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문제 정의
- 현상과 낮은 민감도가 u타났다. 따라서 본 실험 에서는 이 tailing의 제거와 민감도를 높이기 위하여 PCR cycle 수에 따른 최적조건을 조사 하였다. L.
- 본 연구는 식품에 존재하는 L. monocytogenes균의 신속한 검출방법을 조사하기 위하여 hlyA 유전자 primer 를 사용하여 PCR 기 법으로 행하였으며 primer의 특이 성과 PCR의 민감성, L. monocytogenes균의 검출을 위한 최적조건 및 우유 및 소고기의 적용시험을 각각 조사하였다. PCR 특이성 실험 에서는 L monocytogenes 20주에 대한 PCR 분석 결과 모두 713 bp 크기의 PCR products 확인할 수 있었고, Listeria spp.
- mongogenes는 자연 계 에 널리 분포하고 냉 장온도에서도 증식할 수 있어 monocytogenese 오염된식품을 섭취함으로써 건강한 개체도 리스테리아증을 일으킬 수 있기 때문에 이의 발생을 예방하기 위하여 원인식품에서 이 균을 신속하고 정확하게 검색해야 할 필요성이 증대되고 있다. 본 연구는 현재 널리 사용되고 있는 L. monocytogenesA 분리 배양법은 분리, 동정하는데 5~7일의 많은 시간이 소요되는 결점을 가지고 있기에특이 성과 감도가 높고 신속하게 검출할 수 있는 장점이있는 PCR 기 법 에 hlyA gene을 이용한 primer의 사용을분석하여 이를 식품에 적용하여 원유와 쇠고기에서 L. monocytogenes를 검색하고자 하였다
- 본 연구에서는 배지와 식품으로부터 L. monocyto-를 신속하게 검 출하기 위한 효율적인 PCR방법을 찾기 위하여 hlyA의 primer를 사용하여 그 특이성과 민감도를 확인하였고 다른 종류의 식품에서 이 균을 신속하게 검출할 수 있는 PCR기법을 확립하고자 하였다.
제안 방법
- monocytogenes 20균주와 Listeria spp. 14균주, 기타 그람 양성 세균 3종 및 그람 음성 세 균 2종으로부터 genomic DNA를 분리 하여 동일한 조건 하에서 PCR을 수행한 다음, 1.5% agarose g이에서 전기 영동하여 L. monocytogenese} 특이 증폭산물인 713 bp DNA절편 유무를 확인하였다.
- PCR cycle 수가 L. monocytogenes ATCC 19111 균주의 target DNA 증폭효율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 균수를 2.5 X10, 으로 하고 cycle 수를 20, 30 및 35로 하여 PCR을 실시하였다. 또한 PCR 수행의 반복이 민감도의 증진에 미치는 영향을 조사하기 위하여 20 cycle PCR을 행한 산물에서 2 J1L를 취 해 한번 더 PCR을 각각 10, 15, 20 cycle을 실시하였다.
- PCR 분석 은 Biometra (UNO - Thermoblock, Germany, Biotron)를 사용하였다. 이때 증폭 cycle 회수는 총 40 cycle로 하였으며, 매 cycle당 95℃에서 30초간 denaturation, 60"C에서 45초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 의 순으로 반응하였고, 단 최초의 cyclee denaturation 4분, 최종 cycle 후 extension을 5분으로 하였다.
- 이때 증폭 cycle 회수는 총 40 cycle로 하였으며, 매 cycle당 95℃에서 30초간 denaturation, 60"C에서 45초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 의 순으로 반응하였고, 단 최초의 cyclee denaturation 4분, 최종 cycle 후 extension을 5분으로 하였다. PCR 산물은 4℃에 보존하여 1.5% agarose 로 전기 영 동하였으며 EtBr로 염 색한 후 목적 DNA의 증폭여부를 확인하였다.
