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문제 정의
- 프로안토시아니딘은 ( + )-카테킨이나 (-)- 에피카테킨과 같은 플라반-3-올 형태의 화합물이 C厂以 혹 은 CHM 결합에 의해 연결되어 있는 다량체 형태의 화합물 인 데 (14) 차 엽 에 함유된 카테 킨 성 분의 김 치 발효 관련 미 생 물에 대한 증식 억 제효과가 보고되 었고(15), Sakanaka 등이 카테 킨류의 세균 및 효모에 대한 생육억제 효과를 보고하기 도 하였다(16). 이와 같이 플라반-3-올 형태의 폴리페놀 화 합물 군이 나타내는 항균 활성이 기대되어짐에 따라 본 연구 에서는 프로안토시아니딘이 함유된 포도종실 에탄올 추출물 과 순차 용매 분획 물의 항균 활성 을 살펴 보고 천연 식품보존 제로의 사용 가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- Chung과 Yoon(20)의 방법 에 따라 각각의 용매 분획물 0.3 g을 증류수 10 mL로 용해 시 킨 후 메 탄올로 활성 화된 C18 카 트리지에 흡착시키고 에틸아세테이트 및 메탄올로 용출하여 카테킨의 단량체-이량체 분획(FI)과 올리고량체 분획(FII) 및 다량체 분획 (Fill) 등의 세 가지 그룹으로 분리 하였다.
- 각각의 검 정용 균주에서 1 백금이를 취하여 10mL의 해당 액체 배지에 접종한 후, 균주 별 최적 배양 온도에서 24〜48 시 간 동안 배양하였다. 각 균주 배 양액 0.1 mL과 막여 과지 (0.2 Um)로 제균된 시료를 일정 농도로 해당 배지 10 mL에 다시 접종시켜 72시 간 동안 배양하면서 12시간 간격으로 배 양액의 혼탁정도를 측정하여 각 시료의 균주별 증식 억제 효 과를 비교하였다. 또한 시 료를 용해 시 킨 용매의 영 향을 배 제 하기 위 하여 시료의 용해 에 사용한 용매 만을 동일량 첨 가한 공시험구를 설정하였다.
- 85% 생리식 염수(50 HL)를 부착된 디스크에 확산시켰다. 그 후 균주 최적배양온도에서 24'싶8시간 배양하여 디스크 주위에 형성된 생육저해환(clear zone diameter, mm)의 크기로 항균력의 정도를 측정하였다.
- 2 Um)로 제균된 시료를 일정 농도로 해당 배지 10 mL에 다시 접종시켜 72시 간 동안 배양하면서 12시간 간격으로 배 양액의 혼탁정도를 측정하여 각 시료의 균주별 증식 억제 효 과를 비교하였다. 또한 시 료를 용해 시 킨 용매의 영 향을 배 제 하기 위 하여 시료의 용해 에 사용한 용매 만을 동일량 첨 가한 공시험구를 설정하였다.
- 75%의 한천을 함유한 배지를 45°C 정도로 냉각시 킨 다음 균 배양액과 포자현탁액을 혼합하고 미리 조제된 한천 배양기(NA, PDA”] 도말하였다. 막여과지(0.2 岫)로 제균 된 시료는 100 UL씩 멸균된 8 mm 페이퍼디스크에 확산시키 고 자외 선 하에서 30분간 건조시 킨 후 균이 접종된 한천 배양 기 표면에 부착시 켰으며 이 때 0.85% 생리식 염수(50 HL)를 부착된 디스크에 확산시켰다. 그 후 균주 최적배양온도에서 24'싶8시간 배양하여 디스크 주위에 형성된 생육저해환(clear zone diameter, mm)의 크기로 항균력의 정도를 측정하였다.
- 헥 산 분획 후 남은 하층부를 클로로포름 350 mL 로 3회 주줄하고 농축하여 클로로포름 분획 물로 하였다. 에 틸아세테이 트와 부탄올을 사용하여 동일한 방법으로 에틸아 세테이트 분획물과 부탄올 분획물을 얻었으며 최종적으로 부 탄올 분획물을 얻은 후 남은 하층부를 수층 분획물로 하였다. 각 순차 용매 분획물은 건물량 기준으로 수율을 측정한 후 식품 첨가물 공전의 방법 에 따라(19) 카테킨 함량을 구하고 항균 활성 측정 시료로 사용하였다.
- 항균 활성을 검색하기 위한 검정균은 종균협회에서 분양 받은 식중독 관련 균주와 부패 에 관여하는 미 생물을 대상으 로 하였으며 Table 1의 해당 배지를 이용하여 세균은 37°C 또는 27°C에서 24시 간 동안, 효모는 30°C에서 48시 간 동안 배양하여 실험에 사용할 균주 배양액으로 하였다. 항균력 측 정은 0.
