구
- enterocolitica의 병원성 조사는 ail, yst, virF 및 inv 유전자 중 어느 한 가지를 사용할 경우 단독 처 리로는 완전한 병원성을 나타내지 못한다. 따라서 이들 유전자들을 병용 처리 하여 사용하는 것이 바람직 하나 이들의 병용 사용 시 각각의 유전자에 대한 최적 조건을 규명하는 기초조사가 선행되어야 할 것으로 사료된다.
- 또한, 세계 여러 나라에서 이 균으로 인한 세균성 장염은 Shi&ella보다 많이 발생하며, Salmonella 와 Campylobacter만큼 일반적으로 많이 발생한다고 보고되고 있다 (6-8). 따라서 이상의 결과를 종합해 볼 때, 이 균의 감염에 예민한 환자나, 오염된 각종 식품 또는 지하수나 야수 등에서 야기될 새로운 식중독의 발생을 예방하기 위하여 이 균을 신속, 정확하게 검출할 수 있는 조기진단법의 기술개발이 절실히 필요하게 되었다.
- enterocolitica를 검출할 경우, DNA를 분리하지 않고 직접 whole cell을 lysate하여 DNA주 형으로 사용하여도 2차 PCR을 수행할 경우에는 증균과정을 하지 않고 도 민감도를 증진시키면서 신속하게 효율적으로 원하는 대상균을 검출할 수 있었다. 향후 좀 더 신속하고 효율적인 검출을 위해서는 각각의 식품 특성에 맞는 PCR방법이 개발되어야 하겠다.
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