- PCR법으로 검출 가능한 DNA의 최소량을 알아보기위 하여 L. monocytogenes ATCC 19111의 genomic DNA를 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg으로 회석하여 PCR을 실시하였다. 또한 검출 가능한 최소 세균수를 알아보기 위하여 L.
- Primer는 Klein과 Juneja(35)가 사용한 L. monocytogenese] nucleotides 1620-2333의 hlyA gene를 이용한 primer로서 ELMHLYF(5'-TCCGCCTGCAAGTCCTA AGA3)와 ELMHEYRtS7 -GCGCTTGCAACTGCTCT TTA-$)를 Bioneer(충북, 청원에서 합성 정제하였다. 준비 된 DNA 주형 2 uL를 PCR용 eppendorf tube에 취하고 여기에 hlyA primer ELMHLYF 및 ELMHLYR 각 0.
- 8 mL를 첨가하여 65℃ 항온수조에 20분간 방치 하였다. 동량의 chloroform-iso-amyl alcohol(24:l)을 첨가하여 5분간 10, 000 Xg로 원심분리하여 단백질을 제거하고 상층액에 2배 부피의 isopropanol을 첨가한 후 -20℃에서 30분간 방치한 다음 10분간 10, 000xge DNA를 침전시켰으며 침전된 DNA를 70 %(v/v) 에탄올을 첨가하여 3분간 10, 000xg로 원심 분리한 후 공기중에서 건조하였다. DNA를 TE 완충액 150~ 200 mL로 녹인 후 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.
- 또한 PCR 수행의 반복이 민감도의 증진에 미치는 영향을 조사하기 위하여 20 cycle PCR을 행한 산물에서 2 J1L를 취 해 한번 더 PCR을 각각 10, 15, 20 cycle을 실시하였다. 또한 DNA 주형 의준비 방법이 민감도에 미치는 영향을 조사하기 위하여 l× I* O5 ~ 0까지 단계적으로 희석한 똑같은 배양액 10 mL 를 각각 한 번은 DNA 추출을 행하고 한 번은 배양액에서 직접 2 UL를 PCR의 DNA 주형으로 사용했다.
- 5 X10, 으로 하고 cycle 수를 20, 30 및 35로 하여 PCR을 실시하였다. 또한 PCR 수행의 반복이 민감도의 증진에 미치는 영향을 조사하기 위하여 20 cycle PCR을 행한 산물에서 2 J1L를 취 해 한번 더 PCR을 각각 10, 15, 20 cycle을 실시하였다. 또한 DNA 주형 의준비 방법이 민감도에 미치는 영향을 조사하기 위하여 l× I* O5 ~ 0까지 단계적으로 희석한 똑같은 배양액 10 mL 를 각각 한 번은 DNA 추출을 행하고 한 번은 배양액에서 직접 2 UL를 PCR의 DNA 주형으로 사용했다.
- monocytogenes ATCC 19111의 genomic DNA를 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg으로 회석하여 PCR을 실시하였다. 또한 검출 가능한 최소 세균수를 알아보기 위하여 L. monocytogenes ATCC 19111을 단계 회 석 하여 2.5 X106, 2.5 X105, 2.5 x 104, 2.5 x 103, 2.5 x 102, 2.5X10, CFU/mL의 균액을 주형으로 직접 사용하여 PCR을 실시하였다.
- 쇠고기로부터 L. monocytogenes의 검출을 알아보기 위해 쇠고기 절편 20 g에 L monocytogenes ATCC 19111 의 배양액 2 mL(BHI broth, 35℃에서 24 hr 배양액을 10배씩 희 석 한 것 )를 접 종하여 6 X107, 2.6 X106, 2.6 x 105, 2.6 X104, 2.6 X103, 2.6 xlO2, 2*, .6x10 2.6, 2.6X10 \ 2.6 X 10 2 및 0 CFU/g(접 종 후 접종한 쇠고기 10 g 에 90 mL 0.1% peptone buffer# 가한 후 균질 화시 켜 Oxford agar plate에 도말하여 35℃에서 24~48시간 배양 후 균수 측정)으로 준비 한 쇠 고기 10 g을 Listeria enrichment broth (LEB) 90 mL를 가하여 stomacher시 킨 후 균질 화한 직후 및 35℃에서 24시간 배 양한 시료에서 각 1 mL를 취 해 2번 원심분리한 후 100 mL 멸균수로 재현탁하였다. 현탁액의 3 虬를 DNA 추출 없이 직접 PCR 주형으로 사용하여 30 cycle PCR을 실시하였다.