- coli ATCC 25922와 효모 2종에 대해서는 항균 효과를 확인하기 어려웠 다. 항균 효과가 확인된 실험구의 양상을 살펴보면 저 해 효과가 나타난 최 저 농도에서 부터 농도가 증가할수록 저 해환의 직경이 증가하여 농도의 존형 태의 효과가 나타남에 따라 포 도종실 에탄올 추출물의 항균 효과를 액 체 배양기 에서 확인 하기 위하여 50, 100 ppm의 농도로 액 체 배지 에 접종하여 각 균주의 증식 상태를 관찰하였다. 그 결과 일부의 실험 균주에 대하여 포도종실 에탄올 추출물의 균 증식 억 제능이 확인되 었는데 , B.
이론/모형
- 에 틸아세테이 트와 부탄올을 사용하여 동일한 방법으로 에틸아 세테이트 분획물과 부탄올 분획물을 얻었으며 최종적으로 부 탄올 분획물을 얻은 후 남은 하층부를 수층 분획물로 하였다. 각 순차 용매 분획물은 건물량 기준으로 수율을 측정한 후 식품 첨가물 공전의 방법 에 따라(19) 카테킨 함량을 구하고 항균 활성 측정 시료로 사용하였다.
- 포도종실 에탄올 추출물은 Chung 등(17, 18)의 공정 에 따 라 제조하여 보관하며 사용하였다. 이 외에 실험에 사용한 모 든 시약 및 표준품은 Sigma Chemical Co.
성능/효과
- c湖에 대한 생육저 해 활성을 확인할 수 있었다. P. aruginosa IFO 3080 에 대해서는 에틸아세테이트 분획물이 12시간 이후부터 72 시간까지 증식 저 해 효과를 나타내었으며 부탄올 분획이 첨 가된 처 리구에서는 간헐적 인 저 해효과를 관찰할 수 있었다.
- typhimurium에 대 해 다소 낮은 항균 활성 을 나타낸 것 과 유사 한 경 향을 나타내 었다(21). Roh 등(2D은 녹차 물추출물의 경 우에 500 ppm 첨 가 수준에 서 B. subtilis ATCC 9372와 B. cereus, S. aureus ATCC 6538에 대 해 생육을 저 해 함을 확인 하였는데 이는 녹차 성분 중 카테킨류에 의하여 시험균의 대 사과정에 관여하는 효소의 활성이 저해됨에 따른 것이라고 하여 포도종실 에탄올 추출물에서도 그 효과가 카테 킨류의 화 합물군에 의한 것임을 예측할 수 있었다. 또한 Wee와 Park(15)은 김 치 산패 에 관련 된 미 생 물의 생육을 억 제 하는 물질 로서 차엽 카테 킨을 검 토하였는데 L.
- 이는 액체 배양액에 첨가된 헥산 분획물의 작용이 극성의 차이로 인하여 배양액에 용이하게 미치지 못함인 것으로 예 측되었다. Table 3의 페이퍼 디스크 실험 에 따른 항균 활성 측정 결과에서 보면 부탄올 분획물이 시험 균주에 대해 전 농도 구간에서 고른 항균활성 을 나타내 었으며 에틸아세테 이 트 분획 물의 활성 이 나타나지 않았던 E. coli ATCC 25922에 대해서도 뚜렷한 효과를 나타내었다. 또한 액체 배양에서도 부탄올 분획물은 페이퍼 디스크 실험 결과에서와 같이 에틸 아세테이트 분획물에 비해 상대적으로 뚜렷한 항균활성을 나타내었다.
- Sal. enteritidis IFO 3318에 대 해서 는 36시 간 이 후부터 에 틸 아세테이트 분획물과 부탄올 분획물의 첨가구에서 증식 저 해를 확인할 수 있었다. 반면에 헥산 분획물은 각 균주에 대한 저해 효과가 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물의 첨 가구에 비하여 뚜렷하게 나타나지 않았다.
- plantarum, Leuc. me~ senteroids, P. cereuisiae에 대 하여 2, 000 ppm 첨 가 수준부 터 현저히 균의 생육을 억제하였지만 김치숙성 중 향미 성분 에 관여하는 S. cereuisiae에 대해서는 생육억제 효과가 낮 아 포도종실 에탄올 추출물에 함유된 카테킨류의 화합물이 효모인 S. cerevisiae'A Candida albicans에 대해서는 항균 효과가 적음을 알 수 있었다. 녹차 물추출물이 쌀밥 부패미 생물로 동정된 B.