- PCR 반응에 적합한 Listeria spp.와 다른 균주의 chromosomal DNA를 분리 하기 위하여 각 균주를 10 mL 의 BHKbrain heart infusion, Difco, USA, Detroit) 에 접종하였으며 35℃에서 24시간 배양한 후 3, 000Xg로 10분간 원심 분리하여 균체를 침전시키고 배지성분을 제거한 다음 균체는 l%(w/v) SDS와 100 ㎍/mL의 Proteinase K가 포함된 TE 완충액 (10 mM Tris-HCl, 1 mM/L EDTA; pH 7.8) 9.5 mL에 부유시 킨 다음 37℃에서 1 시간 동안 방치 한 후 5 M/L NaCl 1.8 mL를 첨가하여 65℃ 항온수조에 20분간 방치 하였다. 동량의 chloroform-iso-amyl alcohol(24:l)을 첨가하여 5분간 10, 000 Xg로 원심분리하여 단백질을 제거하고 상층액에 2배 부피의 isopropanol을 첨가한 후 -20℃에서 30분간 방치한 다음 10분간 10, 000xge DNA를 침전시켰으며 침전된 DNA를 70 %(v/v) 에탄올을 첨가하여 3분간 10, 000xg로 원심 분리한 후 공기중에서 건조하였다.
- 우유로부터 L. monocytogenes의 검 출을 알아보기 위해 L. monocytogenes ATCC 19111 을 2.0 x 107, 2.0 x 106, 2.0x10°, 2.0 xlO4, 2.0 x IO", 2.0><10 2.0x10, 2 CFU/ m로 접종시킨 우유시료에서 DNA 추출 없이 직접 2 HL 를 취 하여 24 cycle로 1차 PCR을 수행한 후 이 PCR 산물 2 UL를 이용하여 10 cycle로 2차 PCR을 실시하였다.
- monocytogenese] nucleotides 1620-2333의 hlyA gene를 이용한 primer로서 ELMHLYF(5'-TCCGCCTGCAAGTCCTA AGA3)와 ELMHEYRtS7 -GCGCTTGCAACTGCTCT TTA-$)를 Bioneer(충북, 청원에서 합성 정제하였다. 준비 된 DNA 주형 2 uL를 PCR용 eppendorf tube에 취하고 여기에 hlyA primer ELMHLYF 및 ELMHLYR 각 0.5 UM, dNTP(dATP, dTTP, dCTP, dGTP)각 200 uM, 10 x PCR buffer 5 11L 및 Taq DNA polymerase 2.5 U를 가하여 멸균한 3차 증류수로 총량이 50 J1L가 되게 하여 PCR을 수행하였다.
- 1% peptone buffer# 가한 후 균질 화시 켜 Oxford agar plate에 도말하여 35℃에서 24~48시간 배양 후 균수 측정)으로 준비 한 쇠 고기 10 g을 Listeria enrichment broth (LEB) 90 mL를 가하여 stomacher시 킨 후 균질 화한 직후 및 35℃에서 24시간 배 양한 시료에서 각 1 mL를 취 해 2번 원심분리한 후 100 mL 멸균수로 재현탁하였다. 현탁액의 3 虬를 DNA 추출 없이 직접 PCR 주형으로 사용하여 30 cycle PCR을 실시하였다.