- 항균 효과가 확인된 실험구의 양상을 살펴보면 저 해 효과가 나타난 최 저 농도에서 부터 농도가 증가할수록 저 해환의 직경이 증가하여 농도의 존형 태의 효과가 나타남에 따라 포 도종실 에탄올 추출물의 항균 효과를 액 체 배양기 에서 확인 하기 위하여 50, 100 ppm의 농도로 액 체 배지 에 접종하여 각 균주의 증식 상태를 관찰하였다. 그 결과 일부의 실험 균주에 대하여 포도종실 에탄올 추출물의 균 증식 억 제능이 확인되 었는데 , B. subtilis ATCC 9372에 대 해 50 ppm의 첨 가구에 서 도 생 육 저 해 효과가 나타났으며 100 ppm 농도의 첨 가 수준 에서는 증식이 상당히 억제되는 것을 알 수 있었다(Fig. 1A). S.
- 부탄올 분획물은 에틸아세테이트 분획 물에 비하여 카테킨의 절대 함량은 적었지만 C18 카트리지 로 소분획하였을 때 고분자체 중심의 폴리 페놀 화합물로 구 성되어 있음을 알 수 있었다. 따라서 포도종실 에탄올 추출물 의 항균 활성 은 카테 킨과 같은 플라반-3 올 화합물의 절대 함량과 더불어 플라반 3-올 화합물의 중합도가 관계하는 것으로 예측되었다.
- 3의 조성 으로 이 루 어져 있어 고분자체 중심으로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 따라서 포도종실 에탄올 추출물의 항균 활성은 카테 킨과 같 은 플라반-3―올 화합물의 함량과 더불어 플라반-3-올 화합 물의 중합도가 관계 하는 것으로 예측되 었다. 즉 부탄올 분획 물에는 에틸아세테이트 분획물보다 카테킨과 같은 플라반 -3-올 단량체 화합물의 절대 함량이 적지만 다량체 형태로 존재하는 플라반-3-올 화합물이 많음으로 인해 에틸아세테 이 트 분획 물과 대등하거나 강한 항균활성 을 나타내는 것으 로 예측되었다.
- coli ATCC 25922에 대해서도 뚜렷한 효과를 나타내었다. 또한 액체 배양에서도 부탄올 분획물은 페이퍼 디스크 실험 결과에서와 같이 에틸 아세테이트 분획물에 비해 상대적으로 뚜렷한 항균활성을 나타내었다. 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물의 항 균활성은 플라반-3-올 형 태의 폴리 페놀 화합물 군에 의한 것으로 예측되는데 각 분획물의 카테킨 함량 측정 결고!, 헥 산, 클로로포름 분획물에는 카테킨이 거의 없었고, 에틸아세
- coli ATCC 25922 에 대해서는 뚜렷한 항균 효과를 확인하기 어려웠다. 또한 포도종실 에탄올 추출물의 순차 용매 분획 물 중에서 에틸아 세 테 이 트 분획 과 부탄올 분획 물만이 각각 35.7 mg/g과 20.2 mg/g의 카테킨을 함유하고 있었는데 에틸아세테이트 분획 에 비 하여 부탄올 분획 물이 각 검 정 균주에 대 해 뚜렷한 항균 활성을 나타내었다. 부탄올 분획물은 에틸아세테이트 분획 물에 비하여 카테킨의 절대 함량은 적었지만 C18 카트리지 로 소분획하였을 때 고분자체 중심의 폴리 페놀 화합물로 구 성되어 있음을 알 수 있었다.
- 2 mg/g의 카테킨을 함유하고 있었는데 에틸아세테이트 분획 에 비 하여 부탄올 분획 물이 각 검 정 균주에 대 해 뚜렷한 항균 활성을 나타내었다. 부탄올 분획물은 에틸아세테이트 분획 물에 비하여 카테킨의 절대 함량은 적었지만 C18 카트리지 로 소분획하였을 때 고분자체 중심의 폴리 페놀 화합물로 구 성되어 있음을 알 수 있었다. 따라서 포도종실 에탄올 추출물 의 항균 활성 은 카테 킨과 같은 플라반-3 올 화합물의 절대 함량과 더불어 플라반 3-올 화합물의 중합도가 관계하는 것으로 예측되었다.
- 1--E). 이상의 실험 결과에서 포도종실 에탄올 추출물은 B. subtilis ATCC 9372오卜 S. aureus ATCC 6538에 대해 증 식 억 제 효과가 나타났으며 그 효과는 농도 의존적 이 었던 반 면에 Sal. enfeM拔赤 IFO 3313에 대하여 제 한적 인 증식 억 제 효과를 나타내어 카테킨이 함유된 녹차 물추출물이 Sal.