성능/효과
- PCR에 의하여 검 출 가능한 DNA의 양과 최 소 세 균수를 측정 하기 위 햐여 L. monocytogenes ATCC 19111 균주를 각각 100pg~l pg 까지, 2.5x IO"~2.5X 10 cell 수준으로 PCR한 결과는 Fig. 2와 같으며 최소 DNA 수준은 1 pg 으로 u타났고 검출 가능한 cell 수는 2.5 X cell로 u타났다.
- 이는 Thomas 등(16)이 10mL의 우유와 LEB 증균배지 90 mL를 혼합하여 증균하지 않고 직접 PCR 검 색하였을 때 PCR products를 확인할 수 없었던 결과와비교하여 생각할 때 매우 높은 민감도라 할 수 있다. 따라서, 본 실험에 사용한 WyA gene을 이용한 ELMHLYF 및 ELMHLYR primer는 우유에"서 L. monocytogenese- 증균과정 없이 신속하게 검출할 수 있는 유용한 PCR primer라고 생각되어진다.
- 따라서 본 실험 에서는 이 tailing의 제거와 민감도를 높이기 위하여 PCR cycle 수에 따른 최적조건을 조사 하였다. L. monocytogenes ATCC 19111의 균수를 2.5X IO, 수준으로 하고 cycle 수를 20, 30, 35로 PCR한 결과 모든 cycle에서 PCR 산물이 관찰되 었고, cycle 수가 증가할수록 증폭량도 증가하는 것으로 u타났으u 또한 tailing 현상도 증가하기 때문에 tailing 현상이 없는 깨끗한 관찰을 위해서는 20-30 cycle 정 도의 PCR clcyle 수가 좋은 것으로 u타났다(Fig. 3). 또한 PCR 수행의 반복이 민감도를 높이는지의 영향을 조사하기 위하여 20 cycle PCR을 행한 product에서 2 UL 를 취해 한번 더 PCR을 각각 10, 15, 20 cycle PCR을 실시한 결과 반복 PCR을 수행할 때 10 cycle로 한 경우는 기존의 보고된 40 cycle로 한번만 PCR한 경 우보다 10배 민감도가 증가하였고 15와 20 cycle로 했을 때는 100배 증가하였으며 10과 15 cycle한 경우는 깨끗한 band가 관찰되 었고 20 cycle에서 는 tailing0] 관찰되어 반복 PCR을 행할 경우 15 cycle이 적당한 것으로 확인되었으며 그 결과 102 cell까지 검출이 가능했다.
- 1A에서와 같다. L. monocytogenes는 20균주 모두 713 bp 크기의 증폭산물을 u타내었으u, 다른 균종에서는 같은 크기의증폭산물이 u타u지 않았으며 또한 Listeria 속균 이 외의 그람 양성균 3종, 그람 음성균 2종의 전기 영동 결과도 Fig. IB에서 u타난 바와 같이 713 bp의 증폭산물이 u타u지 않아 ELMHLYF 및 ELMHLYR primer가 L. monocytogenes에 만 특이 적 으로 증폭산물을 생 성 하는 primer 임을 알 수 있었다.
- 4 X104 cell 수준에서 target DNA 가 증폭되었다. Tailing의 제거와 민감도를 높이기 위하여 PCR cycle 수에 따른 최적조건을 조사한 결과 20~30 cycle 정도의 PCR clcyle 수가 좋은 것으로 나타났으며 민감도는 20 cycle PCR amplification을 행한 후 한번더 10~15 cycle로 처리했을 때 훨씬 증가하였다. 한편, 우유(10 mL)와 쇠고기 절편(10 g)에 0~ WCFU/mL 또는 g 수준으로 L.
- monocytogenese: 배 양하지 않고 직접 검출한 경우 쇠고기에 의해 PCR 증폭이 많이 억제되어 tailing 현상도 심하여 증폭산물이 확인되지 않았다. 따라서 최적 cycle을 찾기 위해 cycle 수를 변화시 킨 결과 30 cycle이 가장 적당한 것으로 u타났으며 (data not 아iown), 최종 cycle의 extension 시간을 5분으로 했을 경우엔 증폭산물의 band가 불안정하여 10분내에 사라지는것 이 관찰되 었으u 최 종 cycle 의 extension 시간을 10분으로 연장하였을 때 증폭산물의 band가 안정하여지는 것을 확인할 수 있었다(data not shown). 또한 민감도는배양하지 않은 0시간에서 2.
- 또한, 본 연구에서는 최종 cycle의 extension time 을 5분으로 하였을 때 PCR product?} 매우 불안정하여겔 상에서 band가 존재하다가 없어지는 현상이 관찰되었는데 이러한 현상은 PCR 최종 cycle의 extension time 을 10분으로 하여 안정화시킬 수 있었는데 이는 소고기의 조직 내의 어떤 물질이 Thg polymerase의 효율을 떨어뜨린 것으로 생각되어진다. 따라서 최종 extension 반응시간을 연장하여 Tag polymerase가 충분히 반응하도록 했을 때 증폭산물이 안정화되는 것으로 u타났다. 앞으로 Taq polymerase보다 우수한 polymerase를 사용할 경우 tailing의 제au PCR 산물이 더욱 안정화되어 보다좋은 검출효능을 보일 수 있을 것으로 예상되어진다.
- 3). 또한 PCR 수행의 반복이 민감도를 높이는지의 영향을 조사하기 위하여 20 cycle PCR을 행한 product에서 2 UL 를 취해 한번 더 PCR을 각각 10, 15, 20 cycle PCR을 실시한 결과 반복 PCR을 수행할 때 10 cycle로 한 경우는 기존의 보고된 40 cycle로 한번만 PCR한 경 우보다 10배 민감도가 증가하였고 15와 20 cycle로 했을 때는 100배 증가하였으며 10과 15 cycle한 경우는 깨끗한 band가 관찰되 었고 20 cycle에서 는 tailing0] 관찰되어 반복 PCR을 행할 경우 15 cycle이 적당한 것으로 확인되었으며 그 결과 102 cell까지 검출이 가능했다.
- 사용하고 denaturation time을 4분으로 하여 PCR 분석을 한 결과 총 20 cycle부터 증폭산물이 생겼으며 30 cycle이 넘으면 tailing 현상이 증가하였다. 또한 cycle을 35-40 cycle로 했을 경우는 tailing0] 심 하였으u 24 cycle로 증폭된 PCR products의 1 를 사용하여 다시 한번 10 cycle로 PCR을 수행한 결과 1차 PCR amplification에서는 관찰되어지지 않은 lane에서도 모두 증폭산물이 관찰되어 민감도를 높일 수 있는 것으로확인되 었다. 이는 Thomas 등(16)이 10mL의 우유와 LEB 증균배지 90 mL를 혼합하여 증균하지 않고 직접 PCR 검 색하였을 때 PCR products를 확인할 수 없었던 결과와비교하여 생각할 때 매우 높은 민감도라 할 수 있다.
- PCR 특이성 실험 에서는 L monocytogenes 20주에 대한 PCR 분석 결과 모두 713 bp 크기의 PCR products 확인할 수 있었고, Listeria spp. 및 다른 세균에서는 동일한 poducts가 증폭되 지 않으므로써 hlyA based primer 의 L. monocytogenese 대한 PCR 특이성이 관찰되었다. PCR 분석법의 민감도는 L.
- 본 실험에서 사용한 hlyA gene을 이용한 ELMHLYF 및 ELMHLYR primei는 균주에 대한 민감도가 PCR cycle 수가 40이 었을 때 25 x IO으로 u타났었으u 민감도를 개선하기 위하여 PCR cycle 수를 24 cycle로 변화시켰을 때 IXICP cell로 u타내었으며 1차 PCR을 행한것을 2차 PCR을 행했을 때 우유에서 2 cell 수준까지 민감도를 높일 수 있었다. 이는 Thomas 등(16)이 민감도를개선하기 위하여 cycle 횟수를 늘리는 방향으로 변화시키는 것이 바람직하다고 한 결과와 일치하였다.