- 따라서 포도종실 에탄올 추출물의 항균 활성은 카테 킨과 같 은 플라반-3―올 화합물의 함량과 더불어 플라반-3-올 화합 물의 중합도가 관계 하는 것으로 예측되 었다. 즉 부탄올 분획 물에는 에틸아세테이트 분획물보다 카테킨과 같은 플라반 -3-올 단량체 화합물의 절대 함량이 적지만 다량체 형태로 존재하는 플라반-3-올 화합물이 많음으로 인해 에틸아세테 이 트 분획 물과 대등하거나 강한 항균활성 을 나타내는 것으 로 예측되었다.
- Table 3에서 보 면 클로로포름 층을 제외한 모든 분획물에서 각 균주간 감수 성의 차이는 있지만 항균활성을 확인할 수 있었다. 항균활성 이 나타난 각 분획 물을 살펴 보면 헥 산 분획 에서 는 주로 유기 산과 저급 지 방산류에 의한 효과로 예측되 며 에 틸아세테이 트 분획과 부탄올 분획에서는 용매의 극성이 증가함에 따라 항균활성이 뚜렷이 확인되어 항균력을 나타내는 물질이 극 성 용매에 친화력이 있음을 알 수 있었다. 포도종실 에탄올 추출물의 순차 용매 분획 물 중에서 항균활성을 나타내었던 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물을 각 균주의 액 체 배 양액 에 첨 가하여 나타난 결과는-Fig 2와 같았다.
후속연구
- aureus ATCC 6538과 같은 균주에 대 해 상대 적 으로 낮은 농도에서 뚜렷한 항균활성을 나타낸 것은 녹차에 함유된 카테킨과 같 은 플라반-3-올의 단량체 형태의 화합물과 포도종실 에탄올 추출물에 함유된 탄닌과 같은 플라반-3-올의 다량체 형 태의 화합물군의 항균 활성의 차이 에 있는 것으로 예측되었다. 현재 까지 그람양성 및 그람음성 세균 모두에 대하여 항균력이 보고된 대부분의 생 약재들은 가공 식품의 원료로 사용에 제 한이 있거나 1, 000 Ug/mL 이상의 고농도에서 검 색 균주에 대한 생육저해를 나타내어(22, 23) 실질적으로 천연 식품보존 제로 사용하는 경우에 식품의 색, 맛, 향 등과 같은 관능적 특성 을 변화시킬 수 있으므로 식물추출물을 천연 식품보존제로 사용하기 위 해서는 폭넓은 항균 활성도 중요하지 만 이와 더 불어 적 정 량의 사용으로 효과가 나타나 적 용 대 상 식 품의 관능 적 특성 변화가 최소화될 수 있도록 하는 점도 중요할 것으 로 생각된다. 이러한 측면에서 볼 때 C botulinum을 포함한 몇 종류의 식중독 원인세균에 대해 항균활성을 갖는 녹차 폴 리페놀과 같이(24) 포도종실 에탄올 추출물은 일부의 검색균 주에 대하여 만 항균력이 나타났지 만 상대적으로 저농도인 50 Ug/mL에서부터 항균력이 확인되었으며 또한 생약재에 비하여 저렴한 가격경쟁력과 기 보고된 항산화 특성 등에 의 해 천연 식품보존제로서 검토될 수 있을 것으로 기대된다.
- 현재 까지 그람양성 및 그람음성 세균 모두에 대하여 항균력이 보고된 대부분의 생 약재들은 가공 식품의 원료로 사용에 제 한이 있거나 1, 000 Ug/mL 이상의 고농도에서 검 색 균주에 대한 생육저해를 나타내어(22, 23) 실질적으로 천연 식품보존 제로 사용하는 경우에 식품의 색, 맛, 향 등과 같은 관능적 특성 을 변화시킬 수 있으므로 식물추출물을 천연 식품보존제로 사용하기 위 해서는 폭넓은 항균 활성도 중요하지 만 이와 더 불어 적 정 량의 사용으로 효과가 나타나 적 용 대 상 식 품의 관능 적 특성 변화가 최소화될 수 있도록 하는 점도 중요할 것으 로 생각된다. 이러한 측면에서 볼 때 C botulinum을 포함한 몇 종류의 식중독 원인세균에 대해 항균활성을 갖는 녹차 폴 리페놀과 같이(24) 포도종실 에탄올 추출물은 일부의 검색균 주에 대하여 만 항균력이 나타났지 만 상대적으로 저농도인 50 Ug/mL에서부터 항균력이 확인되었으며 또한 생약재에 비하여 저렴한 가격경쟁력과 기 보고된 항산화 특성 등에 의 해 천연 식품보존제로서 검토될 수 있을 것으로 기대된다.
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