- 본 실험에서 쇠고기에서의 L. monocytogenes PCR 검 출은 우유에서 의 검 출과 비교하여 낮은 민감도를 보였다. 이는 Fitter 등(38)에 의한 닭고기 의 지 방함량이 많고 처리 과정에 따라서 타세균이 오염되어 PCR에 비특이적 반응을 u타낼 수 있다는 것을 생각할 때 쇠고기의 지방, 단백질 또는 쇠 고기 를 균질화하기 위해 마쇄 하는 과정 에서 쇠 고기 조직 내의 성 분 유출과 혈 액 들이 PCR inhibitor 로 작용하는 것이라 생각되어진다.
- Wang 등(15)은 DNA template/]- 열추출물일 경우 PCR cycle 에서 denaturation 시간을 95℃에서 3분간만 하는 것이 denaturation과 Taq polymerase의 역가가 저하되는 것을 막을 수 있다고 하였고 DNA template가 열추출이아닐 경우는 첫 cycle에서 denaturation time을 6~7분으로해야 한다고 하였다. 본 실험에서 식품으로부터 L mono-0s의 검출을 위하여 DNA 추출을 행하지 않고원심분리를 통한 세척과정만으로 PCR 억제제를 제거할수 있었으며 Wang 등(15)의 논문을 참고하여 첫 deneturation 시간을 4분으로 함으로써 cell이 충분히 lysate 됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 Shin 등(37)이세포 현탁액을 직접 PCR을 위한 DNA 주형으로 사용하여 좋은 결과를 얻은 것과도 일치하였다.
- 따라서 쇠고기 와 같은식육시료에서 더욱 높은 민감도를 u타내기 위해서는 마쇄하는 방법보다는 진탕법을 통하여 시료에 붙어 있는 cell을 buffer로 떼어낸 후 집균하여 PCR을 행하au 증균후 PCR 을 행하는것이 효과적이라할 수 있다. 본실험에서 1 mL를 원심 집균하였을 때 2.6x10s5까지 관찰이가능하였으므로 실제로 식품내의 균의 유무를 관찰할 때 100 mL를 원심 집균하여 이를 12~24시간 증균하여 PCR을 수행한다면 쇠고기 식 품에서 의 inhibitor가 되는조직도 제거할 수 있고 증균을 통해 확실한 균의 검출이가능함을 알 수 있었다. Wang 등(15)은 식육시료와 University of Vermont broth(UVM) 증균배지를 혼합하여 직접 PCR로 분석했을 때 배지성분의 어떤 형광기질이 90-140 bp에 해당하는 지점에 u타났다고 보고하였는데 본 실험실에서도 UVM 증균배지와 Fraser broth 증균배지에서 이러한 형광 기질이 발견되었으u 전기영동겔 상에서 시간이 지u면 사라지는 것을 알 수 있었다.
- templatee. 사용하고 denaturation time을 4분으로 하여 PCR 분석을 한 결과 총 20 cycle부터 증폭산물이 생겼으며 30 cycle이 넘으면 tailing 현상이 증가하였다. 또한 cycle을 35-40 cycle로 했을 경우는 tailing0] 심 하였으u 24 cycle로 증폭된 PCR products의 1 를 사용하여 다시 한번 10 cycle로 PCR을 수행한 결과 1차 PCR amplification에서는 관찰되어지지 않은 lane에서도 모두 증폭산물이 관찰되어 민감도를 높일 수 있는 것으로확인되 었다.
- 쇠고기로부터 L. monocytogenese: 배 양하지 않고 직접 검출한 경우 쇠고기에 의해 PCR 증폭이 많이 억제되어 tailing 현상도 심하여 증폭산물이 확인되지 않았다. 따라서 최적 cycle을 찾기 위해 cycle 수를 변화시 킨 결과 30 cycle이 가장 적당한 것으로 u타났으며 (data not 아iown), 최종 cycle의 extension 시간을 5분으로 했을 경우엔 증폭산물의 band가 불안정하여 10분내에 사라지는것 이 관찰되 었으u 최 종 cycle 의 extension 시간을 10분으로 연장하였을 때 증폭산물의 band가 안정하여지는 것을 확인할 수 있었다(data not shown).
- 이 상의 결과를 종합하여 볼 때 본 연구에서 hlyA gene 을 이용한 primer를 사용하여 L. monocytogenese: 검출하는 PCR 분석 시 기 존에 보고된 PCR 40 cycle의 결과(35)보다는 20~30 cycle로 PCR을 수행함으로써 더 깨끗한 products의 band를 관찰할 수 있었으며 우유에서 L. monocytogenes를 검출할 경우엔 이 H/yA를 이용한 primer를 이용한 PCR 기 법 이 증균을 하지 않고도 2 cell 까지 검 출할 수 있는 신속하며 효율이 높은 방법으로 사료되 며 , 쇠고기 에서 L. monocytogenese- 검 출할 경우엔낮은 민감도를 보완하기 위하여 12~24시간의 증균과정을 거친 후 PCR을 수행하여야 할 것으로 사료된다. 즉같은 primer를 사용한 PCR 기법이라도 식품에 따라 민감도가 다르기 때문에 cycle time과 cycle 횟수를 다르게하여 PCR을 수행하여야 할 것으로 사료되며 이러한 기초자료가 많이 축적되어 식품에 따라 가장 적절한 PCR 기법이 수립되어 식품에서의 L.
- 5A). 이를 개선하기 위하여 PCR cycle 수를 변화시 킨 결과 24~26 cycle 수로 수행했을 경우 tailing이 없는 깨끗한 PCR 산물을 얻을 수 있었으며 Fig. 5B에서 보는 것과 같이 24 cycle로 1차 PCR을 행한 경우는 215까지 검출이 가능하였으며, 1차 PCR products를 DNA template로 하여 다시 2차 PCR을 10 cycle 수로 수행 했을 때 2 cell 수준까지 검출할 수 있는 높은 민감도를 u타내었다(Fig. 5C).
- Tailing의 제거와 민감도를 높이기 위하여 PCR cycle 수에 따른 최적조건을 조사한 결과 20~30 cycle 정도의 PCR clcyle 수가 좋은 것으로 나타났으며 민감도는 20 cycle PCR amplification을 행한 후 한번더 10~15 cycle로 처리했을 때 훨씬 증가하였다. 한편, 우유(10 mL)와 쇠고기 절편(10 g)에 0~ WCFU/mL 또는 g 수준으로 L. monocytogenese- 신속하게 검출하기 위 하여 PCR을 적용한 결과, 우유시 료에서 는 2번 PCR을 반복함으로써 2 cells까지 검 출할 수 있었고, 쇠고기 절편은 LEB로 35℃에서 24시간 증균하여 PCR함으로써 2.6 x W2 cell까지 검출할 수 있었다.
후속연구
- 따라서 최종 extension 반응시간을 연장하여 Tag polymerase가 충분히 반응하도록 했을 때 증폭산물이 안정화되는 것으로 u타났다. 앞으로 Taq polymerase보다 우수한 polymerase를 사용할 경우 tailing의 제au PCR 산물이 더욱 안정화되어 보다좋은 검출효능을 보일 수 있을 것으로 예상되어진다.
- monocytogenese- 검 출할 경우엔낮은 민감도를 보완하기 위하여 12~24시간의 증균과정을 거친 후 PCR을 수행하여야 할 것으로 사료된다. 즉같은 primer를 사용한 PCR 기법이라도 식품에 따라 민감도가 다르기 때문에 cycle time과 cycle 횟수를 다르게하여 PCR을 수행하여야 할 것으로 사료되며 이러한 기초자료가 많이 축적되어 식품에 따라 가장 적절한 PCR 기법이 수립되어 식품에서의 L. monocytogenese 빠르고 민감한 검출방법이 확립되어야 할 것이다.
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